一種天然水蛭素的生產方法

2023-05-15 01:39:41 1

專利名稱：一種天然水蛭素的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種從動物體中提取有效活性成分的生產方法，特別是以吸血水蛭為原料生產天然水蛭素的方法。
背景技術：
天然水蛭素是由65 66胺基酸組成的低分子多肽，其分子量僅為7000道爾頓， 極易溶於水和生理鹽水，在常溫下非常穩定，單純的溫度升高(100°C水浴)，或PH改變(1 13)均不影響其活性。天然水蛭素是迄今為止世界上所發現的最強的天然抗凝血酶物質， 對人類心腦血管疾病尤其是腦血栓等血栓性疾病有特效，其防治效果是任何物質所不能比擬的。同時相關研究還表明，天然水蛭素是一種直接凝血酶抑制劑，其抗凝作用非常專一， 抗凝效果比肝素強，且天然水蛭素在抑制凝血酶活性時不依賴於AT III和肝素輔助因子II 的參與。天然水蛭素與其他抗凝藥如肝素相比，其抗凝效果更可靠，這是因為①天然水蛭素不與血漿蛋白結合，血漿蛋白的種類、濃度不影響它的活性，抗凝效果一般不會因患者的不同發生變化，對凝血功能的監測要求不高。②天然水蛭素不但滅活游離的凝血酶，還可滅活與纖維蛋白結合的凝血酶，所以抑制血栓生長的作用比肝素明顯。③天然水蛭素不與血小板因子VI結合，在栓子附近仍然有良好的抗凝作用，不會引起血小板減少。④天然水蛭素抗凝作用與維生素K無關，且不受食物的影響，藥物之間互相影響小。由於上述這些優點，作為直接凝血酶抑制劑的天然水蛭素，目前，在歐洲及北美地區，已經被推薦取代傳統肝素，常規用於心血管疾病的抗凝防治。亦有研究，水蛭的藥理活性強弱取決於其體內活性成分的抗凝血酶活性強度即天然水蛭素含量，也就是說水蛭的抗凝血酶活性強即天然水蛭素含量高，其藥理活性就強，反之就弱。吸血水蛭的抗凝血酶活性明顯強於非吸血水蛭，吸血水蛭的抗凝血酶活性成分主要是天然水蛭素(英文名為=Hirudin),天然水蛭素僅存於吸血水蛭的唾液腺及其所分泌的唾液中，這就為天然水蛭素的提取增加了難度。非吸血水蛭的抗凝血酶活性成分不含天然水蛭素，到目前為止，其活性成分尚未清楚。對現有技術中天然水蛭素的生產方法檢索如下
1、中國專利03113566. 8，發明名稱菲牛蛭的養殖方法及水蛭素的提取技術。該發明是通過引進優良種源或野外捕捉到健壯的菲牛蛭，進行人工分級分段馴、餵養，進行人工繁殖，待飼養到一定程度，採用化學物質刺激鮮活菲牛蛭使其分泌出唾液，然後對其唾液進一步分離過濾得到水蛭素粗品，再將水蛭素粗品進行深加工得到符合醫用的水蛭素，該菲牛蛭含抗凝血物質比其它品種菲牛蛭含量高，藥用效果好，提取水蛭素方法簡單，提取水蛭素後將菲牛蛭放回水池養殖，相隔一周或10天又可以再提取，每條鮮活菲牛蛭可以反覆提取 6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右，產品質量好，又節約資源，提高了菲牛蛭的利用價值。但該發明所提供的技術提取到的僅是天然水蛭素的粗品，雜質多，不能直接供臨床使用。2、中國專利200610019531.0，發明名稱一種以吸血水蛭為原料製備水蛭素的方法與應用。該發明製備方法的特徵在於包括吸血水蛭製漿、配製懸濁液和乾燥三個步驟， 所得到的粉末，它保存了吸血水蛭最主要的有效活性成分——天然水蛭素。該發明具有工藝簡單、生產成本較低、產品保存期長、並可採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測天然水蛭素含量，從而使質量穩定，產品療效有保證等特點。水蛭素應用範圍廣泛，可通過常規的方法單獨做成膠囊、軟膠囊、顆粒劑、片劑使用，或與其它動、植物藥製成複方製劑，用於防治腦中風、高血壓、高脂血症、冠心病等心腦血管疾病。但該發明採用噴霧乾燥設備，其投資和佔地面積均較大，管理不便，且提取率低、生產成本高。3、中國專利200710066096. 1，發明名稱一種天然水蛭素有效成分的提取方
法。該發明公開了一種天然水蛭素有效成分的提取方法，是用水清洗吸血水蛭乾淨後加入含量15 25%的乙醇水溶液浸泡30-50小時後，過濾，得濾液和藥渣；將菲牛蛭藥渣絞碎， 再加含量15 25%的丙酮水溶液浸泡，濾過，得濾液，分別將兩次濾液真空回收乙醇和丙酮後，合併濾液，常規真空冷凍乾燥，得到產品。該發明工藝簡單、成本低廉，收率較高、產品質量好、保存期長，整個生產過程無「三廢」排放，產品作為醫藥、美容、保健食品三大領域的原料。但在天然水蛭素提取過程中，要使用到乙醇、丙酮，而乙醇和丙酮為易燃品，存在著安 ^^^ 急 ^^ ο4、中國專利200710(^6462. 0，發明名稱一種以菲牛蛭冷凍新鮮體為原材料的
水蛭素生產工藝。該發明屬於中藥製藥領域，涉及動物有效成分的提取，目的是解決傳統水蛭素提取工藝難以工業化生產的問題。該工藝採用從整體菲牛蛭中提取水蛭素，可以工業化生產。先把菲牛蛭勻漿，漿狀物用生理鹽水提取三次，過濾。濾液煮沸、過濾除雜蛋白。 收集濾液，經冷凍濃縮，醇沉後得水蛭素粗品。再用生理鹽水洗滌水蛭素粗品，然後濃縮洗滌液，最後冷凍乾燥得到產品。該水蛭素生產工藝方法簡單，成品質量合格，藥理實驗結果表明，用該工藝提取的水蛭素有很好的藥理作用。但在天然水蛭素提取過程中，要使用到乙醇，而乙醇為易燃品，存在著安全隱患。5、中國專利200710(^6461.6，發明名稱一種以菲牛蛭唾液為原材料的水蛭素
生產工藝。該發明屬於中藥製藥領域，涉及動物有效成分的提取。目的是解決傳統水蛭素提取工藝難以工業化生產的問題。該工藝用菲牛蛭唾液提取水蛭素，可以工業化生產。菲牛蛭唾液用生理鹽水提取，提取液煮沸、過濾、取濾液。固形物用生理鹽水提取，過濾，取濾液。合併前後的全部濾液，加入Lyphgel處理兩次，過濾，去濾液。固形物用生理鹽水提取， 過濾。濾液煮沸後迅速冷卻，冷藏過夜。離心，取上清液減壓濃縮後再冷凍乾燥成凍乾粉。 該生產工藝簡單，產品活力高，有很強的溶血栓作用。但該發明提取到的天然水蛭素，其雜質較多，純度較低。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述現有技術中存在的問題，提供一種新的天然水蛭素的提取方法，得到具有純度高，質量好的天然水蛭素。本發明是這樣實現的
天然水蛭素的生產方法，其特徵在於它包括含天然水蛭素液體的提取、酸沉、加熱、脫水和乾燥的工藝，具體步驟如下
(1)含天然水蛭素液體的提取選取吸血水蛭，經除雜、洗淨、晾乾後直接放入磨漿機內磨漿，製得漿液，然後按漿液重量的1 10倍加入生理鹽水或飲用水浸泡20 40分鐘，用 40 150目篩網過濾後取其濾液，備用；或者從活體吸血水蛭擠出分泌物，用40 150目篩網過濾後取其濾液，備用；
(2)酸沉在上述濾液中加入三氯乙酸，用三氯乙酸調節溶液的pH至0.5 3. 5進行沉澱，靜置10 60分鐘，離心，去沉澱物，取上清液，備用；
(3)加熱將上述上清液裝入容器中，置於50 85°C的恆溫水浴中隔水加熱20 50 分鐘，取出冷卻至常溫，再用氫氧化鈉調節溶液的pH至6. 0 8. 0，離心，去沉澱物，取上清液，備用；
(4)脫水脫掉步驟(3)中上清液30% 80%的水分，得濃縮液，備用；
(5)乾燥在上述濃縮液中加入水溶性填充劑，其加入量為濃縮液重量的0.1% 50%， 然後進行冷凍乾燥，得到粉末成品即為天然水蛭素產品。以上第(2)、第(3)所說的離心是用5000轉/分鐘 15000轉/分鐘的離心機離心5 20分鐘。以上所述的吸血水蛭是含有天然水蛭素的吸血水蛭活體或其乾燥體或其冷凍保存的屍體。以上所述的從活體吸血水蛭擠出分泌物，是讓吸血水蛭充分飢餓後再讓其吃飽用低濃度的有機酸、無機酸、無機鹽配製成的誘導液，然後對其進行擠壓，使其分泌出唾液和體內的誘導液，備用，吸血水蛭繼續飼養。具體方法見本專利申請人有關的廣西壯族自治區南寧市民族大道38-2號泰安大廈18層廣西科康生物公司周維海申請的「從菲牛蛭活體中提取天然水蛭素的方法」，專利申請號03113566，授權公告日20060906，見以上的背景技術提供的文獻1，具體技術方案是將吸血水蛭清洗乾淨，然後用誘導液餵飽吸血水蛭，所採用的誘導液是濃度較低的有機酸、無機酸、無機鹽，選用乙酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉或磷酸二氫鉀的一種或兩種、兩種以上，其重量百分濃度為0. 1 3%，pH在6 8之間，配置成水溶液，首先給吸血水蛭饑渴再給其充分吃飽半小時以後，對其進行擠壓，使其分泌出唾液和體內的誘導物質，每條鮮活吸血水蛭可以重複提取6 7次，每次能提取水蛭素粗品6 7毫升左右。以上第(6)步所說的濃縮液中加入的水溶性填充劑是澱粉、蔗糖、可溶性纖維素、 甘露醇、麥芽糊精和乳糖其中一種或者其中兩種以上的混合物。本發明所得到的天然水蛭素產品可以用於食品、保健食品、藥品或化妝品的原料， 具有抗凝溶栓、改善血液循環、促進新陳代謝等作用，在臨床上用於防治心腦血管疾病如中風、冠心病、高血脂等。所得到的粉末成品，可採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其活性成分的含量，其天然水蛭素的含量為100 50000國際單位/克。根據水蛭素能與凝血酶特異性結合，使凝血酶失活，其結合比例為1 :1的原理，用 Markwardt凝血酶直接滴定法可檢測天然水蛭素的含量。水蛭素的計量單位為國際單位，以ATU表示，凝血酶活性的國際單位為OTH，即1個 ATU等於中和1個NIH凝血酶的水蛭素量。天然水蛭素含量檢測方法
取本品粉末約lg，精密稱定，精密加入0. 9%氯化鈉溶液5ml，充分攪拌，浸提30分鐘，並時時振搖，離心，精密量取上清液100 μ 1，置試管(IOmmX 100ml)中，加入0.5% (牛)纖維蛋白原(以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩衝液(取0. 2mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25ml與0. lmol/L鹽酸溶液約40ml，加水至100 ml，調節pH值至7. 4) 200 μ 1，搖勻，置水浴(37°C 士0. 5°C)中緩緩滴加每Iml (中)含40 U (單位)的凝血酶溶液(每分鐘5 μ 1， 邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計算 U = C1V1/C2V2W
式中:U—每Ig含凝血酶活性單位，即水蛭素含量，ATU/g ； Cl---凝血酶溶液的濃度，μ / ml ； C2—供試品溶液的濃度，g / ml ； Vl---消耗凝血酶溶液的體積，μ 1 ； V2 —供試品溶液的加入量，μ 1 ； W---取樣量。上述天然水蛭素含量檢測方法均適用於以天然水蛭素為主要原料所製成的各種產品的質量監測。本發明的有益效果是
工藝簡單、提取率高、生產成本低、產品純度高、保存期長、可採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其活性成分含量，特別是本發明採用了與現有技術不同的提取、酸沉、加熱、 脫水和乾燥的工藝，從而使質量更穩定，攜帶和服用方便，可為食品、保健食品、藥品或化妝品提供安全、優質的原料，在臨床應用中，根據不同的需要，可以將本發明製成具有針對性的產品。
具體實施例方式實施例一
取日本醫蛭活體15千克，除去雜質，用水洗乾淨、自然晾乾後，放在磨漿機裡反覆磨漿 3次，得到日本醫蛭漿液；然後加入生理鹽水150千克，浸泡40分鐘，用150目篩網過濾後得濾液158. 5千克；在上述濾液中加入三氯乙酸，調節濾液pH至0. 5進行酸沉，靜置10分鐘， 用6000轉/分鐘離心機離心30分鐘，除去沉澱物，得上清液151. 3千克；將上述上清液裝入水浴鍋中進行隔水加熱，待鍋內的上清液溫度達到85°C後繼續恆溫水煮25分鐘後，取出冷卻，再用氫氧化鈉調節PH至7.3，接著用10000轉/分鐘離心機離心10分鐘，去沉澱物， 得上清液147. 6千克；將上述上清液置於分子量為3000道爾頓的超濾裝置中進行超濾，使其濾出上清液中31. 3%的水分後得濃縮液49. 6千克；在上述濃縮液中加入10%的木薯澱粉後進行冷凍乾燥，得到天然水蛭素粉末成品5. 06千克，經採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產品天然水蛭素的含量為915ATU/克。實施例二
取冷凍結冰保存的菲牛蛭屍體30千克，待其自然溶解後放入磨漿機裡反覆磨漿4次， 得到菲牛蛭漿液；然後在漿液中加入乾淨水60千克，浸泡25分鐘，用100目篩網過濾後得濾液80. 8千克；在上述濾液中加入三氯乙酸，調節pH至3. 3進行酸沉，靜置45分鐘，用 10000轉/分鐘離心機離心5分鐘，去沉澱物，得上清液71. 1千克；將上述上清液放入電加熱夾層鍋進行隔水加熱，待鍋內的上清液溫度達到50°C後繼續恆溫加熱50分鐘後，取出冷卻，再用氫氧化鈉調PH節至6.5，接著用15000轉/分鐘離心機離心15分鐘，去沉澱物，得上清液68. 4千克；將上述上清液裝入分子量為5000道爾頓的透析袋內，置於蒸餾水中，在 40C的條件下進行透析12小時後，得透析液；用68. 4千克聚乙二醇對透析液進行脫水，使其脫掉透析液中79. 3%的水分後得濃縮液14. 2千克；在上述濃縮液中分別加入0. 142千克的藥用澱粉和0. 142千克的麥芽糊精，然後再進行冷凍乾燥，得到天然水蛭素粉末成品0. 296 千克，經採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產品天然水蛭素的含量為49500ATU/ 克。實施例三
取菲牛蛭活體200千克，除去雜質，用水洗乾淨、自然晾乾後，放在磨漿機裡反覆磨漿2 次，得到菲牛蛭漿液；然後加入乾淨水200千克，浸泡30分鐘，用40目篩網過濾後得濾液 363. 7千克；在上述濾液中加入三氯乙酸，調節pH至1.7進行酸沉，靜置60分鐘，用10000 轉/分鐘管式離心機離心，去沉澱物，得上清液332. 2千克；將上述上清液裝入鋁桶中，然後置於75°C的恆溫水浴中進行水煮20分鐘(從上清液的溫度達到與水浴的溫度相同時開始算起)後，取出冷卻，再用氫氧化鈉調PH節至7. 0，接著用15000轉/分鐘管式離心機離心，去沉澱物，得上清液325. 3千克；將上述上清液置於分子量為4000道爾頓的超濾裝置中進行超濾，使其濾出上清液中53. 7%的水分後得濃縮液174. 7千克；在上述濃縮液中加入20. 5千克的甘露醇後再進行冷凍乾燥，得到天然水蛭素粉末成品20. 96千克，經採用 Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產品天然水蛭素的含量為4777國際單位/克。實施例四
取冷凍結冰保存的日本醫蛭屍體50千克，待其自溶後放入磨漿機裡反覆磨漿3次，得到日本醫蛭漿液；然後加入生理鹽水250千克，浸泡20分鐘，用80目篩網過濾後得濾液 271. 8千克；在上述濾液中加入三氯乙酸，調節pH至2. 2進行酸沉，靜置20分鐘，用7000 轉/分鐘離心機離心30分鐘，去沉澱物，得上清液沈0. 5千克；將上述上清液放入調溫鍋內進行隔水加熱，從上清液的溫度達到85°C時算起恆溫50分鐘後，取出上清液冷卻至常溫， 接著，用氫氧化鈉調PH至6. 8，用8000轉/分鐘離心機離心15分鐘，去沉澱物，得上清液 258. 6千克；將上述上清液置於分子量為3000道爾頓的超濾裝置中進行超濾，使其濾出上清液中43. 8%的水分後，得濃縮液113. 3千克；在上述濃縮液中加入53. 7千克的甘露醇， 然後進行冷凍乾燥，得到天然水蛭素粉末成品54. 16千克，經採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產品天然水蛭素的含量為356國際單位/克。實施例五
將本發明人水蛭飼養場的5千克已飢餓3個月的菲牛蛭活體清洗乾淨，然後用0. 3%檸檬酸誘導液餵飽菲牛蛭，半小時後人工對其進行擠壓，以擠壓出其唾液和體內的誘導液，共得混合溶液12. 6千克，先用150目篩網過濾後得濾液12. 1千克，然後在上述濾液中加入三氯乙酸，調節pH至3. 0進行酸沉，靜置15分鐘，用15000轉/分鐘管式離心機離心，去沉澱物，得上清液10. 3千克；將上述上清液裝入鋁桶中，置於75°C的恆溫水浴中進行水煮40分鐘(從上清液的溫度達到與水浴的溫度相同時開始算起)後，取出冷卻，再用氫氧化鈉調PH 節至7. 0，接著用15000轉/分鐘管式離心機離心，去沉澱物，得上清液9. 6千克；將上述上清液裝入分子量為5000道爾頓的透析袋內，置於蒸餾水中，在6°C的條件下進行透析10小時後得透析液；用0. 96千克聚乙二醇對透析液進行脫水，使其脫掉透析液中30. 2%的水分後得濃縮液6. 7千克；在上述濃縮液中加入3. 35千克的可溶性木薯澱粉，然後再進行冷凍乾燥，得到天然水蛭素粉末成品3. 42千克，經採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產品天然水蛭素的含量為102國際單位/克。
實施例六
取冷凍結冰保存的湖北牛蛭屍體10千克，待其自溶後放入磨漿機裡反覆磨漿3次，得到湖北牛蛭漿液；然後加入自來水30千克，浸泡35分鐘，用50目篩網過濾後得濾液36. 7 千克；在上述濾液中加入三氯乙酸，調節pH至2. 8進行酸沉，靜置25分鐘，用12000轉/分鐘分離機離心，去除沉澱物，得上清液32. 4千克；將上述上清液放入調溫鍋內進行隔水加熱，從上清液的溫度達到75°C時算起恆溫45分鐘後，取出上清液冷卻至常溫，接著，用氫氧化鈉調PH至6. 8，用8000轉/分鐘離心機離心25分鐘，去沉澱物，得上清液31. 6千克；將上述上清液置於分子量為4000道爾頓的超濾裝置中進行超濾，使其濾出上清液中53. 4%的水分後，得濃縮液14. 73千克；在上述濃縮液中分別加入3. 0千克的玉米澱粉和3. 63千克的乳糖，然後進行冷凍乾燥，得到天然水蛭素粉末成品6. 88千克，經採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測該產品天然水蛭素的含量為636國際單位/克。
權利要求
1.一種天然水蛭素的生產方法，其特徵在於它包括含天然水蛭素液體的提取、酸沉、 加熱、脫水和乾燥的工藝，具體步驟如下(1)含天然水蛭素液體的提取選取吸血水蛭，經除雜、洗淨、晾乾後直接放入磨漿機內磨漿，製得漿液，然後按漿液重量的1 10倍加入生理鹽水或飲用水浸泡20 40分鐘，用 40 150目篩網過濾後取其濾液，備用；或者從活體吸血水蛭擠出分泌物，用40 150目篩網過濾後取其濾液，備用；(2)酸沉在上述濾液中加入三氯乙酸，用三氯乙酸調節溶液的pH至0.5 3. 5進行沉澱，靜置10 30分鐘，離心，去沉澱物，取上清液，備用；(3)加熱將上述上清液裝入容器中，置於50 85°C的恆溫水浴中隔水加熱20 50 分鐘，取出冷卻至常溫，再用氫氧化鈉調節溶液的pH至6. 0 8. 0，離心，去沉澱物，取上清液，備用；(4)脫水脫掉步驟(3)中上清液30% 80%的水分，得濃縮液，備用；(5)乾燥在上述濃縮液中加入水溶性填充劑，其加入量為濃縮液重量的0.1% 50%， 然後進行冷凍乾燥，得到粉末成品即為天然水蛭素產品。
2.根據權利要求1所述的天然水蛭素的生產方法，其特徵在於所述的吸血水蛭是含有天然水蛭素的吸血水蛭活體或其乾燥體或其冷凍保存的屍體。
3.根據權利要求1所述的天然水蛭素的生產方法，其特徵在於所述的從活體吸血水蛭擠出分泌物，是讓吸血水蛭充分飢餓後再讓其吃飽用低濃度的乙酸、檸檬酸、精氨酸、賴氨酸、胱氨酸、氯化鈉、氯化鉀、碳酸鈉、磷酸鈉或磷酸二氫鉀其中的一種或兩種、兩種以上， 其重量百分濃度為0. 1 3%，PH在6 8之間的誘導液，然後對其進行擠壓，使其分泌出唾液和體內的誘導液，備用，吸血水蛭繼續飼養。
4.根據權利要求1所述的天然水蛭素的生產方法，其特徵在於步驟(2)、步驟(3)所述的離心是用5000轉/分鐘 15000轉/分鐘的離心機離心5 30分鐘。
5.根據權利要求1所述的天然水蛭素的生產方法，其特徵在於步驟(4)所述的脫水是使用超濾膜的分子量為3000 6500道爾頓的超濾裝置對上清液直接脫水，或者首先將步驟(3)中的上清液裝入分子量為3000 6500道爾頓的透析袋內，置於蒸餾水中，在4 IO0C的條件下透析6 12小時，得透析液，然後將聚乙二醇粉末撒在透析袋錶面上，聚乙二醇加入重量為透析液的0. 1 1倍，使透析袋內的透析液脫掉30% 80%的水分，得濃縮液。
6.根據權利要求1所述的天然水蛭素的生產方法，其特徵在於濃縮液中加入的水溶性填充劑是澱粉、蔗糖、可溶性纖維素、甘露醇、麥芽糊精和乳糖其中一種或者其中兩種以上的混合物。
7.權利要求1所述的天然水蛭素生產得到的產品作為食品、保健食品、藥品或化妝品原料的用途。
全文摘要
本發明公開了一種天然水蛭素的生產方法，該生產方法的特徵在於包括含天然水蛭素液體的提取、酸沉、加熱、脫水和乾燥等步驟，所得到的天然水蛭素粉末，可採用Markwardt凝血酶直接滴定法檢測其活性成分的含量，使質量穩定，產品療效有保證。該方法具有工藝簡單、提取率高、生產成本低、產品純度高、保存期長等特點，可為食品、保健食品、藥品或化妝品提供安全、優質的原料。
文檔編號C07K1/30GK102286098SQ20111023749
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月18日 優先權日2011年8月18日
發明者周維官, 周維海 申請人:周維官