一種新型羧基末端肽及長效白介素7的製作方法

2023-05-14 19:44:11

本發明屬於治療性生物製劑領域，涉及一種新型羧基末端肽及長效白介素-7。
背景技術：
：人白介素7(IL-7)於1988年確認並定位於染色體8q12-13。人IL-7蛋白含有六個外顯子，小鼠IL-7為5個外顯子，分子量約為25kDa，人比小鼠多的為第5個外顯子，並多了17個胺基酸。IL-7主要由非造血基質細胞和上皮細胞產生，包括成纖維網狀細胞、淋巴器官的T細胞區、骨髓基質細胞、主要組織相容性複合體(MHC)、(MHC)Ⅱ類+胸腺上皮細胞、肝和腸上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞、濾泡樹突狀細胞及平滑肌細胞，DC細胞和巨噬細胞也可產生少量的IL-7。IL-7分布廣泛，絕大多數器官包括大腦均表達。因為IL-7存在於大多數組織內，並且幾乎所有的外周T細胞均表達IL-7受體，最近研究表明IL-7通過一個簡單的IL-7R介導的反饋迴路直接控制信號傳導和激活。IL-7由153個胺基酸組成，含有三個二硫鍵，三個N糖基化，一個O糖基化位點。IL-7是γc家族細胞因子，與細胞表面IL-7受體複合物結合，α鏈(IL-7R,CD127)和γ鏈(CD132)共同形成的受體複合物。其中CD127為IL-7和胸腺基質淋巴細胞生成素(TSLP)共同受體，而CD132為IL-7和IL-2,IL-4,IL-9,IL-15和IL-21共同使用。IL-7二聚體受體在效應T細胞和記憶T細胞上高表達，該受體也在單核細胞、DC細胞、發育中的B細胞和T細胞上表達，但是不在成熟的B細胞上表達。人IL-7能夠結合鼠IL-7受體，並能夠通過該受體傳導信號，反之亦然。刺激的IL-7R激活Janus激酶/信號轉導和轉錄激活(JAK/STAT主要是JAK1，JAK3和STAT5)，轉錄因子(JAK/STAT主要JAK1，JAK3，STAT5)，Src家族激酶和磷脂醯肌醇3-激酶信號通路(phosphatidylinositol3-kinase(PI3K-AKT)signalingpathways)。IL-7是免疫調節和免疫增強的重要細胞因子，在免疫系統的各個階段均起作用，從骨髓基質細胞，到胸腺，再到外周血的各種效應細胞，都可見IL-7的作用。在B細胞分化的某些階段、T細胞和NK細胞的存活、發育和穩態等多方面都發揮著重要作用。因此認為IL-7是記憶T細胞產生和維持的關鍵因素之一。在造血幹細胞向淋巴細胞分化和T細胞的陰陽性選擇中有重要作 用，還可以使初始T細胞活化後經過多輪擴增變成效應T細胞。研究表明，IL-7能夠增強CD4+效應T細胞作用，並促使具有IL-7受體的效應T細胞發展成為長期存活的記憶T細胞。在胸腺發育早期對IL-7的需求是因為IL-7有利於Rag-1基因的表達，該基因是TCR重組必須的。Il-7對T細胞發育至關重要，參與T細胞的陰陽性選擇，並促進T細胞受體(TCR)β,γ和δ基因重排。對於γδT細胞的分化發育，IL-7是必不可少的。另外，IL-7也能促進記憶細胞反向分化成效應CD4+和CD8+細胞。另外，IL-7也能促進記憶細胞反向分化成效應CD4+和CD8+細胞。IL-7對於B細胞的發育也很重要，尤其是pre-pro-B細胞發育成B細胞。IL-7對B淋巴系細胞發育的作用首先是與分泌IL-7的骨髓基質細胞作用，在V、D、J重排過程中也發揮作用。IL-7使Igu鏈成功表達，並與替代輕鏈、Igα和Igβ的信號亞單位結合形成B細胞受體(pre-BCR)，pre-BCR促使一群大的pre-B細胞(pre-BIIcells)產生和擴增。隨著年齡的增長，胸腺退化，對淋巴細胞從胸腺向外周血轉移初始T細胞的能力顯著降低。與初始T細胞相比，當記憶細胞針對回憶性抗原的免疫能力增強，但是會限制其針對新抗原的免疫能力。因此，IL-7作用於前T細胞的生物活性大小與年齡相反的，越小越強。homeostaticperipheralexpansion(HPE)是指在去除或部分去除T細胞的宿主上過繼移植T細胞或對剩餘的T細胞進行擴增的方式來重構T細胞數量和功能的手段。在HPE中，低親和力的抗原作用更大，因為在淋巴細胞減少的情況下，T細胞針對廣譜抗原的擴增便於維持足夠T細胞受體(TCR)的豐度。IL-7水平提高介導T細胞針對自身抗原提供持續的刺激信號擴增，這種信號就是低親和力抗原刺激T細胞受體的信號。對於透析所致的淋巴細胞減少，HIV所致的淋巴細胞CD4+減少，骨髓移植等淋巴細胞減少或者由於治療自身免疫性疾病採用了單抗而導致T細胞減少的情況，IL-7可以增加TCR的多樣性和T細胞數量。另外，抗凋亡效應是IL-7生物活性的重要貢獻，IL-7通過上調Bcl-2和Mcl-1提供抗凋亡信號，抑制前凋亡信號，如BAX或BIM，便於維持長期記憶性T細胞。IL-7的受體在體內廣泛分布，為α鏈(IL-7R,CD127)和γ鏈(CD132)共同形成的受體複合物。IL-7R可以反饋調節IL-7的濃度。因為CD132的表達基本上是恆定的，所以它能夠過調節CD127的表達量來調節IL-7的受體表達量，從而調節IL-7的功能。但T細胞數量正常時，IL-7信號降低CD127在成熟T細胞表面的表達，這種下調或許可以提高有限數量的IL-7作用於更多的T細胞。IL-7下調CD127的表達也可以限制T細胞的無限制分化。因此，動態調節CD127的表達在效應T細胞向記憶T細胞轉化過程中至關重要。IL-7注射於正常小鼠時，會導致外周淋巴器官的T細胞增加，當注射到環磷醯胺使淋巴細胞減少或在骨髓移植中全身照射小鼠，會加速T細胞的恢復而使脾臟和淋巴結的T細胞增 加。這些研究為IL-7對胸腺依賴或非胸腺依賴的免疫重構提供了依據。IL-7治療可以提高免疫反應，尤其可以大幅度提高對低親和性或弱的免疫原的反應。由於自身抗原—腫瘤抗原沒有免疫原性或免疫原性很弱，IL-7的上述特徵使得其成為一種針對腫瘤免疫治療的極具可能的潛在佐劑。目前，愛滋病、肝炎和結核病(HIV、HBV、HCV、TB)等疾病在我國甚至全世界都是嚴重的公共衛生問題；並且隨著人口老齡化，腫瘤患病率越來越高。目前，IL-7作為治療慢性病毒性感染疾病、結核感染和腫瘤的備選藥物或佐劑，開展了多達27項相關的臨床試驗，應用前景光明。接受IL-7治療的病人顯示CD4+和CD8+的數量都增加，有劑量效應關係，並伴隨著T細胞循環加快。淋巴細胞的增加與年齡關係不大，然而幼稚T細胞尤其幼稚CD8+T細胞最先誘導進入循環，因此他們的數量比記憶性細胞的數量多。TCR譜測定顯示；IL-7治療後，T細胞受體豐度大大增加，選擇性的增加了高表達CD127的群落。CD4+和CD8+T亞群的增加是對IL-7劑量依賴性的。在一些病人中，骨髓中的前B細胞增加，但是在外周循環並不出現這種增加。與對照組相比，沒有顯示針對惡性腫瘤的抗原增加了免疫反應性，但是相關數據比較少，還需進一步驗證。HIV病毒的細胞毒性結合對細胞的其他間接性的影響，如慢性活化免疫系統導致消耗T細胞庫，不完全恢復失去的T細胞等使CD4+T細胞逐漸消失，導致針對特異性免疫反應的能力缺失。IL-7能提高HIV-1特異性CD8+的分化和細胞毒殺傷活性(CTL)。由於IL-7治療能夠提高CD4+，所以可作為治療HIV的候選藥物或佐劑。也能提高用HIV-1膜蛋白免疫後的CD4+T細胞的體液免疫，提高α幹擾素抗HIV複製的作用，還可以提高CD4+和CD8+T細胞的抗凋亡的能力。HIV感染者PBMC體外培養證明IL-7能夠增強HIV複製能力，並且提高CXCR4和CXCR5受體的表達，使HIV更容易進入細胞。IL-7用於腫瘤治療的機制在於是：1.在化療後可以使用IL-7來重構免疫系統；2.通常在使用藥物化療後，淋巴細胞減少，T細胞數量也減少，尤其是CD4+細胞，免疫細胞低於正常值長達數月至數年。一種策略是利用過繼性免疫治療技術，將細胞在體外激活和擴增，然後回輸給患者，這種策略也可用在放射性病人或化療後的病人。重構腫瘤病人免疫系統，使用IL-7治療年齡越小越好，因為小孩具有產生初始T細胞譜的能力更強，並且比成人更完善。通過糖基化來延長半衰期：Ceaglio等通過定點突變的方法將一段N糖基化共有序列插入到幹擾素分子的不同位置，構成4N和5N-幹擾素的變異體，使得分子大小和電荷數均有所增加，後者的生物學活性與未突變的重組人幹擾素-α2活性相當，但降低了腎臟對幹擾素的清除作用，延長了半衰期。人絨毛膜促性腺激素(HCG)-β亞單羧基端肽(CTP)：HCG是由胎盤的滋養層細胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。HCG-β末端比人黃體生成素末端多37個胺基酸。常用其中的一部分融合其他蛋白，增加其半衰期(WO/2014/080401A2)。CTP蛋白具有延長融合蛋白在體內半衰期的作用，不影響被融合蛋白的生物活性，並且來源於人體，不會產生抗體。為了增加蛋白的分子量，可以在同一蛋白上融合一個或多個CTP蛋白，可在蛋白的N端融合，也可在蛋白的C端融合。有研究表明融合多個CTP也不影響蛋白的結構，且效果更好。CTP與促卵泡激素或生長激素融合的蛋白，在體內沒發現免疫性，並且與促卵泡激素融合的蛋白已經在歐洲獲得批號，融合CTP蛋白的生長激素也在進行二期實驗。常用的流式細胞儀篩選高表達細胞株的方法：直接針對分泌蛋白的：微膠滴法(Gelmicrodrops)、親和捕獲術(Affinitycapturesurfacedisplay，ACSD)、分泌捕獲技術(Secretionandcapturetechnology，SECANTTM)和冷凍捕獲法等，但這些方法不是很準確，檢測指標和是否是高表達細胞株相關性較低。流式細胞儀對於細胞分泌性蛋白檢測效果不好，而針對膜蛋白檢測效果較好。如目的蛋白協同表達某一膜蛋白，用流式細胞儀針對膜蛋白分選，則可獲得高表達細胞。IRES原件採用5』端介導翻譯機制，可以較低效率的翻譯其後面的蛋白。人CD20不在CHO細胞上表達，通過IRES元件把CD20與目的蛋白核酸序列結合，基因表達盒如附圖1所示。轉錄於同一mRNA上，所以轉錄水平是一致的，但可翻譯成不同的蛋白，目的蛋白分泌在培養液中，CD20在細胞膜上，這樣可以通過檢測CD20來評估目的蛋白的表達情況，篩選出表達量高的細胞株。屬於同一mRNA的CD20的表達量與目的蛋白表達量是線性相關的，可反應同一mRNA的翻譯情況，所以其既可以作為流式細胞儀篩選標記，同時又能反映細胞目的蛋白表達水平。本發明的優點是不受特異性抗體的限制，可以篩選目前還沒有抗體的蛋白質。鑑於此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的首要發明目的在於提出一種新型的羧基末端肽。本發明的第二發明目的在於提出一種長效白介素-7。本發明的第三發明目的在於提出該長效白介素-7的應用。為了實現本發明的發明目的，採用的技術方案為：本發明涉及一種羧基末端肽，該羧基末端肽上具有N-糖基化位點，該N-糖基化位點可設 置於羧基末端肽的任意位置，並優選設置於羧基末端肽的末端；並且，本發明的N-糖基化位點可包含所有的可構成N-糖基化位點的胺基酸序列，進一步優選的，其胺基酸序列如SEQIDNO：1所示。本發明還涉及一種如SEQIDNO：2所示的編碼權利要求1所述羧基末端肽的核苷酸序列。本發明還涉及一種重組表達載體，該重組表達載體含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本發明還涉及一種宿主細胞，該宿主細胞含有上述重組表達載體，宿主細胞為CHO細胞。本發明還涉及一種長效幹擾素，該長效幹擾素由本發明的羧基末端肽與白介素-7連接而成，該長效白介素-7的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，該白介素-7的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。該長效白介素-7的製備方法為：將編碼N糖基化修飾的羧基末端肽的核苷酸序列與編碼白介素-7的核苷酸序列連接，克隆到表達載體pcDNA5/FRT和pIRES，脂質體轉染Flp-In-CHO和CHO-K1細胞，篩選高表達的細胞株。其中，篩選高表達細胞株的方法為HygromycinB加壓篩選和流式細胞儀針對pIRES的IRES元件後表達的人CD20篩選；濃縮和純化方法為：細胞培養上清用(NH4)2SO4進行沉澱濃縮，等電點沉澱、疏水層析、離子交換、BlueSepharose6FF和分子篩s-200對樣品進行純化。本發明還涉及該長效白介素-7在製備治療腫瘤、慢性病毒性疾病、免疫性疾病或放射、化療以及移植引發的免疫系統損傷的藥物中的應用。下面對本發明的內容做進一步的說明書。人絨毛膜促性腺激素(HCG)-β亞單羧基端肽(CTP)：HCG是由胎盤的滋養層細胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。HCG-β末端比人黃體生成素末端多37個胺基酸。CTP是人絨毛膜促性腺激素亞基(hCGβ)的羧基末端肽(C-terminalpeptide，CTP)，含有四個O-糖基化位點，其中的19-30個胺基酸常被用於融合蛋白表達的CTP蛋白。本發明提出了一種全新的羧基末端肽，其胺基酸序列如SEQIDNO：1所示。編碼該多肽的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。hCGβ亞基含有145個胺基酸，109-145位胺基酸是CTP，共37個胺基酸，本發明去掉前面13個胺基酸，利用後面的24個胺基酸作為長效的CTP分子。本發明CTP在N端加上4個連接肽，與前面要表達的蛋白質的核酸相連接，在C端加上4個胺基酸為N-糖基化位點。SEQIDNO：1KAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGNGSSEQIDNO：2本發明為了增加蛋白的表達，對白介素IL-7的核苷酸進行了優化，優化後白介素IL-7核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。SEQIDNO：3Atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaaca以IL-7-CTPON為模板，通過PCR技術獲得了IL-7-CTP的核酸序列，同時在引物兩端引入與載體相匹配的酶切位點。其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示：ggGGCTAGCatgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacGGCGGTTCCTCTTCCTCTCTTAAGgg由於優化後不能從組織中使用PCR等技術獲得序列，所以本發明直接合成帶有羧基末端肽的白介素IL-7-CTPON核苷酸序列，並且在兩端合成了與表達載體相符的酶切位點，其核苷酸序列如，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示：ggGGCTAGCatgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacGGCGGTTCCTCTTCCTCTCTTAAGgg兩端下劃線為實線的部分為酶切位點和酶切位點保護鹼基，字體傾斜部分為IL-7序列，黑體部分為linker序列，而下劃線為虛線的部分為CTP蛋白，雙實現下劃線部分為增加的N糖基化位點。本發明還涉及該羧基末端肽在製備長效多肽、長效蛋白或長效細胞因子中的應用。通過O-糖基化位點和N-糖基化位點的協同作用，從而不僅可以延長與其融合的蛋白分子的半衰期，並且可增強其活性。同時在IL-7的末端融合了經過改造的CTPON蛋白，CTPON蛋白的主要功能就是延長預期融合蛋白的半衰期，並且不影響被融合蛋白的生物活性。所以本發明使用了兩種方式延長蛋白在體內的半衰期，一是增加蛋白的糖基化，二是融合長效蛋—CTPON蛋白。目前白介素-7廣泛地被認為是慢性病毒性疾病如HIV/HBV/HCV等，一些腫瘤、免疫性疾病和放射、化療以及移植等免疫系統損傷後免疫系統重構的潛在有效藥物。但普通白介素-7半衰期短，在臨床使用中給病人帶來較多的不便，而長效IL-7既可以減輕病人的痛苦，同時可以使血藥濃度保持比較平穩，有利於疾病的治療。因此白介素-7長效研究成為熱點。本發明為IL-7的長效化提供了一個全新的方式。本發明的長效白介素-7的製備方法為：1.IL-7-CTP和IL-7-CTPON載體構建及穩定細胞株篩選首先對人CTP蛋白進行改造，在其末端增加了一個N糖基化胺基酸，接著對IL-7-CTPON進行密碼子優化，參考密碼子為倉鼠密碼子表，優化方法為本專業常用手段。而後合成帶有酶切位點的IL-7-CTPON，酶切位點為：NheⅠ/NotⅠ；而後應用PCR技術獲得IL-7序列，引入酶切位點NheⅠ/NotⅠ，並與表達載體pcDNA5/FRT連接。分別構建了pcDNA5/FRT-IL-7和pcDNA5/FRT-IL-7-CTPON兩個質粒，測序確定質粒構建成功。按照本專業的常規手段，提取質粒，並純化質粒後使用脂質體轉染技術將構建的質粒和輔助質粒pOG44按照說明書以1:9的比例轉入Flp-In-CHO細胞，轉染24小時後用600ug/mlHygromycinB篩選，得到穩定表達IL-7和IL-7-CTPON的細胞株進行擴大培養。使用PCR技術將IL-7-CTPON酶切位點換成NheI和ECORI，插入pIRES載體的第一個克隆位點；將人CD20mRNA序列反向優化後合成，在其兩端引入酶切位點：XbaⅠ/NotⅠ將其插入在IRES元件後面的第二個克隆位點。克隆在DH5α菌裡後提取質粒，並測序驗證後，按照上述手段，將質粒轉染進CHO-K1細胞裡，在G418500ug/ml篩選作用後使用流式細胞儀篩選出表達量較高的細胞株，並繼續測定和放大培養。而後再使用ELISA法測定細胞表達量。2.IL-7-CTP和IL-7-CTPON蛋白純化由於IL-7-CTP和IL-7-CTPON均是糖蛋白，並且有數個糖基化位點，所以在對其進行真核表達時，可能會出現不同糖基化的蛋白，即分子量大小不一的數個蛋白，因此在純化的各階段會獲得不同的蛋白。針對本表達產物的純化使用了硫酸銨沉澱、等電點沉澱、疏水層析、BlueSepharose6FastFlow和分子篩s-200等獲得IL-7-CTP和IL-7-CTPON蛋白，獲得較純的表達產物，該產物為多種糖基化不同的蛋白構成的混合物，如附圖2所示。對IL-7-CTPON較純的產品進行westernblot檢測後，發現至少有6中不同分子量大小的糖蛋白構成，IL-7-CTP也有4種分子量大小的糖蛋白構成，如附圖6所示。本發明的有益效果為：本發明製備得到的長效白介素的半衰期得到大大延長，從而得到了一種生理活性高、體內半衰期顯著增加的長效白介素。IL-7是免疫調節和免疫增強的重要細胞因子，在免疫系統的各個階段均起作用，從骨髓基質細胞，到胸腺，再到外周血的各種效應細胞，都可見IL-7的作用。在B細胞分化的某些階段、T細胞和NK細胞的存活、發育和穩態等多方面都發揮著重要作用。因此認為IL-7是記憶T細胞產生和維持的關鍵因素之一。在體外IL-7可以刺激小鼠的T細胞增殖，也可以刺激人的外周血單核細胞增殖。本試驗通過在體外使用本實驗室表達的IL-7-CTP和IL-7-CTPON對小鼠CTLL細胞的增殖實驗，以R&D公司的原核表達的IL-7為對照產品，採用了promega的G4000測定。IL-7-RD的ED50在為0.635ng/ml，比活性為1.58×106U/mg；IL-7-CTP的ED50為0.675ng/ml，比活性為1.48×106U/mg，IL-7-CTPON的ED50為0.90ng/ml，比活性為1.11×106U/mg。以R&D公司的原核IL-7為參照，小鼠分別注射三種白介素-7，在0.5，2，6，26.2和30小時分別測定血清中白介素-7的含量，IL-7-RD的半衰期為5.79小時，MRT為8.17小時，IL-7的半衰期為17.32小時，MRT為28.12小時，IL-7-CTPON的半衰期為25.68小時，MRT為36.27小時。IL-7和IL-7-CTPON在體外促進人外周血單核細胞的增殖，經實驗檢測，本發明的IL-7-CTPON和IL-7-CTP均可以促使人外周血單個核細胞的增殖，並且在相同濃度下，IL-7-CTPON效果優於IL-7-CTP，IL-7-CTP效果又優於IL-7-RD；並且在一定濃度範圍內(<10ng/ml)可見，隨著濃度增加，效果越明顯；在三種藥物相同劑量組中可見，第五天效果比作用3天的效果明顯。表明本發明的IL-7-CTP和IL-7-CTPON的在體外具有很強的生物活 性。附圖說明圖1為IRES原件的基因表達盒示意圖；圖2為IL-7和IL-7-CTPON的page圖；圖3為IL-7和IL-7-CTPON的比活性測定；圖4為IL-7和IL-7-CTPON對人外周血單個核細胞增殖作用2天增殖情況；圖5為IL-7和IL-7-CTPON對人外周血單個核細胞增殖作用5天增殖情況；圖6為IL-7-CTPON的westernblot檢測結果。本發明的具體實施方式是對本發明的內容做進一步的解釋和說明，並不對本發明的內容構成限制。具體實施方式實施例11材料1.1主要試劑與材料IL-7-CTPON序列均由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。大腸桿菌E.Coli菌株DH5α感受態購自天根生物公司。克隆載體pMD18T購自Takara公司。T4DNA連接酶為Promega產品。Flp-In-CHO細胞、pOG44質粒和pcDNA5/FRT質粒購自Invitrogen公司(美國)IL-7-RD標準蛋白購自R&D公司；IL-7HumanELISAKit購自Abcam公司。TaqDNA聚合酶、限制性內切酶NheⅠ/HindⅢ、NotⅠ等均購自Takara公司。蛋白純化凝膠SPSepharoseFF，BlueSepharose6，S-200均購自美國GE公司。TRIZOL、RT-PCRKit、Ⅲ逆轉錄試劑盒，購自Invitrogen公司；QiagenRNeasyprotectminkit、RNasefreeDNaseset均購自Qiagen公司；Non-RadioactiveCellProliferationAssaypromegaG4000試劑盒購自Promega公司。2.方法2.1.序列優化：由於CHO細胞來源於中國倉鼠的卵巢細胞，而IL-7和CTP均來源於人，二者之間存在物種間遺傳背景的差異，因此所使用的密碼子頻率有差異，可能會因為轉運RNA的數量等不一樣，影響翻譯和表達速度。為了更好的利用倉鼠體內的轉錄、翻譯和翻譯後修飾機 制，需要對表達的IL-7-CTP進行密碼子優化，優化成小鼠偏嗜的密碼子，減少因為密碼子的不一致而影響目標的表達量。密碼子的優化通常是通過大量的測序確認需要用到的表達體系的密碼子，然後根據其密碼子偏好性，通常將需要表達的目標的密碼子的第三位進行修改，使之蛋白沒有改變，但是密碼子已經改變。本發明對IL-7的核苷酸序列的密碼子進行優化，優化後的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。序列優化後，與原序列相似性為73％，但是密碼子適應指數(codonadaptationindex，CAI)由0.68升高到1.0，有效密碼子數(effectivenumberofcodons，ENC)由54降到21，與倉鼠的密碼子更加符合，優化後GC％含量也得到提高。2.2.載體構建和單克隆篩選直接合成帶有酶切位點的IL-7-CTPON(SEQIDNO：5)，酶切位點為：NheⅠ/NotⅠ。IL-7-CTP的製備：使用PCR從IL-7-CTPON上擴增IL-7-CTP序列(SEQIDNO：4)，並引入酶切位點NheⅠ/NotⅠ；PCR體系為：PCR引物序列如表1所示：表1：Primername編號Sequence(5』—3』)FSEQIDNO:6ggGGCTAGCatgttccatgtttcttttaRSEQIDNO:7GGCTTAAGTCAttgtgggaggatcggggtPCR反應條件：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃60s)35循環，72℃7min。產物純化回收後，與pGEM-T-easy載體連接，轉化DH5α大腸桿菌，經測序鑑定正確的 質粒，用NheI和ECORI分別雙酶切質粒和pIRES載體，回收酶切下來的IL-7-CTP和載體，以T4連接酶連接後轉化DH5α大腸桿菌，經測序確認正確的菌落留存待用。小提質粒pcDNA5/FRT、IL-7-CTP和IL-7-CTPON質粒。對三種質粒分別進行雙酶切，酶切體系如表2所示：表2：試劑體積NheⅠ1ulNotⅠ2ulbuffer2.11.5ul質粒10.5ul37℃酶切過夜，膠回收酶切產物。將IL-7-CTP和IL-7-CTPON質粒與載體pcDNA5/FRT在T4連接酶連結4℃連接過夜。轉化DH5α大腸桿菌，測序確定質粒構建成功。提取質粒，純化質粒後使用脂質體轉染技術將構建的質粒和輔助質粒pOG44按照說明書以1:9的比例轉入Flp-In-CHO細胞，轉染24小時後用600ug/mlHygromycinB篩選，得到穩定表達IL-7和IL-7-CTPON的細胞株進行擴大培養。使用引物SEQIDNO:8、SEQIDNO:9從pcDNA5/FRT-frt-IL-7-CTPON上擴增IL-7-CTPON片段，獲得含有NheI和ECoRI酶切位點的IL-7-CTPON；使用引物SEQIDNO:8、SEQIDNO:10從pcDNA5/FRT-frt-IL-7-CTP上擴增IL-7-CTP片段，獲得含有NheI和ECoRI酶切位點的IL-7-CTP。引物序列圖表3所示；表3：Primername編號Sequence(5』—3』)IL-7-CTPNheISEQIDNO:8GCTAGCATGTTCCACGTGTCCIL-7-CTPECoRI1SEQIDNO:9ccgGAATTCTTATCAGGAGCCGTIL-7-CTPECoRI2SEQIDNO:10ccgGAATTCTTAttgtgggaggatc將人CD20mRNA序列反向優化後合成(CD20核苷酸序列如SEQIDNO:11所示)，在其兩端引入酶切位點：XbaⅠ/NotⅠ將其插入在IRES元件後面的第二個克隆位點。克隆在DH5α菌裡後提取質粒，並測序驗證後，將質粒轉染進CHO-K1細胞裡，經G418500ug/ml篩選作 用，將G418篩選到的CHO-K1-IL-7-CTP-IRES-CD20或CHO-K1-IL-7-CTPON-IRES-CD20表達抗G418的細胞使用PBS清洗2遍，清洗後用BD公司FITC標記的anti-humanCD20染色。每1×107細胞在250ul培養液中加入5ul抗體，在室溫孵育15分鐘，間斷性的輕微晃動，再次使用PBS清洗兩遍後，去除多餘的CD20抗體及粘附在細胞表面的抗體，上流式細胞儀分選。將選出的細胞在48孔板中培養，培養時前10小時不加G418，血清為15％，加入1％的PS防止汙染。因為流式細胞儀篩選時對細胞是有一定的損傷的，所以部分細胞會死亡。當4～5天後細胞鋪滿48孔板，一部分繼續轉入6孔板，一部分按照有限稀釋法使細胞在96孔板中單克隆化，10～14天後，對收到的單個細胞形成的克隆，轉入24孔板中培養。在24孔水平使用ELISA鑑定表達量，方法按照篩選FLP-INTM-CHO-IL-7-CTP的方法，對高表達細胞株進行凍存和擴大培養。2.3.純化條件：IL-7-CTP和IL-7-CTPON均通過以下方式純化，通過(NH4)2SO4沉澱濃縮，等電點沉澱、疏水層析、離子交換、BlueSepharose6FF和分子篩s-200對樣品進行純化，得到90％純度的IL-7和IL-7-CTPON，其SDS-PAGE電泳圖如附圖2所示。2.3.1硫酸銨溶液沉澱：緩慢加入30％硫酸銨溶液，充分攪拌，低溫攪拌過夜，離心，收集離心上清後緩慢加入硫酸銨粉末，使硫酸銨濃度達到75～85％，充分攪拌過夜，離心，收集沉澱，將沉澱用20nMPB稀釋。稀釋後在20nMPB的透析，後經超濾管濃縮。2.3.2等電點沉澱調節pH值為4.4後離心去沉澱，調節PH值為5.0，同樣離心去沉澱，調節PH值為6.0，同樣離心去沉澱。2.3.3疏水層析將上清pH調節至7.0～7.2，在0.05MPB中平衡，以0.05nMPB和1.5M的硫酸銨線性梯度洗脫、0.05MPB和1.0M硫酸銨洗脫、0.05MPB和0.6M硫酸銨洗脫。2.3.4離子交換將目的峰的洗脫液在50nMPB(PH7.0)充分平衡後再使用離子交換(BlueSepharose6)進行純化，以0.5MNaCl和50nMPB(PH7.0)到2.0MNaCl和50nMPB(PH7.0)線性洗脫。2.3.5親和層析：將目的峰在0.02MPB中平衡後，使用0.15MNaCl(pH7.2)的溶液中平衡，然後上樣，使用BlueSepharose6FF純化，起始緩衝液為(0.02MPB，0.15MNaCl，pH7.2)洗脫，待回到基線後，用bufferA(0.02MPB，2MNaCl，pH7.2)洗脫至基線。接著使用bufferB(0.02MPB，2MNaCl，50％ethyleneglycol，pH7.2)清洗至基線，重新平衡清洗純化柱以備下次使用。2.3.6分子篩s-200層析：將目的峰在0.05nMPB和0.5MNaCl中平衡後，使用分子篩S-200進行進一步純化。流速設定為20cm/h。對目的峰採用WB和ELISA等方法鑑定，最終獲得純化產物。2.4純化後的蛋白樣品進行westernblot檢測後，IL-7-CTPON發現至少有6種不同分子量大小的糖蛋白構成，IL-7-CTP有4種大小不同的糖蛋白構成，如附圖6所示；樣品送清華大學生物醫學測試中心檢測蛋白序列，鑑定目的蛋白序列正確。實施例2長效性測定Balb/c小鼠分為三組，每組6隻，分別給予IL-7-RD、IL-7-CTP和IL-7-CTPON腹腔注射(40μg/kg)，在0.5h、2h、6h、26.2h，30h小時分別取血，離心後獲得血清，應用ELISA試劑盒檢測血清中的各樣品含量。應用藥物動力學軟體DAS3.0計算小鼠體內的藥代動力學參數如表4所示。表4：實施例3比活性的測定每個細胞孔中加入50ul10％FBS的1640培養基，向第一列孔中加入50ul40ng/ml的IL-7-CTP或IL-7-RD培養液，充分混勻後，取50μl加入後一孔，按照上述步驟，將IL-7倍比稀釋加入到第十一孔，從第十一孔中取出50μl拋棄。每孔中加入50ul1×106細胞，孵育36小時後加入15ulMTT，4小時後加入100ul溶解/終止反應液，過夜等結晶紫完全溶解後在570nm波長檢測各濃度吸光值，根據吸光值大小畫出曲線，從曲線中計算ED50，1/ED50即為比活性，如附圖3所示。IL-7-RD的ED50在為0.635ng/ml，比活性為1.58×106U/mg；IL-7-CTP的ED50為0.90 ng/ml，純度為83.2％時的比活性為1.11×106U/mg，IL-7-CTP的ED50為0.70ng/ml，比活性為1.43×106U/mg。實施例4PHA-P活化後，IL-7刺激健康人PBMC增殖作用按照常規方法分離人外周血單個核細胞，使用羧基螢光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺酯(CFSE)染色。將一份使用PHA-P5μg/ml的量活化2天，使用含3％FBS的PBS清洗兩遍，進行CFSE染色。向圓底96孔板中加入含有不同濃度的IL-7-RD、IL-7-CTP和IL-7-CTPON的培養液，濃度分為0、1.25、2.5、5、10、20ng/ml共六個梯度，每個梯度2個復孔。每孔加入1×105個PBMC細胞，細胞培養72小時後，使用流式細胞儀檢測細胞增殖情況，如附圖4所示(柱狀圖從上倒下依次為P9、P8、P7、P6、P5、P4)。將另一份PBMC細胞使用PHA-P5μg/ml的量活化2天，使用含3％FBS的PBS清洗兩遍，進行CFSE染色。向圓底96孔板中加入含有不同濃度的IL-7-RD、IL-7-CTP和IL-7-CTPON的培養液，濃度分為0、1.25、2.5、5、10、20ng/ml共六個梯度，每個梯度2個復孔。每孔加入1×105個PBMC細胞，細胞培養5天後，使用流式細胞儀檢測細胞增殖情況，如附圖5所示(柱狀圖從上倒下依次為P9、P8、P7、P6、P5)。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp