靶定補體蛋白c5的抗體的組合物和方法

2023-05-14 11:07:51 1

靶定補體蛋白c5的抗體的組合物和方法
【專利摘要】本發明涉及靶定補體蛋白C5的抗體的組合物和方法。具體而言，本發明涉及靶定補體蛋白質C5的抗體，和組合物及其使用方法。
【專利說明】靶定補體蛋白C5的抗體的組合物和方法
[0001]本申請為2009年8月3日提交的、發明名稱為「靶定補體蛋白C5的抗體的組合物和方法」的PCT申請PCT/EP2009/060052的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期為2011年4月I日，申請號為200980138903.3。

【技術領域】
[0002]本發明涉及靶定補體蛋白C5的抗體和組合物及其使用方法。

【背景技術】
[0003]補體的正常作用是在宿主防禦中，補體是先天免疫系統的一部分。補體防禦細菌感染,連接適應性免疫和先天性免疫,並處理免疫複合物和炎症損傷的產物。
[0004]通過在補體激活過程中產生的生物學上有活性的產物完成防禦功能，所述產物調理病原體、促進炎症或溶解易感性靶標(Marzari等，Eur J Immunol32:2773-2782 (2002))。補體系統由在免疫系統中起作用的大約25-30種血漿蛋白質組成。補體級聯由至少三條主要途徑激活。經典途徑通常由免疫複合物激活，旁路途徑可被無保護的細胞表面激活，甘露糖結合凝集素(MBL)途徑由MBL結合到細胞表面的糖類上起始(Trendelenburg, Swiss MedWklyl37:413-417(2007))。
[0005]所有三條途徑導致C5轉化酶對C5的切割。該切割的結果是釋放了有效的炎症分子C5a片段，和起始膜攻擊複合體(MAC)的C5b。補體產物一旦釋放就不能在外源和自身靶標之間進行區分，並且如果不加以嚴格調節，則在與無限制補體激活相關的臨床情況中經常引起無辜細胞和組織的廣泛損傷(Marzari等，2002)。
[0006] C5在細胞內表達為1676個胺基酸的單個前C5肽，其由位於成熟N末端β鏈和C末端α鏈之間的18個殘基信號序列和富含Arg的接頭序列(RPRR)組成。成熟的C5具有大約190kDa的分子量，並由二硫鍵連接的兩條多肽鏈組成(a，115kDa ； β，75kDa)。C5轉化酶在α鏈的74和75位殘基之間切割C5，釋放74個胺基酸的C5a肽和隨後摻入到膜攻擊複合體(MAC)中的C5b片段。
[0007]黃斑變性是主要見於老年人的醫學狀況，在所述老年人中稱為視網膜黃斑區域的眼睛襯裡中心遭受變薄、萎縮，並且在一些情況下，出血。這可導致中心視覺喪失，其使得不能看見微小細節、閱讀或識別面孔。對新脈絡膜脈管形成的發病機理還了解的不多，但認為諸如炎症、局部缺血和血管原性因子的局部產生等因素是重要的。
[0008]儘管目前存在用於治療與經典或補體旁路途徑相關的疾病和病徵，特別是AMD的治療選擇，但仍然需要尋找產生有效並良好耐受治療的特異性靶標。


【發明內容】

[0009]本發明提供分離的補體C5-結合分子(例如，C5-結合抗體或其抗原結合片段)、包含此類分子的藥物組合物、製備此類分子和組合物的方法及其使用方法。
[0010]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體具有至少Ix17M-1UO8M-1UO9M-1UOkiM-1或111M-1的親和常數(Ka)。
[0011]在一些實施方案中，本發明提供分離的抗體或其抗原結合片段，其特異性結合C5蛋白質，並且如通過體外溶血測定法測定以約20pM到約200pM的IC5tl範圍抑制補體旁路途徑。
[0012]在一些實施方案中，本發明提供分離的抗體或其抗原結合片段，其特異性結合C5蛋白質，並且與下文表1中描述的抗體交叉競爭。在一些實施方案中，本發明提供分離的抗體或其抗原結合片段，其與下文表1中描述的抗體結合C5蛋白質的同一表位。
[0013]在一些實施方案中，本發明的抗體是特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體是特異性結合C5蛋白質的分離的人或人源化單克隆抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體是特異性結合C5蛋白質的分離的嵌合抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體包含人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區。
[0014]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是單鏈抗體。在一些實施方案中，本發明的抗體是Fab片段。在一些實施方案中，本發明的抗體是scFv。
[0015]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合人C5和獼猴C5的分離的抗體或其抗原結合片段。在一些實施方案中，本發明的抗體是IgG同種型。
[0016]在一些實施方案中，本發明提供包含構架的分離的抗體或其抗原結合片段，在所述構架中胺基酸已經替換為來自各自人VH或VL種系序列的抗體構架。
[0017]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、17、18、19、20、21、22、33、34、
35、36、37、38、49、50、61、62、63、64、65、66、77、78、89、95、101、107、113、119、120、131、132、133、134、135、136、145、146、147、148、149、150、159、160、161、162、163、164、173、174、175、176、177、178、195、196、197、198、199、200、209、226、235、236、237、238、239 或 240 具有至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的至少一條互補決定(CTR)序列。
[0018]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:l、2、3、17、18、19、33、34、35、49、61、62、63、77、77、95、107、113、119、132、131、133、145、146、147、159、160、161、173、174、175、195、196、197、226、235、236或237同一的至少一條重鏈CDR序列。
[0019]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:4、5、6、20、21、22、36、37、38、50、64、65、66、78、89、101、120、134、135、136、148、149、150、162、163、164、176、177、178、198、199、200、209、238、239或240同一的至少一條輕鏈CDR序列。
[0020]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含選自SEQ ID N0s:l、17、33、61、131、145、159、173、195和235 的重鏈 CDRl ;選自 SEQ ID NOs:2、18、34、49、62、77、95、107、113、119、132、146、160、
174、196、226 和 236 的重鏈 CDR2 ;和選自 SEQ ID N0s:3、19、35、63、133、147、161、175、197和237的重鏈⑶R3。在一些實施方案中，此類抗體或其抗原結合片段還包含選自SEQ IDN0s:4、20、36、64、134、148、162、176、198和238 的輕鏈CDRl ;選自 SEQ ID N0s:5、21、37、65、
135、149、163、177、199和239 的輕鏈CDR2 ;和選自 SEQ ID N0s:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、178、200、209 和 240 的輕鏈 CDR3。
[0021]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含選自SEQ ID N0s:4、20、36、64、134、148、162、176、198和238 的輕鏈CDRl ;選自 SEQ ID N0s:5、21、37、65、135、149、163、177、199和 239 的輕鏈CDR2 ;和選自 SEQ ID N0s:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、178、200、209 和 240 的輕鏈CDR3。
[0022]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277 或 281 具有至少 90 %,9597%,98%或至少99%序列同一性的重鏈可變區。在一些實施方案中，此類抗體或其抗原結合片段還包含與 SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的輕鏈可變區。
[0023]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%,95%,97%,98%或至少99%序列同一性的輕鏈可變區。
[0024]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:9、25、41、53、69、81、97、109、115、123、139、
153、167、181、189、203、212、220、229、243、249、254、258、274、278或 282 具有至少 90 %、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的重鏈。在一些實施方案中，此類抗體還包含與SEQID NO:10、26、42、54、70、82、91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或290具有至少90%、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的輕鏈。
[0025]在一些實施方案中，本發明提供特異性結合C5蛋白質的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體包含與SEQ ID N0:10、26、42、54、70、82、91、103、124、140、
154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或 290 具有至少 90 %、95%、97%、98%或至少99%序列同一性的輕鏈。
[0026]本發明還包含藥物組合物，其包含本發明的一種或多種C5-結合分子(例如，C5結合抗體或其抗原結合片段)和藥學上可接受的載體。
[0027]在一些實施方案中，本發明提供包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與 SEQ ID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277 或 281 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的重鏈可變區。
[0028]在一些實施方案中，本發明提供包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與 SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少 90%、95%、97%、98%或至少 99%序列同一性的輕鏈可變區。
[0029]本發明還提供包含此類核酸的載體和宿主細胞。在一個實施方案中，本發明提供分離的宿主細胞，其包含(I)編碼本發明抗體重鏈的重組DNA區段，和(2)編碼本發明抗體輕鏈的第二個重組DNA區段；其中所述DNA區段各自有效連接第一個和第二個啟動子，並能夠在所述宿主細胞中進行表達。在另一實施方案中，本發明提供包含分別編碼本發明抗體重鏈和輕鏈的重組DNA區段的分離的宿主細胞，其中所述DNA區段有效連接啟動子，並能夠在所述宿主細胞中進行表達。在一些實施方案中，所述宿主細胞是非人哺乳動物細胞系。在一些實施方案中，所述抗體或其抗原結合片段是人單克隆抗體，或其抗原結合片段。
[0030]本發明還提供使用本發明的C5結合分子(例如C5結合抗體或其抗原結合片段)的治療或診斷方法。在一個實施方案中，本發明提供治療年齡相關性黃斑變性的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發明抗體或其抗原結合片段的組合物。
[0031]在另一實施方案中，本發明提供了治療疾病的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發明抗體或其抗原結合片段的組合物，其中所述疾病是哮喘、關節炎、自身免疫心臟病、多發性硬化、炎性腸病、缺血-再灌注損傷、巴-西二氏症候群、血液透析、系統性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、牛皮癬、多發性硬化、移植、阿爾茨海默氏病、腎小球腎炎或MPGN II。
[0032]本發明還提供用於治療陣發性夜間血紅蛋白尿(PNH)的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發明抗體或其抗原結合片段的組合物。
[0033]本發明還提供改善與體外循環相關症狀的方法，其包括向需要治療的受試者施用有效量的包含本發明抗體或其抗原結合片段的組合物。
[0034]3.1 定義
[0035]除非另有定義，此處所用的所有技術和科技術語具有本發明所屬領域中普通技術人員通常理解的相同意思。
[0036] 如此處所用的術語「抗體」包括完整抗體及其任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或單鏈。天然存在的「抗體」是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每一重鏈包含重鏈可變區(此處縮寫為VH)和重鏈恆定區。所述重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。每一輕鏈包含輕鏈可變區(縮寫為VL)和輕鏈恆定區。所述輕鏈恆定區包含一個結構域CL。VH和VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，它們散布著稱為構架區(FR)的更保守的區域。每一 VH和VL由以下面順序從氨基末端到羧基末端排列的三個CDR和四個FR組成:FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的多種細胞(例如效應細胞)和經典補體系統的第一個組分(Clq)的結合。
[0037]如此處所用，術語抗體的「抗原結合部分」指完整抗體的一個或更多片段，其保留與給定抗原(例如C5)特異性結合的能力。可通過完整抗體的片段進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的「抗原結合部分」中包括的結合片段的實例包括Fab片段，其為VL、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；F(ab)2片段，其為包含在鉸鏈區通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；由VH和CHl結構域組成的Fd片段；由抗體單條臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；單結構域抗體(dAb)片段(Ward等，1989Nature341:544-546)，其由VH結構域組成；和分離的互補決定區(⑶幻。
[0038]此外，儘管Fv片段的兩個結構域VL和VH由單獨的基因編碼，但可使用重組方法，通過人工肽接頭將它們連接，所述人工肽接頭使得它們能夠製備成單條蛋白質鏈，其中VL和VH區域配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)；參閱例如Bird等，1988Science242:423-426 ；和 Huston 等，1988Proc.Natl.Acad.Sc1.85:5879-5883)。此類單鏈抗體包括抗體的一個或更多「抗原結合部分」。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得這些抗體片段，並篩選所述片段，以與完整抗體相同的方式使用所述片段。
[0039]抗原結合部分也可摻入到單結構域抗體、巨型抗體(maxibodies)、微型抗體(minibodies)、胞內抗體、雙抗體、三抗體、四抗體、v-NAR和bis-scFv (參閱例如Hollinger和 Hudson, 2005, Nature B1technology, 23, 9, 1126-1136)。抗體的抗原結合部分可移植到基於多肽如III型纖連蛋白(Fn3)的支架中(參閱美國專利號6，703，199，其描述了纖連蛋白多肽單抗體體)。
[0040]抗原結合部分可摻入到包含一對串聯Fv區段(VH-CH1-VH-CH1)的單鏈分子中，所述串聯Fv區段與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區(Zapata等，1995ProteinEng.8 (10): 1057-1062 ;和美國專利號 5，641，870)。
[0041]如此處所用，術語「親和力」指抗體與抗原在單個抗原位點上相互作用的強度。在每一抗原位點中，抗體「臂」的可變區與抗原在許多位點上通過弱的非共價力相互作用；相互作用越多，親和力越強。
[0042]如此處所用，術語「親合力」指抗體-抗原複合物的總穩定性或強度的信息化量度。其受三個主要因素控制:抗體表位親和力；抗原與抗體兩者的效價；和相互作用部分的結構排列。最終這些因素決定了抗體的特異性，即特定抗原結合精確抗原表位的可能性。
[0043]術語「胺基酸」指天然發生的和合成的胺基酸，以及與天然發生的胺基酸以相似方式起作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然發生的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及稍後被例如羥脯氨酸、Y -羧基穀氨酸和O-磷酸絲氨酸修飾的那些胺基酸。胺基酸類似物指這樣的化合物，其與天然發生的胺基酸具有相同的基本化學結構，即與氫結合的α碳、羧基、氨基和R基團，例如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞碸、甲硫氨酸甲鋶。此類類似物具有修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然發生的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物指具有與胺基酸的一般化學結構不同結構的化合物，但它以與天然發生的胺基酸類似的方式起作用。
[0044]如此處所用，術語「結合特異性」指各抗體結合位點與僅一個抗原決定簇相互作用的能力。抗體的結合部位位於分子的Fab部分，並從重鏈和輕鏈的高變區構建。抗體的結合親和力是單個抗原決定簇與抗體上單個結合部位之間反應的強度。其為抗原決定簇與抗體結合部位之間起作用的吸引力和排斥力的總和。
[0045]兩個實體之間的特異性結合表示平衡常數(Ka)為至少lxKfM'KfM'lOl1、1kT1或111M-1的結合。短語與抗體的「特異性(或選擇性)結合」指決定近親抗原(例如人C5或獼猴C5)在蛋白質和其它生物產品的異質群體中的存在的結合反應。除了上文指出的平衡常數(ΚΑ)，本發明的C5結合抗體通常還具有約IxKT2s'IxKT3s'ΙχΙΟΛ1、ΙχΙΟ?或更低的解離速率常數(Kd)，並且以比其結合非特異性抗原(例如C3、C4、BSA)的親和力高至少兩倍的親和力結合C5。短語「識別抗原的抗體」和「對抗原特異的抗體」此處可與「特異性結合抗原的抗體」互換使用。
[0046]術語「嵌合抗體」是這樣的抗體分子，其中(a)恆定區或其部分被改變、替換或交換，使得抗原結合位點(可變區)連接不同種類或改變種類的恆定區、效應功能和/或物種，或賦予嵌合抗體新性質的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生長因子、藥物等；或(b)可變區或其部分被具有不同或改變抗原特異性的可變區改變、替換或交換。例如，可通過來自人免疫球蛋白的恆定區替換小鼠恆定區來修飾小鼠抗體。由於用人恆定區進行替換，嵌合抗體在識別抗原中可保留其特異性，同時與最初的小鼠抗體相比，在人中具有降低的抗原性。
[0047]術語「補體C5蛋白質」或「C5」可互換使用，並指不同物種中的C5蛋白質。例如，人C5具有如SEQ ID NO: 296中闡明的序列，獼猴C5具有SEQ ID NO: 297中闡明的序列(Macaca fascicularis)(見表 I)。可從 Quidel (Cat.Number A403)獲得人 C5。可如下文實施例部分說明產生獼猴C5。
[0048]術語「保守修飾的變體」應用到胺基酸和核酸序列。對於特定核酸序列，保守修飾的變體指編碼相同或基本相同胺基酸序列的那些核酸，或者其中所述核酸不編碼胺基酸序列，則指基本相同的序列。因為遺傳密碼的簡併性，大量功能相同的核酸編碼任何給定的蛋白質。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶均編碼胺基酸丙氨酸。因此，在每一位置上(其中密碼子確定丙氨酸)，可將所述密碼子改變成任何所述相應的密碼子，而不改變所編碼的多肽。此類核酸變異是「沉默變異」，其為保守修飾變異的一種。此處編碼多肽的每一核酸序列也描述了所述核酸的每一種可能的沉默變異。本領域技術人員將認識到可修飾核酸中的每一密碼子(除了 AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)，以產生功能上相同的分子。因此，在每一所述序列中暗含了編碼多肽的核酸的每一沉默變異。
[0049]對於多肽序列，「保守修飾的變體」包括對多肽序列的各替換、缺失或添加，其導致對胺基酸用化學上類似的胺基酸進行替換。提供功能上類似的胺基酸的保守替換表為本領域所熟知。此類保守修飾變體除了並且不排斥本發明的多態性變體、種間同源物和等位基因。以下8組含有彼此為保守替換的胺基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸⑶，穀氨酸(E) ；3)天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q) ；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K) ；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸⑴，色氨酸(W) ；7)絲氨酸⑶，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(參閱例如，Creighton, Proteins (1984))。在一些實施方案中，術語「保守序列修飾」用於指不顯著影響或改變含有胺基酸序列的抗體的結合特徵的胺基酸修飾。
[0050]術語「交叉-阻斷」、「交叉-阻斷的」在此處可互換使用，表示抗體或其它結合劑在標準的競爭性結合測定中幹擾其它抗體或結合劑與C5結合的能力。
[0051]可使用標準競爭結合測定法來測定抗體或其它結合劑能夠幹擾另一抗體或結合分子與C5結合的能力或程度，並因此是否可以被稱為本發明的交叉阻斷。一種合適的測定法包括使用Biacore技術(例如通過使用BIAcore3000儀器(Biacore, Uppsala, Sweden)),其可以使用表面等離振子共振技術測量相互作用的程度。用於測量交叉阻斷的另一測定法使用基於ELISA的方法。
[0052]術語「表位」表示能夠特異性結合抗體的蛋白質決定簇。表位一般由分子的化學活性表面基團，如胺基酸或糖側鏈組成，並一般具有特定的三維結構特徵，以及比電荷特徵。構象和非構象表位可以區分開，因為在變性溶劑的存在下失去與前者的結合，而不失去與後者的結合。
[0053]如此處所用，術語IgG抗體的「高親和力」指對靶抗原具有10_8M或更低、10_9M或更低、ΙΟ,Μ、或1-11M或更低的KD的抗體。然而，「高親和力」結合對於其它抗體同種型可以發生變化。例如，對於IgM同種型的「高親和力」結合指具有10_7Μ或更低，或10_8Μ或更低的KD的抗體。
[0054]如此處所用，術語「人抗體」旨在包括具有可變區的抗體，在所述可變區中構架和⑶R區均來自人來源的序列。此外,如果抗體含有恆定區,所述恆定區也來自此類人序列,例如人種系序列，或突變形式的人種系序列。本發明的人抗體可包括不由人序列編碼的胺基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變引入的突變)。
[0055]術語「人單克隆抗體」指具有可變區的顯示單一結合特異性的抗體，在所述可變區中構架和CDR區均來自人序列。在一個實施方案中，所述人單克隆抗體由雜交瘤產生，所述雜交瘤包括從轉基因非人動物，例如轉基因小鼠中獲得的B細胞，所述轉基因非人動物具有融合到無限增殖細胞中的包含人重鏈轉基因和輕鏈轉基因的基因組。
[0056]「人源化」抗體是保留非人抗體的反應性，而在人中具有更低免疫原性的抗體。例如這可通過保留非人⑶R區並用它們的人類對應物替換抗體剩餘部分(即，恆定區以及可變區的構架部分)來實現。參閱例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855，1984 ；Morrison 和 0i, Adv.1mmunol., 44:65-92，1988 ；Verhoeyen等，Science,239:1534-1536，1988 ；Padlan,Molec.1mmun.，28:489-498，1991 ；和Padlan, Molec.1mmun.，31:169-217, 1994。人工程化技術的其它實例包括，但不限於在US5, 766，886中公開的Xoma技術。
[0057]在兩條或更多核酸或多肽序列的上下文中，術語「相同的」或百分比「同一性」指相同的兩條或更多序列或子序列。當使用以下的序列比較算法或通過手工比對和視覺檢查測定，比較並比對在比較窗內或指定區域內用於最大對應時，如果兩條序列具有特定百分比(即，在特定區域上或當不指定時，在全長序列上60 %同一性，任選地65%、70 %、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性)的相同胺基酸殘基或核苷酸，那麼兩條序列「基本相同」。任選地，同一性存在於長度至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)的區域，或更優選地在長度至少100到500或1000或更多核苷酸(或20、50、200或更多胺基酸)的區域。
[0058]對於序列比較，通常一條序列作為參考序列，測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，如果需要，指定子序列坐標，並指定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或可指定可選參數。所述序列比較算法然後基於程序參數計算測試序列相對於參考序列的百分比序列同一性。
[0059]如此處所用，「比較窗口」包括參考選自20到600、一般約50到約200，更一般約100到約150的任何一定數量相鄰位置的區段，其中可在兩條序列進行最佳比對後將序列與相同數量相鄰位置的參考序列進行比較。用於比較的序列比對方法為本領域所熟知。例如通過Smith和Waterman(1970)Adv.App1.Math.2:482c的局部同源性算法，通過Needleman 和 ffunsch, J.Mol.B1l.48:443, 1970 的同源性比對算法，通過搜索 Pearson 和Lipman, Proc.Nat』 1.Acad.Sc1.USA85:2444, 1988的相似性方法，通過這些算法的計算機化實現(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575ScienceDr.，Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通過手工比對和視覺檢查(參閱，例如 Brent 等，Current Protocols in Molecular B1logy, John ffiley&Sons, Inc.(ringbou編輯，2003))進行序列最佳比對用於比較。
[0060]適合於測定百分比序列同一性和序列相似性的算法的兩個實例是BLAST和BLAST2.0 算法，其分別描述於 Altschul 等，Nuc.Acids Res.25:3389-3402，1977 ；和Altschul 等，J.Mol.B1l.215:403-410，1990 中。用於進行BLAST分析的軟體通過Nat1nalCenter for B1technology Informat1n公開獲得。該算法包括首先通過鑑定查詢序列中長度為W的短字來鑑定高得分序列對(HSPs)，當在資料庫序列中用相同長度的字比對時，所述短字匹配或滿足某一正值閾值得分T15T稱為鄰近字得分閾值(Altschul等，上文)。這些初始鄰近字命中作為起始搜索的種子，以發現含有它們的更長HSPs。只要可增加累積比對得分，則沿每一序列的兩個方向延伸字命中。對於核苷酸序列，使用參數M(對一對匹配殘基的獎賞得分?』總>0)和N(對錯配殘基的罰分；總〈0)計算累積得分。對於胺基酸序列，使用得分矩陣來計算累積得分。當:所述累積比對得分從其最高達到值跌落X量；因一個或更多負得分殘基比對累積，所述累積比對得分到達零或以下；或到達任何一條序列的末端時，停止字命中在每一方向上的延伸。BLAST算法參數W、T和X決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對於核苷酸序列)使用默認字長(W) 11、期望值(E) 10,M = 5、N = -4和兩條鏈的比較。對於胺基酸序列，BLASTP程序使用默認字長3，和期望值(E) 10和BL0SUM62得分矩陣(參閱 Henikoff 和 Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:10915, 1989)比對(B) 50,期望值(E) 10、M = 5、N = -4和兩條鏈的比較。
[0061]BLAST算法也進行兩條序列之間相似性的統計學分析(參閱例如，Karlin和Altschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5787，1993)。BLAST 算法提供的一種相似性測量是最小總和概率(P(N))，其提供兩條核苷酸或胺基酸序列之間偶然發生匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參考核酸的比較中最小總和概率低於約0.2，更優選低於約0.01，並最優選低於約0.001，那麼認為核酸與參考序列相似。
[0062]也可使用已經整合到ALIGN算法(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller (Comput.Appl.B1sc1., 4:11-17, 1988)的算法，使用PAM120加權殘基表，空位長度罰分12和空位罰分4測定兩條胺基酸序列之間的百分比同一性。此外，可使用已經整合到GCG軟體包(可在www.gcg.com上獲得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch (J.Mol, B1l.48:444-453，1970)算法，使用Blossom62矩陣或PAM250矩陣，以及空位加權16、
14、12、10、8、6或4和長度加權1、2、3、4、5或6來測定兩條胺基酸序列之間的百分比同一性。
[0063]除了上文指出的序列同一性的百分比，兩條核酸序列或多肽基本相同的另一指示是第一條核酸編碼的多肽與針對第二條核酸編碼的多肽產生的抗體免疫交叉反應，如下文描述。因此，多肽通常與第二條多肽基本相同，例如，其中兩條肽僅因保守替換而不同。兩條核酸序列基本相同的另一指示是兩個分子或其互補序列在嚴格條件下彼此雜交，如下文描述。兩條核酸序列基本相同的又一指示是可使用相同的引物來擴增所述序列。
[0064]術語「分離的抗體」指抗體，其基本不含具有不同抗原特異性的其它抗體(例如，特異性結合C5的分離的抗體基本不含特異性結合除C5外的抗原的抗體)。然而，特異性結合C5的分離的抗體可對其它抗原具有交叉反應性。此外，分離的抗體可基本不含其它細胞物質和/或化學品。
[0065]術語「同種型」指重鏈恆定區基因提供的抗體種類(例如，IgM、IgE、IgG如IgGl或IgG4)。同種型也包括這些種類中一種的修飾形式，其中已經進行修飾以改變Fe功能，例如來增強或減弱效應功能或與Fe受體的結合。
[0066]如此處所用，術語「Kassoc」或「Ka」旨在指特定抗體-抗原相互作用的結合速率，而如此處所用，術語「Kdis」或「Kd」旨在指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如此處所用，術語「KD」旨在指解離常數，其獲得於Kd與Ka的比值(即Kd/Ka)並表達為摩爾濃度(M)。可使用本領域熟知的方法測定抗體的Kd值。用於測定抗體Kd的方法是通過使用表面等離振子共振，或使用生物傳感器系統如Biacore?系統。
[0067]如此處所用，術語「單克隆抗體」或「單克隆抗體組合物」指單個分子組合物的抗體分子的製劑。單克隆抗體組合物對特定表位顯示單一結合特異性和親和力。
[0068]術語「核酸」此處與術語「多核苷酸」可互換使用，並指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述術語包括含有已知核苷酸類似物或修飾的骨架殘基或鍵的核酸，其為合成的、天然發生的和非天然發生的，其與參考核酸具有相似的結合性質，並且其以與參考核苷酸相似的方式進行代謝。此類類似物的實例包括，但不限於硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
[0069]除非另有指出，特定核酸序列也暗中包括其保守修飾的變體(例如簡併密碼子替換)和互補序列，以及明確指出的序列。尤其是，如下文詳細描述，可通過產生這樣的序列完成簡併密碼子替換，其中用混和鹼基和/或脫氧肌苷殘基替換一個或更多所選(或全部)密碼子的第三個位置(Batzer 等，Nucleic Acid Res.19:5081, 1991 ;0htsuka 等，J.B1l.Chem.260:2605-2608，1985 ;和 Rossolini 等，Mol.Cell.Probes8:91-98, 1994)。
[0070]術語「有效連接」指兩個和更多多核苷酸(例如DNA)區段的功能關係。通常，其指轉錄調節序列與轉錄序列之間的功能關係。例如，如果啟動子或增強子序列刺激或調節編碼序列在適當宿主細胞或其它表達系統中的轉錄，那麼該啟動子或增強子序列有效連接編碼序列。一般地，有效連接轉錄序列的啟動子轉錄調節序列與轉錄序列在物理空間上鄰近，即它們是順式作用。然而，一些轉錄調節序列，如增強子不需要與編碼序列(增強子增強其轉錄)在物理空間上鄰近或位於其附近。
[0071]如此處所用，術語「優化的」表示已經使用生產細胞或生物，一般是真核細胞，例如畢赤酵母細胞、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或人細胞中優選的密碼子改變核苷酸序列，以編碼胺基酸序列。將優化的核苷酸序列改造以完全或最大可能地保留起始核苷酸序列(其也稱為「親本」序列)最初編碼的胺基酸序列。已經改造了此處的優化序列以具有哺乳動物細胞中優選的密碼子。然而，此處也考慮其它真核細胞或原核細胞中這些序列的優化表達。優化的核苷酸序列編碼的胺基酸序列也稱為優化的。
[0072]術語「多肽」和「蛋白質」此處互換使用來指胺基酸殘基的聚合物。所述術語應用到胺基酸聚合物，其中一個或更多胺基酸殘基是相應天然發生胺基酸的人工化學模擬物，還應用到天然發生的胺基酸聚合物和非天然發生的胺基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也暗中包括其保守修飾的變體。
[0073]如此處所用，術語「重組人抗體」包括通過重組方法製備、表達、產生或分離的所有人抗體，如從對人免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或從中製備的雜交瘤中分離的抗體、從經轉化以表達人抗體的宿主細胞，例如從轉染瘤中分離的抗體、從重組、組合人抗體庫文中分離的抗體，和通過任何其它手段製備、表達、產生或分離的抗體，所述手段包括將全部或部分人免疫球蛋白基因、序列剪切成其它DNA序列。此類重組人抗體具有可變區，其中構架和CDR區均來自人種系免疫球蛋白序列。然而在某些實施方案中，此類重組人抗體可進行體外誘變(或者，當使用人Ig序列轉基因的動物時，進行體內體細胞誘變)，因此重組抗體的VH和VL區的胺基酸序列是當來自並與人種系VH和VL序列相關時可能在體內人抗體種系所有組成成分中不天然存在的序列。
[0074]術語「重組宿主細胞」(或簡單地「宿主細胞」)指已經向其中引入重組表達載體的細胞。應理解此類術語不僅旨在指特定受試者細胞，還指此細胞的後代。因為某些修飾可能因突變或環境影響而在後代中出現，所以該後代實際上可能與親本細胞不相同，但仍然包括在此處所用術語「宿主細胞」的範圍內。
[0075]術語「受試者」包括人和非人動物。非人動物包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，如非人靈長類、羊、狗、奶牛、雞、兩棲動物和爬行動物。除了指出時，術語「患者」或「受試者」此處可互換使用。
[0076]術語「治療」包括施用組合物或抗體，以防止或延遲症狀、併發症或疾病(例如AMD)的生物化學指徵的開始，緩解症狀或阻止或抑制疾病、狀況或病徵的進一步發展。治療可以是預防性的(以防止或延遲疾病開始，或防止其臨床或亞臨床症狀的表現)或在疾病表現後治療性抑制或緩解症狀。
[0077]術語「載體」旨在指能夠轉運已經連接另一多核苷酸的多核苷酸分子。一種類型的載體是「質粒」，其指已經連接額外DNA片段的環形雙鏈DNA環。另一類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區段可連接到病毒基因組內。某些載體能夠在其中引入載體的宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和游離型哺乳動物載體)。其它載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合到宿主細胞的基因組中，並由此與所述宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠指導它們有效連接的基因的表達。此類載體此處稱為「重組表達載體」(或簡單地，「表達載體」)。一般而言，在重組DNA技術中有用的表達載體經常是質粒的形式。在本說明書中，「質粒」和「載體」可互換使用，因為質粒是載體的最常用形式。然而，本發明旨在包括此類其它形式的表達載體，如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)，其起等同的功能。
[0078]發明詳述
[0079]本發明提供特異性結合補體C5蛋白質(例如，人C5，獼猴C5)的抗體、藥物組合物、產生方法和使用此類抗體和組合物的方法。
[0080]5.1C5 抗體
[0081]本發明提供特異性結合C5(例如，人C5，獼猴C5)的抗體。在一些實施方案中，本發明提供特異性結合人和獼猴C5的抗體。本發明的抗體包括，但不限於如實施例中所述分離的人單克隆抗體(參閱下文第6部分)。
[0082]本發明提供特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有 SEQ ID N0:7、23、39、51、67、79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或281的胺基酸序列的VH結構域。本發明還提供特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有下文表1中列出的任何一個VH CDRs的胺基酸序列的VH CDR0具體而言，本發明提供特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含(或者，組成為)具有下文表1中列出的任何一個VH⑶Rs的胺基酸序列的一個、兩個、三個、四個、五個或更多VH⑶Rs。
[0083]本發明提供特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有 SEQ ID N0:8、24、40、52、68、80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285或289的胺基酸序列的VL結構域。本發明還提供特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含具有下文表1中列出的任何一個VL CDRs的胺基酸序列的VL CDR0具體而言，本發明提供特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體，所述抗體包含(或者，組成為)具有下文表1中列出的任何一個VL⑶Rs的胺基酸序列的一個、兩個、三個或更多VL⑶Rs。
[0084]本發明的其它抗體包括已經突變的胺基酸，其在CDR區中仍然與表1所述序列中描述的⑶R區具有至少百分之60、70、80、90或95的同一性。在一些實施方案中，其包括突變胺基酸序列，其中當與表1所述序列中描述的⑶R區比較時⑶R區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸已經發生突變。
[0085]本發明還提供編碼特異性結合C5蛋白質(例如，人和/或獼猴C5)的抗體的VH、VL、全長重鏈和全長輕鏈的核酸序列。可優化此類核酸序列用於在哺乳動物細胞中表達(例如，表 I 顯示了抗體 8109、8110、8111、8113、8114、8112、8125、8126、8127、8128、8129、8130,8131,8132和8091的重鏈和輕鏈的優化核酸序列)。
[0086]表1.本發明C5抗體與C5蛋白質的實例
[0087]

【權利要求】
1.特異性結合補體C5蛋白質的分離的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體具有至少 IxlO7M'18M'19M'1iqIT1 或 111ITi 的親和常數(Ka)。
2.權利要求1的抗體,其如通過體外溶血測定法所測定以20-200pM的IC5tl抑制補體芳路。
3.抗體或其抗原結合片段，其特異性結合補體C5蛋白質，並與表1中描述的抗體交叉競爭。
4.抗體或其抗原結合片段，其與表1中描述的抗體結合相同的表位。
5.權利要求1、3或4的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
6.權利要求5的抗體，其中所述抗體是人或人源化抗體。
7.權利要求5的抗體，其中所述抗體是嵌合抗體。
8.權利要求5的抗體，其中所述抗體包含人重鏈恆定區和人輕鏈恆定區。
9.權利要求5的抗體，其中所述抗體是單鏈抗體。
10.權利要求5的抗體，其中所述抗體是Fab片段。
11.權利要求5的抗體,其中所述抗體是scFv。
12.權利要求5的抗體，其結合人C5和獼猴C5。
13.權利要求5的抗體，其是IgG同種型。
14.權利要求5的抗體，其中所述抗體包含構架，其中胺基酸已經替換成來自各自人VH或VL種系序列的抗體構架。
15.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID ΝΟ:1、2、3、4、5、6、17、18、19、20、21、22、33、34、35、36、37、38、49、50、61、62、63、64、65、66、77、78、89、95、101、107、113、119、120、131、132、133、134、135、136、145、146、147、148、149、150、159、160、161、162、163、164、173、174、175、176、177、178、195、196、197、198、199、200、209、226、235、236、237、238,239或240具有至少95%序列同一性的至少一個互補決定(OTR)序列，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
16.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID ΝΟ:1、2、3、17、18、19、33、34、35、49、61、62、63、77、77、95、107、113、119、132、131、133、145、146、147、159、160、161、173、174、175、195、196、197、226、235、236或237相同的至少一個重鏈CDR序列，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
17.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID N0:4、5、6、20、21、22、36、37、38、50、64、65、66、78、89、101、120、134、135、136、148、149、150、162、163、164、176、177、178、198、199、200、209、238、239或240相同的至少一個輕鏈CDR序列，其中所述抗體結合人C 5蛋白質。
18.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含選自SEQID ΝΟ:1、17、33、61、131、145、159、173、195 和 235 的重鏈 CDRl ;選自 SEQ ID NO:2、18、34、49、62、77、95、107、113、119、132、146、160、174、196、226 和 236 的重鏈 CDR2 ;和選自 SEQ ID NO:3、19、35、63、133、147、161、175、197和237的重鏈CDR3，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
19.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含選自SEQID N0:4、20、36、64、134、148、162、176、198和 238 的輕鏈 CDRl ;選自 SEQ ID NO:5、21、37、65、135、149、163、177、199和 239 的輕鏈 CDR2 ;和選自 SEQ ID N0:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136 150、164、178、.200,209和240的輕鏈⑶R3，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
20.權利要求18的抗體，或其抗原結合片段，其還包含選自SEQID NO:4、20、36、64、.134、148、162、176、198和238 的輕鏈CDRl ;選自 SEQ ID NO:5、21、37、65、135、149、163、177、.199 和 239 的輕鏈 CDR2 ;和選自 SEQ ID N0:6、22、38、50、66、78、89、101、120、136、150、164、.178、200、209 和 240 的輕鏈 CDR3。
21.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID NO:7、23、39、51、67、79、.96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或 281具有至少95%序列同一性的重鏈可變區，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
22.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID N0:8、24、40、52、68、80、.90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285和 289 具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
23.權利要求21的抗體，或其抗原結合片段，其還包含與SEQID NO:8、24、40、52、68、.80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285 和 289 具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區。
24.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID NO:9、25、41、53、69、81、.97、109、115、123、139、153、167、181、189、203、212、220、229、243、249、254、258、274、278或.282具有至少95%序列同一性的重鏈，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
25.分離的單克隆抗體，或其抗原結合片段，其包含與SEQID N0:10、26、42、54、70、82、.91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286或 290具有至少95%序列同一性的輕鏈，其中所述抗體結合人C5蛋白質。
26.權利要求24的抗體，或其抗原結合片段，其還包含與SEQID NO: 10、26、42、54、70、.82、91、103、124、140、154、168、182、190、204、213、221、230、244、251、262、266、270、286 或.290具有至少95%序列同一性的輕鏈。
27.藥物組合物，其包含選自權利要求1-26的抗體和藥學上可接受的載體。
28.包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與SEQID NO:7、23、39、51、67、.79、96、108、114、121、137、151、165、179、187、201、210、218、227、241、253、257、273、277或.281具有至少95%序列同一性的重鏈可變區。
29.包含編碼多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含與SEQID N0:8、24、40、52、68、.80、90、102、122、138、152、166、180、188、202、211、219、228、242、261、265、269、285和 289 具有至少95%序列同一性的輕鏈可變區。
30.載體，其包含權利要求28或29的核酸。
31.分離的宿主細胞，其包含(I)編碼權利要求18的抗體重鏈的重組DNA區段，和(2)編碼所述抗體的輕鏈的第二個重組DNA區段；其中所述DNA區段有效連接啟動子，並能夠在所述宿主細胞中表達。
32.權利要求31的宿主細胞，其中所述抗體是人單克隆抗體。
33.權利要求31的宿主細胞，其為非人哺乳動物細胞系。
34.治療年齡相關性黃斑變性的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的包含選自權利要求1-26的抗體的組合物。
35.權利要求34的方法，其中所述受試者是人。
36.治療疾病的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的包含選自權利要求1-26的抗體的組合物，其中所述疾病是哮喘、關節炎、自身免疫心臟病、多發性硬化、炎性腸病、缺血-再灌注損傷、巴-西症候群、血液透析、系統性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、牛皮癬、多發性硬化、移植、阿爾茨海默氏病、腎小球腎炎或MPGN 11。
37.權利要求36的方法，其中所述疾病是腎小球腎炎。
38.治療陣發性夜間血紅蛋白尿(PNH)的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的包含選自權利要求1-26的抗體的組合物。
39.改善與體外循環相關症狀的方法，其包括向需要其的受試者施用有效量的包含權利要求1-26的抗體的 組合物。
【文檔編號】A61P11/06GK104177495SQ201410336233
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2009年8月3日 優先權日:2008年8月5日
【發明者】B·迪芬巴赫-施特賴貝爾, A·埃博斯, B·C·吉爾德, Y-I·金, M·羅古斯卡, I·斯普勞斯基 申請人:諾華股份有限公司