犬瘟熱、犬細小病毒二重TaqManMGB螢光定量PCR檢測試劑及其檢測方法

2023-05-14 08:57:31

犬瘟熱、犬細小病毒二重TaqMan MGB螢光定量PCR檢測試劑及其檢測方法
【專利摘要】本發明屬動物疫病檢測檢疫【技術領域】，公開了一種用於犬瘟熱病毒（CDV）、犬細小病毒（CPV）二重TaqManMGB螢光定量PCR檢測試劑及其檢測方法。本發明所述的CDV/CPV二重TaqManMGB螢光定量PCR檢測試劑包含1對基於CDVH基因設計的特異性引物和1條5'端標記為FAM的TaqManMGB探針，1對基於CPVVP2基因設計的特異性引物和1條5'端標記為VIC的TaqManMGB探針；所述的二重TaqManMGB螢光定量PCR檢測方法包含2對引物序列、2條TaqManMGB標記探針序列及標記螢光、總RNA和DNA的製備、反轉錄、螢光PCR擴增及結果判定等。本發明經過一個PCR反應可同時檢測CDV和CPV兩種病毒核酸，可同時對CDV/CPV進行快速、特異、敏感的鑑別檢測，對犬瘟熱、犬細小病毒病的防控具有重要意義。
【專利說明】犬瘍熱、犬細小病毒二重TaqMan MGB螢光定量PCR檢測試劑及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於動物疫病檢疫檢測【技術領域】。涉及犬瘟熱病毒、犬細小病毒二重TaqMan MGB螢光定量PCR檢測試劑和檢測方法。
【背景技術】
[0002]犬痕熱(Canine distemper,⑶)是世界範圍內廣泛發生的一種犬的急性、高接觸性傳染病，其病原為犬瘟熱病毒(CDV)，於1905年首次報導，其自然宿主包括大部分的食肉目動物。該病傳染性強，易繼發細菌和其他病毒的混合感染或繼發感染，發病率高達80%，康復後易出現麻痺、抽搐、癲癇樣發作等後遺症。該病無特效藥物治療，成為危害養犬業的主要疫病之一。CDV屬於副粘病毒科麻疹病毒屬、負鏈單股不分節的RNA病毒，基因組全長為15 616bp。病毒的蛋白主要有核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein, N)、磷蛋白(Phosphoprotein, P)、基質膜蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein,F)、附著或血凝蛋白(Attachment protein or Hemagglutinin protein, H)、大蛋白(the large virus specificied RNA directed RNA polymerase protein, L) 6 種，編石馬基因在基因組的位置從它的3』端到5』端依次為3c端前導序列、N、P、M、F、H和L基因以及5c端前導序列，其中H蛋白是CDV與細胞受體結合的蛋白，並決定著病毒感染的細胞嗜性，H蛋白基因常作為診斷檢測所用的靶基因。
[0003]犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus, CPV)弓丨起犬的一種急性接觸性傳染病，病犬主要以劇烈嘔吐、出血性腸炎、嚴重脫水、白細胞減少和心肌炎等為主要特徵，犬細小病毒於1978年從患有腸炎的病犬體內首次分離獲得，幼犬對CPV的易感性較高，並可以發生心肌炎。發病率高達50%~?00%，病死率為10%~50%，對養犬業、犬科經濟動物養殖和犬科野生動物危害巨大。CPV是細小病毒科、細小病毒屬成員，具有細小病毒屬病毒典型形態和結構。基因組為單股D`NA，病毒粒子有VP1、VP2和VP3三種多肽，其中VP2為衣殼蛋白主要成分，為主要抗原基因，常作為檢測CPV的主要靶基因。
[0004]臨床上⑶V、CPV多混合感染，是當前嚴重危害犬、貓健康的主要疫病，防控難度大，對養犬業危害嚴重，每年均造成巨大的經濟損失。由於二者引起的臨床症狀相似，單憑臨床症狀和剖檢病變難以確診，因此必須藉助實驗室檢測進行確診。目前已有的⑶V/CPV的檢測方法主要有病毒分離鑑定、免疫螢光法(IF)、免疫組織化學技術(IHT)、免疫電鏡法(IEM)、血凝/血凝抑制試驗(HA / HI)、中和試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等方法，這些方法存在操作繁瑣、技術要求和試驗條件要求高、試驗周期長等缺點，難以滿足快速、大量檢測的需要，並且是針對某一種病毒的單一 PCR或FQ-PCR檢測方法。因此急需建立一種快速、高效、特異、敏感的檢測方法，且同時對CDV和CPV兩種病毒核酸進行快速鑑別檢測。

【發明內容】
[0005]本發明目的在於提供⑶V/CPV 二重TaqMan MGB FQ-PCR檢測試劑及其檢測方法，經過一個PCR反應可同時對⑶V和CPV兩種病毒核酸進行快速鑑別檢測。
[0006]為實現本發明的目的，本發明分別根據⑶V H基因和CPV VP2基因設計了特異性引物對和TaqMan MGB探針；通過優化反應體系組分、反應條件,進行特異性、靈敏性、重複性驗證,利用建立成功的二重FQ-PCR方法進行初步應用檢測。主要內容如下:
1.引物序列
經大量比對GenBank中⑶V H基因和CPV VP2基因序列，選取⑶V H基因和CPV VP2基因高度保守且具有型特異性基因序列為模板，設計CDV/CPV特異性引物對和 TaqMan MGB 探針，分別命名為 CDV-F(Pl)、CDV-R(P2)、CPV-F(P3)、CPV-R(P4)、CDV-MGB-FAM-Probe (Probe-P5)、CPV-MGB-VIC-Probe (Probe-P6)，由寶生物工程(大連)有限公司合成，用於⑶V/CPV 二重TaqMan MGB FQ-PCR擴增的引物和探針序列如下:
Pl:ggatggtgcc tgcattgg 18
P2:ccgactccag acaatttttt tgt 23
P3:atgccattta ctccagcagc tat 23
P4:ggtatggttg gtttccatgg at 22
Probe~P5:5J-FAM-ctctgagcaa caagaag_MGB_3』 17
Probe- P6:5』-VlC-agatctgaga cattgggttt_MGB_3』 20
2.總RNA和DNA的製備
2.1模板RNA的製備:以CDV細胞培養物為陽性對照，正常VERO細胞為陰性對照，與含有CDV的犬唾液、鼻液、眼角分泌物等待檢樣品同時採用Trizol法提取總RNA。具體操作如下:分別取滅活的⑶V細胞培養物、陰性對照及待檢樣品各200 UL於1.5 ml離心管中，再加入600 UL的Trizol於渦旋器震蕩2~3 min，加入200 μ L氯仿，離心後，取上清轉入另1.5 ml離心管中，加200 μ L異丙醇沉澱，質量百分比75%乙醇洗滌沉澱，乾燥，最後用20 μ L DEPC (焦磷酸二乙酯)水溶解沉澱，取10 μ L用於反轉錄，其餘一 20°C保存；
2.2模板DNA的製備:以CPV細胞培養物為陽性對照，正常MDCK細胞為陰性對照，與含有CPV的犬糞便、腸內容物或血清等待檢樣品提取總DNA。具體操作如下:分別取滅活的CPV細胞培養物、陰性對照及待檢樣品(如為組織時先加適量PBS研磨後取上清)各100 μ L於1.5 ml離心管中，加入500 μ?消化液(含終濃度IOmM Tris-HCl (pH 8.0)、終濃度25mMEDTA (pH 8.0)、終濃度 0.5%SDS (w/v)、終濃度 IOOmM NaCl )和 10 PL 蛋白酶 K (終濃度20mg/mL)混勻；置55°C水浴30 min~I h,加入500 ? Tris平衡酹/氯仿/異戍醇(體積比為25:24:1)混合液抽提，離心後吸取上清液加入等體積經一 20°C預冷的異丙醇沉澱DNA，用質量百分比75%乙醇洗滌沉澱，乾燥，最後加入20 μ? TE緩衝液溶解沉澱，一 20°C凍存備用；
2.3反轉錄
每管CDV反轉錄反應體系含如下成份:5XM-MLV緩衝液4 μ? ；2.5 mmol/L dNTPs(三磷酸脫氧核苷酸)4 PL5M-MLV反轉錄酶0.5 μ? ;RNA酶抑制劑0.5 μ?;Ρ2引物I μ? ;總體積10 μ?。向每管反轉錄反應體系中加入步驟2.1所製得的RNA 10 PL，37°C水浴I h或置於PCR儀中37°C反應I h，反應結束後，70°C，15 min滅活反轉錄酶，直接用於下面的PCR擴增或一 20°C凍存備用；3、⑶V/CPV標準品的製備
將含有CDV標準株H基因和CPV標準株VP2基因的陽性擴增產物分別克隆入pGEM-TEasy載體中，篩選陽性重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司採用T7和SP6引物進行測序。測序正確的⑶V/CPV重組陽性質粒應用分光光度計測定其OD26tl和OD28tl值及OD26tl /OD280值，共重複5次，確定質粒DNA的濃度和純度，定量並稀釋至1.0X 10°~1.0X IOltl拷貝/ yL，一 20°C保存備用；
4、CDV/CPV二重FQ-PCR反應條件的優化
將步驟3所得的pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組質粒分別稀釋至終濃度1.0X IO5拷貝/ μ L作為檢測模板，Ρ1/Ρ2、Ρ3/Ρ4引物對分別稀釋為終濃度0.05,0.1,0.2,0.3,0.4、
0.5,0.6,0.7,0.8 和 1.0 Mmol/L, Probe_P5、Probe_P6 探針分別稀釋到終濃度為 0.05、
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和 1.0 Mmol/L，應用螢光 PCR 儀(美國 ABI 公司，型號:ABI7000)採用矩陣法篩選不同濃度的⑶V/CPV引物和探針組合，篩選針對⑶V/CPV的二重FQ-PCR最佳引物濃度、探針濃度和最佳反應條件；
5、敏感性試驗和標準曲線的建立
將步驟3所得的pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組質粒分別作10倍系列稀釋，兩種質粒1:1比例混合，每種質粒終濃度調整為1.0X IO7~1.0X10°拷貝/ μ L，共8個稀釋度，按步驟4優化的FQ-PCR反應條件進行⑶V/CPV 二重FQ-PCR敏感性試驗。分別以pGEM_T/⑶V和pGEM-T/CPV重組質粒起始模板數的對數為Z軸，以FQ-PCR循環次數Ct值為7軸作回歸曲線,建立二重FQ-PCR方法的標準曲線；
6、特異性試驗
按步驟2所述方法對狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)等提取RNA並按2.3進行反轉錄，I型和II型犬腺病毒(CAV-UCAV-2)等則直接提取DNA，同時設經滅活的CDV和CPV標準株等量細胞培養物混合物為陽性對照，正常VERO細胞和MDCK細胞為陰性對照，按步驟4優化的FQ-PCR反應條件進行FQ-PCR擴增以驗證該方法的特異性；
7、穩定性和重複性試驗
分別將4個濃度的10倍系列稀釋的pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組等量質粒混合物(每種質粒終濃度1.0X IO3~1.0X 10°)按照步驟4優化的FQ-PCR反應條件進行FQ-PCR擴增，每個系列設定3個重複，以驗證該方法的穩定性和重複性；
8、應用試驗
依據建立的CDV/CPV 二重FQ-PCR和CDV RT-PCR、CPV PCR普通檢測方法，配製檢測試劑，以滅活的⑶V和CPV標準株等量細胞培養物混合物為陽性對照，正常VERO細胞和MDCK細胞為陰性對照，對48份臨床疑似CDV或CPV感染樣品(樣品編號為:1~48)進行了應用檢測，對這兩種方法的檢測結果進行比較分析，並與CDV、CPV病毒分離鑑定和測序結果比較。
[0007]本發明所述的⑶V/CPV 二重TaqMan MGB FQ-PCR快速檢測試劑及鑑別檢測方法可實現一個反應同時對兩種病毒進行快速鑑別檢測，可在I h~2 h內完成，具有快速、特異、敏感、高通量等優點，能滿足大批量、快速鑑別檢測CDV、CPV的要求。
【專利附圖】

【附圖說明】[0008]圖1:⑶V/CPV 二重FQ-PCR擴增曲線；圖注說明:I為FAM探針⑶V擴增曲線，2為VIC探針CPV擴增曲線，3，4為陰性對照。
[0009]圖2:⑶V/CPV 二重FQ-PCR檢測⑶V敏感性擴增曲線；圖注說明:自左到右I~7為分別對應的質粒濃度 1.0X107，1.0XlO6, 1.0XlO5, 1.0XlO4, 1.0XlO3, 1.0XlO2,1.0XlO1, 1.0XlO0 copies/^L ;8、9 為陰性對照。
[0010]圖3:CDV/CPV 二重 FQ-PCR 檢測 CDV 標準曲線。
[0011]圖4:⑶V/CPV 二重FQ-PCR檢測CPV敏感性擴增曲線:圖注說明:自左到右I~7為分別對應的質粒濃度 1.0X107，1.0XlO6, 1.0XlO5, 1.0XlO4, 1.0XlO3, 1.0XlO2,1.0XlO1, 1.0X10° copies^L, 8、9 為陰性對照。
[0012]圖5:CDV/CPV 二重 FQ-PCR 檢測 CPV 標準曲線。
[0013]圖6:⑶V/CPV 二重FQ-PCR體系單一檢測⑶V特異性擴增曲線；圖注說明:1 =CDV擴增曲線；2:CPV VIC擴增曲線，3，4:陰性對照。
[0014]圖7:CDV/CPV 二重FQ-PCR體系單一檢測CPV特異性擴增曲線；圖注說明:1 =CPV擴增曲線，2:⑶V FAM擴增曲線，3，4:陰性對照。
[0015]圖8:⑶V/CPV 二重FQ-PCR檢測其他病毒特異性擴增曲線；圖注說明:1 =CDV擴增曲線，2:CPV 擴增曲線，3，4:CPIV cDNA, 5，6:RV cDNA, 7，8:CAV-1 DNA, 9，10:CAV-2DNA, 11，12:陰性對照。
[0016]圖9:⑶V/CPV 二重FQ-PCR方法重複性和穩定性試驗結果圖；圖注說明:D1-D3, D4-D6, D7-D9, D10-D12 分別對應的質粒濃度為 1.0X 103、1.0X 102、1.0XlO1,1.0X IO0Copies^L 的 CD`V 擴增曲線，P1-P3, P4-P6, P7-P9, P10-P12 分別對應的質粒濃度為 1.0X103、1.0X IO2、1.0XlO1U.0X IO0Copies^L 的 CPV 擴增曲線。
[0017]圖10-1、10-2:CDV/CPV二重FQ-PCR方法對48份疑似樣品檢測結果圖；圖注說明:D+為CDV標準擴增曲線，P+為CPV標準擴增曲線，D7-D10, D15-D17, D28-D33, D37為CDV檢測陽性，P1，P2，P4，P5, P 13, P14, P21 , P25, P26, P35-P37, P39-P46 為 CPV 檢測陽性，D (P) 27，D (P) 38，D (P) 47，D (P) 48為CDV/CPV檢測雙陽性，其餘樣品為陰性。
[0018]圖11:⑶V RT-PCR方法對48份疑似樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；圖注說明:P為⑶V陽性對照，N為陰性對照，7，9，15-17，29，30， 47，48為⑶V檢測陽性，其餘樣品為陰性。
[0019]圖12:CPV PCR對48份疑似樣品瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖；圖注說明:P為⑶V陽性對照，N為陰性對照，I, 2，4，5，6，13，14，21，35-39，41-48為CPV檢測陽性，其餘樣品為陰性。
【具體實施方式】
[0020]、材料與方法
1.1材料 1.1.1毒株
犬瘟熱和犬細小病毒分離株由河南省動物疫病預防控制中心實驗室分離鑑定；其他對照病毒或細菌株由河南省動物疫病預防控制中心實驗室保存；
1.1.2儀器和試劑螢光PCR儀，美國ABI公司產品，型號ABI7000 ;PCR擴增儀，德國Biometra公司產品；凝膠成像分析系統，美國Alpha Innotech公司產品；恆溫水浴震蕩器(HZQ-Q)，哈爾濱東聯電子技術開發有限公司產品；臺式高速冷凍離心機，美國Heraeus公司產品'Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司，pGEM-T Easy載體、JM109感受態細胞購自Promega公司；
1.2方法
1.2.1引物設計和合成
經大量比對GenBank中⑶V H基因和CPV VP2基因序列，選取⑶V H基因和CPV VP2基因高度保守且具有型特異性基因序列為模板，設計CDV/CPV特異性引物對和 TaqMan MGB 探針，分別命名為 CDV-F(Pl)、CDV-R(P2)、CPV-F(P3)、CPV-R(P4)、CDV-MGB-FAM-Probe (Probe-P5)、CPV-MGB-VIC-Probe (Probe-P6)，由寶生物工程(大連)有限公司合成，用於⑶V/CPV 二重TaqMan MGB FQ-PCR擴增的引物和探針序列如下:
Pl:ggatggtgcc tgcattgg 18
P2:ccgactccag acaatttttt tgt 23
P3:atgccattta ctccagcagc tat 23
P4:ggtatggttg gtttccatgg at 22
Probe~P5:5』-FAM- ctctgagcaa caagaag -MGB-3' 17
Probe- P6:5』-VIC- agatctgaga cattgggttt -MGB -3』 20
1.2.2總RNA和DNA的製備
(I)模板RNA的製備:以CDV細胞培養物為陽性對照，正常VERO細胞為陰性對照，與含有CDV的犬唾液、鼻液、眼角分泌物等待檢樣品同時採用Trizol法提取總RNA。具體操作如下:分別取滅活的⑶V細胞培養物、陰性對照及待檢樣品各200 UL於1.5 ml離心管中，再加入600 UL的Trizol於渦旋器震蕩2~3 min，加入200 μ L氯仿，離心後，取上清轉入另1.5 ml離心管中，加200 μ L異丙醇沉澱，質量百分比75%乙醇洗滌沉澱，乾燥，最後用20 μ L DEPC (焦磷酸二乙酯)水溶解沉澱，取10 μ L用於反轉錄，其餘一 20°C保存。[0021 ] (2)模板DNA的製備:以CPV細胞培養物為陽性對照，正常MDCK細胞為陰性對照，與含有CPV的犬糞便、腸內容物或血清等待檢樣品提取總DNA。具體操作如下:分別取滅活的CPV細胞培養物、陰性對照及待檢樣品(如為組織時先加適量PBS研磨後取上清)各100μ L於1.5 ml離心管中，加入500 μ?消化液(含終濃度IOmM Tris-HCl (pH 8.0)、終濃度25mM EDTA (pH 8.0)、終濃度 0.5%SDS (w/v)、終濃度 IOOmM NaCl )和 10 PL 蛋白酶 K (終濃度20mg/mL)混勻；置55°C水浴30 min~I h,加入500 ? Tris平衡酹/氯仿/異戍醇(體積比為25:24:1)混合液抽提，離心後吸取上清液加入等體積經一 20°C預冷的異丙醇沉澱DNA，用75%乙醇洗滌沉澱，乾燥，最後加入20 μ? TE緩衝液溶解沉澱，一 20°C凍存備用； 1.2.3反轉錄
每管CDV反轉錄反應體系含如下成份:5XM-MLV緩衝液4 μ? ；2.5 mmol/L dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸)4 PL5M-MLV反轉錄酶0.5 μ? ;RNA酶抑制劑0.5 μ?;Ρ2引物I μ? ;總體積10 μ?。向每管反轉錄反應體系中加入步驟1.2.2 (I)所製得的RNA 10 PL，37°C水浴Ih或置於PCR儀中37°C反應I h，反應結束後，70°C，15 min滅活反轉錄酶，直接用於下面的PCR擴增或一 20°C凍存備用；
1.2.4標準品的製備
將含有CDV標準株H基因和CPV標準株VP2基因的陽性擴增產物分別克隆入pGEM-TEasy載體中，篩選陽性重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司採用T7和SP6引物進行測序。測序正確的⑶V/CPV重組陽性質粒應用分光光度計測定其OD26tl和OD28tl值及OD26tl /OD280值，共重複5次:pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV質粒標準品OD26tl平均值分別為3.641和
3.562，OD280平均值分別為1.996和1.941，OD260/ OD280平均值分別為1.824和1.835 ;參考質粒DNA拷貝數計算方法，計算pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV質粒DNA溶液的濃度分別為
9.67X 101°拷貝/ μ L和9.25X 101°拷貝/ μ L，定量並稀釋至1.0XlO0~L OX 101°拷貝/yL，一 20°C保存備用；
1.2.5 CDV/CPV 二重FQ-PCR反應條件的優化
將步驟1.2.4所得的pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組質粒分別稀釋至終濃度1.0X IO5拷貝/ μ L作為檢測模板，Ρ1/Ρ2、Ρ3/Ρ4引物對分別稀釋為終濃度0.05,0.1,0.2,0.3,0.4、
0.5,0.6,0.7,0.8 和 1.0 Mmol/L, Probe_P5、Probe_P6 探針分別稀釋到終濃度為 0.05、
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和 1.0 Mmol/L，應用螢光 PCR 儀(美國 ABI 公司，型號:ABI7000)採用矩陣法篩選不同濃度的⑶V/CPV引物和探針組合，篩選針對⑶V/CPV的二重FQ-PCR最佳引物濃度、探針濃度和最佳反應條件:
25 μ L反應體系，CDV和CPV上、下遊引物Ρ1/Ρ2、Ρ3/Ρ4終濃度各0.4 μ mol/L,Probe-P5 終濃度為 0.6 μ` mol/L, Probe~P6 終濃度為 0.7 μ mol/L, 2.5 mmol/L dNTPs 2μ L，IOXEx Taq 緩衝液 2.5 μ L, 5U/ μ L Ex Taq 酶 0.25 μ L，1.0 X IO5 拷貝 / μ L 的質粒模板各2 μ L,補足去離子水至終體積25μ L ;優化的反應程序為:94°C,5 min後，94°C 15s，60 °C 30 s，40 個循環。
[0022]結果判定:閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點為準，不同儀器可根據儀器噪音情況進行調整。陰性對照的檢測結果應無特定的擴增曲線，且Ci值> 32.0或無，陽性對照的Ci值應< 29.0，且出現特定的擴增曲線，判定檢測結果成立。如陰性對照和陽性對照結果不滿足以上條件，此次實驗視為無效。在檢測結果成立的前提下，若樣品檢測結果Ci值 32.0或無，並且無特定的擴增曲線，則判定為陰性；32.0 > Ci值> 29.0且有特定擴增曲線的樣品判定為可疑，對可疑樣品重新試驗，結果為陽性者判定為陽性，結果為陰性者判定為陰性；結果再為可疑者應重新採集該動物樣品重新試驗；
1.2.6敏感性試驗和標準曲線的建立
將步驟1.2.4所得的pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組質粒分別作10倍系列稀釋，兩種質粒1:1比例混合，每種質粒終濃度調整為1.0 X IO7~1.0 X 10°拷貝/ μ L，共8個稀釋度，按步驟1.2.5優化的FQ-PCR反應條件進行CDV/CPV 二重FQ-PCR敏感性試驗。分別以pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組質粒起始模板數的對數為Z軸，以FQ-PCR循環次數G值為7軸作回歸曲線，建立二重FQ-PCR方法的標準曲線。二重FQ-PCR檢測⑶V和CPV最低檢出限均為1.0XlO1拷貝/yL。由敏感性檢測結果建立⑶V標準曲線，相關係數為0.997，斜率為一 3.17，截距為32.9，從而可以得出拷貝數(X)與Ci值之間的線性關係表達式:Ct= - 3.17X log拷貝數+32.9 ;由敏感性檢測結果建立CPV標準曲線，相關係數0.997，斜率為一 3.07，截距為32.59，從而可以得出拷貝數(X)與Ci值之間的線性關係表達式:Ct= - 3.07X log拷貝數+32.59。根據儀器讀取的Ct值代入表達式就可算出⑶V和CPV的初始拷貝數；
1.2.7特異性試驗
按步驟1.2.2所述方法對狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)等提取RNA並按
1.2.2(I)進行反轉錄，I型和II型犬腺病毒(CAV-l、CAV-2)等則直接提取DNA，同時設經滅活的⑶V和CPV標準株等量細胞培養物混合物為陽性對照，正常VERO細胞和MDCK細胞為陰性對照，按步驟1.2.5優化的FQ-PCR反應條件進行FQ-PCR擴增以驗證該方法的特異性。Ci值分別為11.2和11.8，且出現特定的擴增曲線；但正常VERO細胞、MDCK細胞、狂犬病病毒(RV)、犬副流感病毒(CPIV)、I型和II型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)、弓形蟲、犬鉤端螺旋體等均未出現特定的擴增曲線；
1.2.8穩定性和重複性試驗
分別將4個濃度的10倍系列稀釋的pGEM-T/⑶V和pGEM-T/CPV重組等量質粒混合物(每種質粒終濃度1.0X IO3~1.0X 10°)按照步驟1.2.5優化的FQ-PCR反應條件進行擴增，每個系列設定3個重複，以驗證該方法的穩定性和重複性。重複性試驗結果表明，濃度為1.0X IO3拷貝/>L、1.0X IO2拷貝/>L、1.0X IO1拷貝/^L的3個濃度的CDV/CPV重組質粒等量混合物3次試驗結果均為陽性，濃度為1.0X 10°拷貝/^L的⑶V/CPV重組質粒等量混合物3次試驗結果均為陰性，說明建立的⑶V/CPV 二重FQ-PCR方法具有很好的穩定性和重複性；
1.2.9應用試驗
依據建立的CDV/CPV 二重FQ-PCR和CDVRT-PCR、CPV PCR普通檢測方法，配製檢測試劑，以滅活的⑶V和CPV標準株 等量細胞培養物混合物為陽性對照，正常VERO細胞和MDCK細胞為陰性對照，對48份臨床疑似CDV或CPV感染樣品(樣品編號為:1~48)進行了應用檢測，對這兩種方法的檢測結果進行比較分析，並與⑶V和CPV病毒分離鑑定和測序結果比較。結果表明，採用⑶V/CPV 二重FQ-PCR檢測，14份為⑶V陽性，20份為CPV陽性，4份為⑶V/CPV雙陽性；採用PCR檢測7份為⑶V陽性，19份為CPV陽性，2份為⑶V/CPV雙陽性。表明本發明建立的CDV/CPV 二重FQ-PCR方法比PCR方法的靈敏性高，該FQ-PCR方法檢測結果與⑶V/CPV病毒分離鑑定和⑶V H基因、CPV VP2基因測序結果符合率為100%。
【權利要求】
1.一種鑑別犬瘟熱、犬細小病毒二重TaqMan MGB螢光定量PCR檢測試劑，其特徵在於:包含I對基於⑶V H基因設計的特異性引物P1/P2和I條5』端標記為FAM的TaqManMGB探針Probe-P5 ;1對基於CPV VP2基因設計的特異性引物P3/P4和I條5』端標記為VIC的TaqMan MGB探針Probe_P6 ;所用的4條引物DNA序列、2條探針DNA序列及標記螢光為:
弓丨物 Pl:ggatggtgcc tgcattgg 18
引物 P2:ccgactccag acaatttttt tgt 23
引物 P3:atgccattta ctccagcagc tat 23
引物 P4:ggtatggttg gtttccatgg at 22
探針 Probe_P5:5，-FAM- ctctgagcaa caagaag -MGB-3』 17
探針 Probe- P6:5，-VIC- agatctgaga cattgggttt -MGB -3，20。
2.應用權利要求1所述的犬瘟熱、犬細小病毒二重TaqManMGB螢光定量PCR檢測試劑的非診斷檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)總RNA和DNA的製備 ①總RNA的製備:以CDV細胞培養物為陽性對照，正常VERO細胞為陰性對照，與含有⑶V的犬唾液、鼻液、眼角分泌物待檢樣品同時採用Trizol法提取總RNA，具體操作如下:分別取滅活的⑶V細胞培養物、陰性對照及待檢樣品各200 μ L於1.5 ml離心管中，再加入.600 μ L的Trizol於渦旋器震蕩2~3 min，加入200 μ L氯仿，4°C，12000 rpm離心10min後，取上清轉入另1.5 ml離心管中，加200 μ L異丙醇沉澱，質量百分比75%乙醇洗滌沉澱，乾燥，最後用20 μ L DEPC水溶解沉澱，取10 μ L用於反轉錄，其餘一 20°C保存； ②總DNA的製備:以CPV細胞培養物為陽性對照，正常MDCK細胞為陰性對照，與含有CPV的犬糞便、腸內容物或血清待檢樣品提取總DNA，具體操作如下:分別取滅活的CPV細胞培養物、陰性對照及待檢樣品各100 μ L於1.5 ml離心管中，加入500 KL消化液:含終濃度1OmM Tris-HCUpH 8.0，終濃度25mM EDTA、pH 8.0，重量體積比終濃度0.5%SDS、終濃度1OOmM NaCl，然後和10 PL終濃度20mg/mL蛋白酶K混勻；置55°C水浴30 min~I h，加入.500 μl Tris平衡酚/氯仿/異戊醇，體積比為25:24:1混合液抽提，離心後吸取上清液加入等體積經一 20°C預冷的異丙醇沉澱DNA，用質量百分比75%乙醇洗滌沉澱，乾燥，最後加Λ 20 μ? TE緩衝液溶解沉澱，一 20°C凍存備用； (2)反轉錄 每管CDV反轉錄反應體系含如下成份:5XM-MLV緩衝液4 μL ；2.5 mmol/L dNTPs 4μl ;M-MLV反轉錄酶0.5 μL ;RNA酶抑制劑0.5 μL ；Ρ2引物I μL ;總體積10 μL ;向每管反轉錄反應體系中加入步驟(1)①所得的⑶V RNA 10 PL，37°C水浴I h或置於PCR儀中37°C反應1 h，反應結束後，70°C，15 min滅活反轉錄酶，直接用於下面的PCR擴增或一 20°C凍存備用； (3)螢光PCR擴增 以CDV反轉錄產物、CPV總DNA為模板進行二重TaqMan MGB螢光定量PCR擴增，通過對PCR反應體系及反應條件的優化，確定反應體系如下:採用25 μ L反應體系，其中:CDV和 CPV 上、下遊引物 P1/P2、P3/P4 終濃度各 0.4 μ mol/L，Probe_P5 終濃度為 0.6 μ mol/L,Probe-P6終濃度為 0.7 μ mol/L, 2.5 mmol/L dNTPs 2 μ L，IOXEx Taq 緩衝液 2.5 μ L,5U/y L Ex Taq酶0.25 μ L，CDV反轉錄產物和CPV DNA各2 μ L，用去離子水補至25 μ L ;反應條件為:94°C 5 min後，94 V 15 s，60 V 30 s，40個循環； (4)判定標準 閾值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線的最高點為準，不同儀器可根據儀器噪音情況進行調整；陰性對照的檢測結果無特定的擴增曲線，且Ci值> 32.0或無，陽性對照的Ci值應< 29.0，且出現特定的擴增曲線，判定檢測結果成立；如陰性對照和陽性對照結果不滿足以上條件，此次實驗視為無效；在檢測結果成立的前提下，若樣品檢測結果Ci值 32.0或無，並且無特定的擴增曲線，則判定為陰性；32.0 > Ci值> 29.0且有特定擴增曲線的樣品判定為可疑，對可疑樣品重新試驗，結果為陽性者判定為陽性，結果為陰性者判定為陰性，結果再為可疑者應重新採集該動物樣品重新試驗。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103757139SQ201410053541
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年2月17日 優先權日:2014年2月17日
【發明者】吳志明, 閆若潛, 趙明軍, 趙雪麗, 王淑娟, 劉毅, 王東方, 安春霞, 謝彩華, 錢勇, 劉梅芬, 張代寶, 張林海 申請人:河南省動物疫病預防控制中心