抗血管新生融合蛋白的製作方法

2023-05-14 06:08:56

專利名稱：抗血管新生融合蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體說地涉及抑制血管新生的重組DNA序列、該 DNA序列表達的融合蛋白及其在病理性血管新生疾病治療藥物中的應用。
背景技術：
在正常情況下，成人體內的血管絕大多數處於靜止狀態，血管新生只見於少數病 理或生理狀態。生理狀態僅發生於創傷修復，組織再生和婦女的生理周期。病理情況發生 於腫瘤，類風溼性關節炎，糖尿病性視網膜病和乾癬，年齡相關的黃斑變性(AMD)。腫瘤血管 新生是腫瘤生長和轉移的「命脈」。(Hanahanand Folkman，Cell，1996，86 :353_364)。近年 來，抗血管新生治療成為腫瘤等疾病治療的熱點和最有前途的領域。血管生成由多個血管生成促進因子和抑制因子組成的複雜系統調節，成人的血 管生成嚴格受此促進和抑制平衡調節。VEGF對血管內皮細胞基膜的水解、遷移和血管 構建的調節作用強，特異性高，是目前發現的主要特異促血管生成因子。(Folkman J, et al.Sciencel987 ；235 442 ；Giampietro G, etal. Cancer Metastassis Rev 1994 ；Ferrara. Endocrine Reviews2004, 25 (4) :581_611)因此，針對VEGF信號通路的抗血管新生治療成 為抗腫瘤和類風溼性關節炎等疾病的重要治療靶點。VEGF受體有 3種，flt-l(fms-like tyrosine kinase, VEGFR-1) ,Flk-l/KDR(fetal liver kinase 1-murine homologue/Kinase insert Domain containingReceptor-human homologue, VEGFR-2)和 flt_4 (VEGFR-3)。VEGFR-1，2，主要分布於血管內皮細胞表面， VEGFR-3主要分布於淋巴內皮。他們由含7個免疫球蛋白樣結構的細胞外區、膜區及酪氨酸 激酶區組成。該酪氨酸激酶的活性通過受體和配體結合而激活，由受體磷酸化而引起細胞 內許多酶和其他反應。其中Flk-l(KDR)在內皮細胞的增殖和血管生成起決定作用。通過抗VEGF抗體和可溶性VEGF受體片斷可以阻斷VEGF與血管內皮細胞上VEGF 受體(flt-1，KDR等)之間的相互作用，從而阻止由VEGF介導的信息傳導，抑制由VEGF 高表達而引起的病理性新生血管的生長。這類VEGF抑制劑包括Avastir^bevacizumab)， Lucentis, VEGF-Trap等，用於治療血管新生相關的疾病。2004年美國FDA批准的針對 血管新生的抗癌藥物Avastin就是特異性結合VEGF的單克隆抗體，其機理就是通過結 合VEGF達到阻斷VEGF與其受體結合的目的(Ferrara et al，Nature Reviews Drug Discovery. 2004,3 =391-400)。但是 Avastin 有兩個主要缺點1.親和力較低 2. 3 * 10、 抗體用量大。2.沒有PLGF結合能力。因此，理想化的VEGF阻斷劑是VEGF受體的細胞外片段，其具有天然的針對VEGF 的高特異性禾口親禾口力(Kuo et al, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences, 2001,98 4605-4610),比 Avastin 的親禾口力高 20—100 倍(Ferrara N et al, Nature medicine. 2003,9 669-676) 0近年來的研究表明，抗PLGF可以抑制腫瘤的血管新生和轉 移，可以顯著增強抗VEGF的抗血管新生治療效果，並且可以抑制一些抗VEGF治療無效的腫 瘤生長(Fischer C. et al, cell,131 :463_475)。因此利用flt-1與PLGF也具有高親和力(Christinger, HW. Et al，J. Biol. Chem. 2004，279 (11) 10382-8)的特點，用含有 flt_l 受 體片段的融合蛋白可以結合VEGF和PLGF具有更加優良的抗血管新生治療效果。美國專利6100071，5952199等描述了幾種用Fit 1部分片段和KDR的部分片段融 合的蛋白，但由於其不穩定，副作用大，沒有進一步開發。雖然Fltl胞外區第2-3免疫球蛋 白結構域具有大部分的Fltl對VEGF和PLGF的結合活性，但是它的第三免疫球蛋白樣結構 域的成串鹼性胺基酸導致在體內的有效活性很低。因此本發明採用Fltl和KDR的其它部分 免疫球蛋白樣結構域與Fit 1第2免疫球蛋白結構域組合以保持融合蛋白的對VEGF和PLGF 的結合活性。此外，一些正在進行臨床試驗的藥物_如Regeneron公司VEGF trap-與VEGF 分子結合比例是1 1。本發明不僅保留了人VEGF受體Fltl (VEGFR I)和KDR(VEGFR II) 與VEGF的結合性能，及Fltl與PLGF的結合活性，而且由於兩個與VEGF結合的免疫球蛋白 結構域距離較遠，提供了雙價結合能力。

發明內容
本發明的目的在於提供一種用於抑制血管新生的融合蛋白，該融合蛋白包括(a) 編碼VEGF受體成分的胺基酸序列，該序列連接於(b)編碼一種多聚成分的胺基酸序列上， 形成(a)-(b)結構。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽的唯一的VEGF受體成分；所 述多聚成分通常為免疫球蛋白Fc片段。本發明的另一目的在於提供所述的融合蛋白的用途及組合物。在本發明的第一方面，提供一種融合蛋白，即VEGF結合物SR1-3，它們包括(a)編 碼VEGF受體成分的胺基酸序列，該序列連接於(b)編碼一種多聚成分的胺基酸序列上，形 成(a)-(b)結構。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽的唯一的VEGF受體成分，與多 聚成分Fc多肽鏈結合，然後兩個Fc作為二聚體來提高體內的作用半衰期和生物活性。在一優選例中，所述融合蛋白SR1具有SEQ ID NO 6所述的胺基酸序列。在另一優選例中，所述的融合蛋白SR2具有SEQ ID NO 7所述的胺基酸序列。在另一優選例中，所述的融合蛋白SR3具有SEQ ID NO 8所示的胺基酸序列。在本發明的第二方面，提供一種核酸分子，所述的核酸分子編碼SEQ IDN0 :6_8所 述的融合蛋白SR1-3。在一優選例中，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :6所述的胺基酸序列的融合蛋 白 SR1。在另一優選例中，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :7所述的胺基酸序列的融合 蛋白SR2。在另一優選例中，所述核酸分子編碼具有SEQ ID NO :8所述的胺基酸序列的融合 蛋白SR3。在本發明的第三方面，提供一種載體，它含有所述的核酸分子。在一優選例中，所述的載體是pcDNA3. 1表達載體。在本發明的第四方面，提供一種基因工程化的細胞，所述的細胞含有所述的載體；或所述的細胞基因組中整合有所述的核酸分子。在本發明的第五方面，提供一種產生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括在適合表達所述融合蛋白的條件下，培養所述的宿主細胞，表達和分離出所述的融合蛋白。在本發明的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用於製備治療或預防血管新 生或者VEGF相關疾病的組合物。在一優選例中，所述的組合物用於治療或預防血管新生或者VEGF相關疾病。在另一優選例中，所述的VEGF相關疾病包括各種實體腫瘤，AMD，關節炎，等等。在本發明的第七方面，提供一種特異性結合VEGF的組合物，所述的組合物含有(i)有效量的所述的融合蛋白；(ii)其它VEGF拮抗劑；(iii)藥學上可接受的載體。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1. Fit 1胞外區胺基酸序列圖2 :KDR胞外區胺基酸序列圖3 融合蛋白SR1-3結構示意圖
具體實施例方式本發明人經過研究，意外地發現將VEGF受體的部分胺基酸序列與多聚成分如人 免疫球蛋白的Fc片段相融合，獲得的融合蛋白具有極其優異的結合VEGF的效果，且穩定性 好、半衰期長，可多價結合VEGF分子。如本文所用，除非另外說明，Fltl，flt-1，VEGFR-1可互換使用，都指第一種VEGF 受體。如本文所用，除非另外說明，Flk-1，KDR或VEGFR-2可互換使用，都指第二種VEGF 受體。如本文所用，所述的「含有」，「具有」或「包括」包括了「包含」、「主要由......構
成」、「基本上由......構成」、和「由......構成」；「主要由......構成」、「基本上
由......構成」和「由......構成」屬於「含有」、「具有」或「包括」的下位概念。如本文所用，除非另外說明，所述的融合蛋白是一種分離的蛋白，與其它蛋白、多 肽或分子無聯繫，是重組宿主細胞培養的純化產物或作為一種純化的提取物。本發明的目的在於提供三種用於抑制血管新生的VEGF結合物SR1-3。它們包括 (a)編碼VEGF受體成分的胺基酸序列，該序列連接於(b)編碼一種多聚成分的胺基酸序列 上，形成(a)-(b)結構。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽的唯一的VEGF受體成分， 該受體成分和Fc鏈結合，利用兩個Fc單鏈形成二聚體來提高體內的作用半衰期。SR1-3中的VEGF受體成分(a)分別具有以下三種結構SR1 由Fit 1的胞外結構域的第2免疫球蛋白樣區域，和KDR的胞外結構域的第 2和第3免疫球蛋白樣區域，融合而成FltlD2-KDRD2-KDRD3 ；SR2 由Fit 1的胞外結構域的第2免疫球蛋白樣區域，和KDR的胞外結構域的第 4免疫球蛋白樣區域融合而成FltlD2-KDRD4 ；
SR3:由Fit 1的胞外結構域的第2免疫球蛋白樣區域，和Fit 1胞外結構域的第4免疫球蛋白樣區域融合而成FltlD2-FltlD4 ；其中FltlD2代表Fltl胞外結構域的第2免疫球蛋白樣區域胺基酸序列，FltlD4 代表Fltl胞外結構域的第4免疫球蛋白樣區域胺基酸序列，KDRD2代表KDR胞外結構域的 第2免疫球蛋白樣區域胺基酸序列，KDRD3代表KDR胞外結構域的第3免疫球蛋白樣區域 胺基酸序列，KDRD4代表KDR胞外結構域的第4免疫球蛋白樣區域胺基酸序列。Fltl和KDR的各免疫球蛋白樣區域的胺基酸序列可以從公用資料庫獲得，由於 Fltl和KDR中各個免疫球蛋白樣區域的胺基酸序列之間並沒絕然的分界，因此各免疫球蛋 白樣區域的胺基酸序列的長度可以有一定的變化。所以，本發明所涉及的融合蛋白質的氨 基酸序列也可以有一定的變化。它們都屬於本發明保護的範圍。(b)編碼多聚成分的胺基酸序列，通常為但不限於人免疫球蛋白Fc序列，它們都 屬於本發明保護的範圍。其中的免疫球蛋白Fc片段選自人免疫球蛋白Fc如IgG，IgM，IgA 或亞型IgGl，IgG2，IgG3，IgG4。其中的免疫球蛋白Fc片段是Fc全長或是部分Fc序列，選 自CH2片斷，CH3片斷，絞鏈區域片段。研究表明，fltl的N端第2個免疫球蛋白樣區域fltlD2和KDR的N端第3個免 疫球蛋白樣區域KDRD3分別是fltl和KDR與VEGF結合的區。fltl的N端第3個免疫球 蛋白樣區域fltlD3，和KDR的N端第2個免疫球蛋白樣區域KDRD2分別對維持fltl和KDR 與VEGF結合的親和力具有非常重要的作用。在一個實施例中，本發明提供了一種結構利用由Fltl的胞外結構域的第2免疫球 蛋白樣區域，和KDR的胞外結構域的第2和第3免疫球蛋白樣區域融合，從而保證了融合蛋 白具有Fltl與VEGF和PLGF的結合親和力，並具有足夠的空間距離進行雙價結合。在另一個實施例中，本發明提供了一種結構利用由Fltl的胞外結構域的第4免疫 球蛋白樣區域，融合於Fltl的胞外結構域的第2免疫球蛋白樣區域從而保證了融合蛋白具 有Fltl與VEGF和PLGF的的結合親和力。在另一個實施例中，本發明提供了一種結構利用KDR的胞外結構域的第4免疫球 蛋白樣區域，融合於Fltl的胞外結構域的第2免疫球蛋白樣區域從而保證了融合蛋白具有 Fltl與VEGF和PLGF的的結合親和力。融合蛋白質的構建技術基於分子克隆方法，具體實驗方法可參考《分子克隆》第二 版和第三版等實驗手冊。編碼上述融合蛋白的DNA的獲得可以通過常規技術，如通過全基 因合成或分別從Fltl，KDR的片斷拼接形成。所用載體可以是分子生物學所常用的質粒載 體。各融合蛋白的氨基末端前加上蛋白分泌信號序列以保證蛋白質從細胞中分泌出來。載 體序列中包括用於驅動基因表達的啟動子，蛋白質翻譯起始和終止信號，以及多聚腺苷酸 ((PolyA)序列。載體中有抗菌素抗性基因以利於質粒在細菌中所繁殖。另外，載體中還包 括真核細胞選擇性基因用於穩定轉染細胞株的篩選。在完成上列各種融合蛋白的質粒構建以後，即可用質粒DNA轉染細胞，表達相應 的蛋白質。能夠用於表達這些融合蛋白的表達系統有多種，它們包括(但不限於)哺乳動 物細胞，細菌，酵母，昆蟲細胞，等等。從哺乳動物細胞所表達的蛋白質具有糖基修飾。由於 本發明的融合蛋白質的胺基酸序列中包括可糖基化的胺基酸，因此，哺乳動物細胞是表達 這些蛋白質的最佳細胞。可用於蛋白質大規模表達的哺乳動物細胞有多種，例如293細胞，CHO細胞，SP20細胞，NSO細胞，COS細胞，BHK細胞，PerC6細胞，等等。許多其他細胞也可用於這些蛋白質的表達和生產，因此都包括在本發明所能使用的細胞之列。編碼多肽的質粒可經轉染進入細胞。轉染方法包括(但不限於)電穿孔，脂質體 (liposome)介導等等。融合蛋白質表達後，可用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)或其他方法測 定細胞培養液中融合蛋白質的濃度。由於這些融合蛋白質具有免疫球蛋白Fc片斷，因此可 用蛋白A親和層析法提取所表達的融合蛋白質。由於本發明的各種融合蛋白質的基本作用是阻斷VEGF信號通路，因此這些融合 蛋白質可能應用於與血管新生或者VEGF相關的疾病。這些疾病可能包括(但不限於)各 種實體腫瘤，AMD，關節炎，等等。融合蛋白可以作為提取的重組蛋白質注射到病人體內。也 可以將融合蛋白DNA序列插入到適當的載體中，用基因治療或細胞治療的方法在病人體內 表達。所以，本發明所涉及的融合蛋白質的使用方法有多種形式，不僅包括蛋白質本身，也 包括編碼融合蛋白胺基酸序列的對應DNA序列。本發明還包括含有本發明融合蛋白的藥物組合物，組合物中可以含有藥物可接受 的載體。組合物可以以任何形式的藥物製劑形式存在，優選的是注射劑，最優選的是冷凍幹 燥注射劑。該藥物製劑形式藥物組合物，可以按照製劑學常規技術製備，包括將藥物活性成 分，本發明的融合蛋白與藥物載體混合，按照製劑學常規技術製成所需要的劑型。本發明的融合蛋白，特別優選的融合蛋白是SR1，與現有技術相比，優點明顯，具有 多價，副作用小的特點。實施例1 融合蛋白質及其質粒的構建。構建本發明的SR1-3融合蛋白的胺基酸序列來自Fltl (NP_002010)和 KDR(NP_002244) cDNA編碼區相應的胞外區免疫球蛋白域胺基酸序列，融合於人免疫球蛋白 IgGlFc (P01857,104-330)胺基酸序列，信號肽來自Fltl的信號肽序列(NP_002010 :1_26)。SR1-3的結構見圖3。SR1，2，3胺基酸序列分別見序列6，7，8。DNA序列分別通過基因合成和拼接的方式獲得，在兩端分別加上Xbal/Hindlll酶 切位點，克隆入pcDNA3. 1。實施例2 融合蛋白質在細胞中的表達和純化。本發明的組成部分之一是在在完成各質粒的構建以後，提取獲得高純度質粒DNA， 在瞬時轉染細胞中表達所構建的融合蛋白質。在蛋白質被純化後，遞藥給特定的動物模型 來證實生物學活性。然後將質粒轉染至穩定的CHO細胞用於生產。瞬時轉染表達首先用生長良好的CHOs細胞，在轉染的前一天以8女IOVcm2的密度用含10%胎 牛血清的DMEM培養基接種至6孔板或需要的平皿，第二天先將培養液換為optimem，然後以 0. 4ugDNA/cm2的量將質粒DNA與lipofectamine2000的複合物加入細胞培養液中。繼續培 養三天，然後收集上清液。用ELISA法定量測定上清液中表達的融合蛋白，用protein A柱 純化表達的少量融合蛋白。穩定轉染表達轉染同上。但是，在轉染第二天，將細胞用胰酶消化，用10%胎牛血清的DMEM培養 基以5女104/ml的密度分至96孔板，每孔lOOul，第三天加入G418。5天後換一次液，大約 14天後，挑取新酶素抗性單克隆，進行細胞的擴大培養。最後，細胞在發酵罐中培養生產融合多肽。實施例3 融合蛋白質體外活性測定
融合蛋白與VEGF和PLGF的結合能力分析本發明利用高特異性和高靈敏度的VEGF和PLGF ELISA定量檢測試劑盒來確定各 融合蛋白與VEGF和PLGF的親和力。實驗中，將不同濃度((^IjlOOOpM)的融合蛋白和40pM 的人VEGF或PLGF在室溫下相混合，37度2小時，或4度過夜後用VEGF或PLGF ELISA定量 檢測試劑盒檢測游離的VEGF或PLGF濃度。計算各融合蛋白的結合親和力。BIAcore分析SRl對VFGF 165的分子結合比例SRl融合蛋白被首先用胺偶聯化學方法固定在BIAcore晶片(BIAC0RE)上的抗Fc 專一性杭體所固定。用空白抗體表面作負對照，以10微升/分鐘的速度用1個小時將VEGF 165以InM，IOnM和50nM注射在融合蛋白的表面。記錄實時結合信號，並在每一次注射結束 時達到飽和結合。計算SRl融合蛋白對VEGF 165的分子結合比例。在溶液中，將濃度為InM的SRl融合蛋白與各種濃度的VEGF 165混合。在培養1小 時之後，以與胺結合的VEGF 165表面結合信號形式測定溶液中游離的融合蛋白的濃度.利 用校正曲線將BIAcore結合信號轉換成它的摩爾濃度。計算SRl融合蛋白對VEGF 165的 分子結合比例。內皮細胞生長分析選用生長良好的人臍帶靜脈內皮細胞懸液(Cambrex Bio Scienceffalkersville, Inc.)，調整細胞濃度為2. 5 X IO4個/ml，接種於96孔培養板(100 μ 1/孔)，生長培養液為 EGM基本培養基(Cambrex)，37°C 5% CO2培養至貼壁狀態，用含0. 2%明膠的PBS系列稀釋 純化的VEGF抑制劑待測樣品，加入抑制劑濃度為l-5000ng/ml，2-3小時後每孔加VEGF165 至終濃度3ng/ml，2-3天後，每孔加入10微升CCK-8溶液。在細胞培養箱內繼續孵育2小 時。以加了相應量細胞培養液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照，在 450nm測定吸光度，以650nm作為參考波長雙波長測定。實施例4 融合多肽抑制小鼠腫瘤的生長。將培養的人A673成橫紋肌細胞瘤細胞(ATCC;CRL 1598)懸浮於生理鹽水中。在 6-10周齡的雌性BLAB/c裸鼠背部區域皮下注射100微升體積、IX IO6個腫瘤細胞。在腫 瘤細胞接種開始後24小時，用融合蛋白或同劑量的提純人免疫球蛋白Fc注射動物。注射 劑量為每小鼠每次400微克，每周兩次。每組由10隻小鼠構成。每周測定腫瘤大小。在腫 瘤細胞接種4周後，動物被安樂死亡，然後取出腫瘤並稱量分析。序列表欣潤(上海)生物藥業有限公司抗血管新生融合蛋白8
1103PRT人工序列l(FltlD2)
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6534
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權利要求
一種抗血管新生融合蛋白，其特徵在於，包括(a)編碼VEGF受體成分的胺基酸序列，該序列連接於(b)編碼一種多聚成分的胺基酸序列上，形成(a)-(b)結構。其中，所述VEGF受體成分是這種融合多肽中唯一的VEGF受體成分；所述多聚成分通常為免疫球蛋白Fc片段。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於(a)編碼VEGF受體成分的多肽具有SEQ ID NO :6所述的胺基酸序列。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於(a)編碼VEGF受體成分的多肽具有SEQ ID NO :7所述的胺基酸序列。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於(a)編碼VEGF受體成分的多肽具有SEQ ID NO :8所述的胺基酸序列。
5.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於(b)編碼一種多聚成分的胺基酸序列可 為來源於人 IgG，IgM, IgA 或亞型 IgGl，IgG2，IgG3，IgG4 的 Fc 段。
6.如權利要求5所述的融合蛋白，其特徵在於(b)編碼一種多聚成分的胺基酸優選為 來源於人IgGl的Fc段。
7.—種核酸分子，其特徵在於，所述的核酸分子編碼權利要求1-6任一所述的融合蛋白。
8.—種產生權利要求1所述的融合蛋白的方法，其特徵在於，所述的方法包括在適合 表達所述融合蛋白的條件下，培養權利要求10所述的宿主細胞，表達和分離出所述的融合 蛋白。
9.權利要求1-6任一所述的融合蛋白的用途，其特徵在於，用於製備治療或預防血管 新生或者VEGF相關疾病的組合物。
10.一種用於製備治療或預防血管新生或者VEGF相關疾病的組合物，其特徵在於，所 述的組合物含有⑴有效量的權利要求1-6所述的融合蛋白；和/或 ( )其它VEGF拮抗劑；和/或 (iii)藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及了一種抗血管新生融合蛋白及其用途。本發明利用分子生物學、細胞生物學和免疫學技術，構建了幾種人VEGFR受體片斷與IgFc片斷的融合蛋白，可用於治療或預防血管新生或者VEGF相關疾病。該融合蛋白具有優良的VEGF及PLGF結合能力，且穩定性好、半衰期長，並可多價結合VEGF分子。
文檔編號A61K38/17GK101838329SQ20091005695
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月18日 優先權日2009年3月18日
發明者周新華, 孫九如, 趙建陽 申請人:嘉和生物藥業有限公司