一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε-聚賴氨酸的方法

2023-05-11 13:35:21 1

專利名稱：一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε-聚賴氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε -聚賴氨酸的方法，具體地說是指通過PH值控制和流加發酵的方法，利用葡萄糖和甘油共同作碳源高效發酵生產 ε -聚賴氨酸，屬於發酵工程領域。
背景技術：
ε -聚賴氨酸(ε -PL) 一般是由25 ；35個L_賴氨酸的α -COOH和ε -ΝΗ2相互縮合而形成的L-賴氨酸聚合物，分子量在3500 4500Da。ε -PL只能由微生物合成， 且ε-PL產生菌僅分布於鏈黴菌屬和北裡孢菌屬。目前，ε-PL主要作為食品防腐劑，廣泛用於澱粉質類食品防腐。ε -PL作為一種新型食品防腐劑，相比於傳統化學防腐劑和生物防腐劑，具有更廣的抑菌譜(有效抑制G+、G-、酵母菌和黴菌等)、更好的水溶性、更強的熱穩定性(100°C，30min或120°C，20min)和更廣的pH適用範圍(等電點為pH9.0左右)等；同時，ε-PL的添加不會影響食品風味。更為重要的是，ε-PL具有較高的安全性 ADME (Absorption, Distribution, Metabolism and Excretion)實驗證實 ε-PL 很難被生物體的腸胃吸收且急性口服劑量達5g/kg。因此，ε-PL是一種安全、高效的新型生物防腐齊U。事實上，ε -PL早在1980s即被日本允許作為食品防腐劑使用；隨後，韓國也批准ε -PL 在食品中添加；2003年，ε -PL獲得美國FDA認證(GRN000135)，並開始進入美國和歐洲市場。另外，ε-PL作為高分子聚合物前體，具有較高的生物相容性和特異陽離子性，被廣泛用作生物可降解材料、乳化劑、高吸收性水凝膠、藥物載體、抗癌增進劑和生物晶片外被等領域研究和應用。因此，ε-PL具有廣闊的市場應用前景。然而，國際上只有日本窒素公司 (Chisso Corporation)實現了 ε-PL工業化發酵生產且已形成年產千噸級的規模。ε-PL 在國內的研究，大多處在實驗室和中試開發階段且發酵水平較日本差距較大。所以，建立 ε-PL高效發酵工藝提高ε-PL發酵產量和生產強度，對於建立我國ε-PL產業具有重要意義。葡萄糖是發酵生產ε -PL普遍採用的碳源。巖田敏治等人(CN 1260004Α)利用改造後的小白鏈黴菌Iysinopolymerus亞種11011Α-1 (FERM BP-1109)轉化葡萄糖合成大量 ε-PL0徐虹等人(CN 101509021Α)利用細胞固定化方法培養北裡孢菌PL6-3，以葡萄糖作碳源發酵生產ε -PL。賈士儒等人(CN 101671703A)利用葡萄糖作碳源並流加L-賴氨酸發酵生產ε-PL。雖然ε-PL產生菌能夠快速利用葡萄糖合成菌體和ε-PL，但ε-PL產量和底物轉化率不高，並且在補料階段由於葡萄糖溶解度以及流加方式的限制，會引起發酵液稀釋並導致ε-PL濃度降低，從而增加了後提取成本和廢水處理負荷，最終引起ε-PL生產成本的增加。最近，我們提出了利用工業甘油作碳源發酵生產ε -PL的方法 001110250123.7)。該方法與以葡萄糖作碳源相比，儘管顯著提高了 ε-PL發酵產量和底物轉化率，但發酵時間較長，從而導致生產強度較低。
葡萄糖和甘油都是ε -PL產生菌最適碳源(Shima S, Sakai H. Agric Biol Chem 1981,45 :^97-250 。以葡萄糖為唯一碳源時，ε-PL產生菌的發酵速度快，但ε-PL產量低，葡萄糖轉化率低。以甘油為唯一碳源時，轉化率高，ε-PL產量高，但發酵速度慢。然而，我們研究發現簡單的將葡萄糖和甘油混合共同作為碳源用於ε -PL發酵卻並不能有效提高ε-PL發酵水平。其關鍵在於，如何確定最合適的葡萄糖和甘油混合比例？如何保證發酵中後期的葡萄糖和甘油比例維持在最佳水平以及如何控制發酵過程合適PH值？基於此，本發明在考察了葡萄糖和甘油混合比例的基礎上，結合葡萄糖和甘油流加策略保持發酵中後期總碳源濃度維持在較低水平的方法以及PH值控制策略，建立了一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε-聚賴氨酸的方法。

發明內容
本發明的主要目的是提供一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε -聚賴氨酸的方法，提高ε -PL發酵產量和生產強度，從而降低生產成本。本發明採用的技術方案如下利用ε -PL產生菌培養20 30h的種子液，接種葡萄糖和甘油混合碳源的培養基，在初始PH 6. 5 7. 0、溫度為28 32°C、溶氧保持在15 40%的培養條件下，採用pH 值調控策略和流加發酵方法生產ε -PL。本發明所指的起始發酵培養基由葡萄糖、甘油、酵母膏、(NH4) 2S04、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、和 FeSO4 · 7H20 組成。最優配方為葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4Jg/ L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7Η20，0· 05g/L。本發明所指的pH值調控策略是當發酵起始pH值下降至3. 0 4. 5時，用氨水等鹼性液體或液氨控制PH穩定在3. 0 4. 5，並保持到發酵結束。本發明所指的流加發酵法是在ε -PL發酵過程中，當甘油濃度低於2 3g/L時， 流加甘油，直到甘油濃度達到5 7g/L ；流加或不流加葡萄糖，控制發酵液中葡萄糖濃度為 0 7g/L。如採用葡萄糖流加策略，則在葡萄糖濃度低於2 3g/L時開始流加500g/L 800g/L葡萄糖；當(NH4)2SO4濃度低於1 2g/L，流加(NH4)2SO4,直到(NH4) 2SO4濃度達到 5 10g/L。與葡萄糖、甘油為單一碳源發酵牛產ε-PL方法相比，本發明所示的葡萄糖和甘
ε -PL m^m^^nt^ 1、提高了 ε-PL發酵產量。利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε-PL能夠明顯提高ε "PL發酵產量，比葡萄糖作單一碳源提高46%，比甘油作單一碳源提高17%。2、提高了 ε -PL發酵生產強度。利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε "PL能夠顯著縮短發酵時間，分別比葡萄糖和甘油作單一碳源縮短25%和33% ； ε -PL生產強度分別提高了 63%和17%。
具體實施例方式根據下列實施例，可以更好地理解本發明。實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件以及結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權力要求書中所詳細描述的本發明。
^MM 1 現有工藝-葡萄糖單一碳源補料-分枇發酵牛產ε -PL在裝有3. 25L發酵培養基的5L發酵罐中(培養基葡萄糖，50g/L ； (NH4) 2S04，IOg/ L ；酵母粉，5g/L ；MgSO4,0. 5g/L ；ZnSO4,0. 04g/L ；FeSO4,0. 03g/L ;Κ2ΗΡ04，0· 8g/L ；KH2PO4, 1. 36g/L)，接種0. 25L ε -PL產生菌的20 30h種子培養液，在初始pH 6. 8、溫度為30°C、 溶氧保持在30%的培養條件下發酵。當pH值自然下降到4. 0左右，流加25%氨水維持該 PH值至發酵結束。在發酵後期，流加800g/L葡萄糖和80g/L (NH4) 2S04，使葡萄糖維持在IOg/ L左右。培養168h, ε -PL產量達到24g/L,生產強度為3. 86g/L/d。^MM 2 現有工藝-甘油單一碳源補料-分枇發酵牛產ε -PL在裝有3. 25L培養基的5L發酵罐中(甘油培養基甘油，60g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ； 酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 ·7Η20，0· 8g/L ；FeSO4 ·7Η20，0· 05g/L)，接種 0. 25L ε -PL 產生菌的20 30h種子培養液，在初始pH 6. 8、溫度為30°C、溶氧保持在30%的培養條件下發酵。當PH值自然下降到3.5，流加10 25%氨水維持pH至發酵36h，隨後，用10 25%氨水使pH緩慢升至3. 8，保持到發酵結束。當發酵後期甘油濃度低於5g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達到15g/L ；當(NH4)2SO4濃度低於5g/L，流加(NH4)2SO4,直到(NH4)2SO4濃度達到10g/L。培養168h，g-PL產量達到30. llg/L，生產強度為4. 18g/L/d。^MM 3 葡萄糖和甘油、混合碳源分枇發酵牛產ε -PL在裝有3. 25L培養基的5L發酵罐中(培養基組成葡萄糖，50g/L ；甘油，10g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7H20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產生菌的20 30h種子培養液，在初始pH 6. 0、溫度為38°C、溶氧保持在40%的培養條件下發酵。當pH值自然下降到3. 0，流加10 25%氨水維持pH恆定至發酵結束。培養40h, ε -PL產量達到6. 29g/L,生產強度為3. 86g/L/d。實施例4:葡萄糖和甘油混合碳源分批發酵生產ε-PL在裝有3. 25L培養基的5L發酵罐中(培養基組成葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產生菌的20 30h種子培養液，在初始pH7. 5、溫度為30°C、溶氧保持在 15%的培養條件下發酵。當pH值自然下降到4. 5，流加10 25%氨水維持pH恆定至發酵結束。培養34h，ε -PL產量達到6. 34g/L，生產強度為4. 54g/L/d。實施例5 葡萄糖和甘油混合碳源分批發酵生產ε -PL在裝有3. 25L培養基的5L發酵罐中(培養基組成葡萄糖，15g/L ；甘油，45g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產生菌的20 30h種子培養液，在初始pH6. 8、溫度為35°C、溶氧保持在 30%的培養條件下發酵。當pH值自然下降到3. 8，流加10 25%氨水維持pH恆定至發酵結束。培養38h，ε -PL產量達到6. 44g/L，生產強度為4. 13g/L/d。實施例6 葡萄糖和甘油混合碳源補料-分批發酵生產ε -PL在裝有3. 25L培養基的5L發酵罐中(培養基組成葡萄糖，30g/L ；甘油，30g/L ； (NH4)2SO4,15g/L ；酵母膏，10g/L ；KH2PO4,4g/L ；MgSO4 · 7Η20，0. 8g/L ；FeSO4 · 7H20，0. 05g/L)， 接種0. 25L ε -PL產生菌的20 30h種子培養液，在初始pH6. 8、溫度為30°C、溶氧保持在 30%的培養條件下發酵。當pH值自然下降到3. 8，流加10 25%氨水維持pH恆定至發酵結束。在發酵過程中，當葡萄糖濃度低於2 3g/L時，流加500g/L 800g/L葡萄糖，直到葡萄糖濃度達到 8g/L ；當甘油濃度低於2 3g/L時，流加甘油，直到甘油濃度達到 7 8g/L;當(NH4)2SO4濃度低於2g/L，流力口 (NH4)2SO4,直到(NH4) 2S04濃度達到5g/L。培養 174h，ε -PL 產量達到 35. 14g/L，產率為 4. 85g/L/d。
權利要求
1.一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε -聚賴氨酸的方法，其特徵在於ε-聚賴氨酸產生菌以葡萄糖和甘油混合物為碳源，在初始PH 6. 0 7. 5、溫度為25 38°C、溶氧保持在15 40%的培養條件下發酵生產ε-聚賴氨酸；當ε-聚賴氨酸開始合成時，採用PH值調控策略和流加補料發酵法，達到提高ε -聚賴氨酸發酵產量和生產強度，降低生產成本和減少廢水量的目的。
2.如權利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε_聚賴氨酸的方法，其特徵在於所述混合碳源是指葡萄糖利甘油共同存在形成的混合物；或在發酵部分階段單獨使用葡萄糖或甘油作為碳源而後又流加另一種碳源(甘油或葡萄糖)形成的混合物。
3.如權利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε_聚賴氨酸的方法，其特徵在於發酵起始階段控制發酵罐中葡萄糖濃度為80 40g/L，在發酵中後期流加或不流加葡萄糖，控制葡萄糖濃度在0 7g/L。
4.如權利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε_聚賴氨酸的方法，其特徵在於發酵起始階段控制發酵罐中甘油濃度為0 80g/L，在發酵後期甘油濃度低於 2 3g/L時，開始流加甘油，直到其濃度達到5 7g/L。
5.如權利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε_聚賴氨酸的方法，其特徵在於採用PH值控制策略當發酵起始ρΗ值下降至3. 0 4. 5時，用氨水等鹼性液體或液氨控制PH穩定在3. 0 4. 5，並保持到發酵結束。
6.如權利要求1所述的利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε_聚賴氨酸的方法，其特徵在於採用(NH4)2SCV流加發酵方法發酵起始(NH4)2SO4濃度為5 20g/L，當(NH4)2SO4 濃度低於1 2g/L，流加(NH4)2SO4溶液，直到(NH4)2SO4濃度達到5 10g/L。
7.如權利要求4所述的混合碳源，在發酵初始階段發酵罐中甘油濃度的極值為Og/L， 此時葡萄糖為發酵初始階段的唯一碳源。
全文摘要
本發明涉及到一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發酵生產ε-聚賴氨酸的方法採用葡萄糖和甘油共同作為碳源，結合流加發酵方法和pH控制策略生產ε-聚賴氨酸。利用本發明建立的發酵工藝，比葡萄糖單獨作碳源的ε-聚賴氨酸發酵產量提高40％以上；比甘油單獨作碳源的ε-聚賴氨酸發酵產量提高20％以上。本發明改變了現有ε-聚賴氨酸生產方法，顯著提高了ε-聚賴氨酸的發酵產量和生產強度。
文檔編號C12P13/02GK102352386SQ20111027432
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月16日 優先權日2011年9月16日
發明者唐蕾, 張宏建, 張建華, 李樹, 毛忠貴, 陳旭升 申請人:江南大學