檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法

2023-05-11 14:00:51

專利名稱：：檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法
技術領域：
：本發明涉及人泌尿生殖道分泌物中病原體的檢驗，尤其涉及一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法。技術背景隨著我國對外開放程度的逐步加深，加上社會上有些人受到"性自由"思想的影響和對性傳播疾病的無知，在一些開放城市和經濟發達地區陸續出現了新的性病患者，加之當今各地之間的人員流動非常頻繁，性病的發生及傳播呈愈演愈烈之勢。如2004年全國31個省(直轄市、自治區)共累計報告性病(HIV/AIDS除外)809，550例，較上一年就上升了10%。2004年全國性病疫情分析報告顯示，淋病奈瑟氏球菌(簡稱淋球菌，NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)已成為三種主要的導致性病的病原體。對本市部分就診者的檢測顯示，合併2種或3種病原體感染的患者正在逐年增加。性傳播疾病對人類健康的危害性很大。特別是對青年人，後果更為嚴重，有的會導致終身的健康問題，包括不孕、不育、慢性疼痛以及增加感染愛滋病的危險，對人們的身心健康和家庭社會構成了嚴重的威脅。對性傳播疾病實行早期監測和診斷，是性病防治工作中的一個重要組成部分，對於提高性病治癒率，縮短病程和傳染期，控制和消滅傳染源，阻止性疾病的蔓延有著重要的作用。目前對淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體的檢驗方法主要有塗片檢査，細菌和細胞培養、血清學試驗和PCR法。塗片檢查是檢測淋球菌的主要方法，但尿道分泌物的狀態會影響檢測的敏感度；細菌和細胞培養是將標本接種於合適的培養基或細胞，使其擴增，並進一步作出鑑定。培養法特異性高，能檢出病人分泌物內活的病原體，結合藥敏試驗能作為藥物療效的判斷，過去常作為檢測的金標準。但由於受專業化技術、試劑、設備、周期長等因素的影響，目前臨床一般不採用，僅在科研單位進行科研活動，或作為新診斷試劑方法學評價的金標準；血清學試驗可以提供快速診斷，曾被認為是一種理想的診斷方法，但因為敏感性和特異性不夠高，進口抗體的昂貴价格而不能用於過篩實驗；PCR法用於感染早期的病原體診斷，己逐漸成為病原體檢測的新寵。PCR法操作簡單、耗時較少、靈敏度高，理論上只要有一個拷貝便可被檢出。但是作為高度敏感的擴增實驗，操作不當極易造成汙染而出現假陽性的結果。近年來出現的實時螢光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它基本解決了過去實驗過程因汙染出現的假陽性。實時螢光定量PCR是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號累積實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時螢光定量PCR技術中，特異性螢光探針的選擇和設計是至關重要的。它是把螢光化合物標記到特異性的寡核苷酸上形成螢光標記的DNA探針，通過探針與PCR產物特異性的結合，在PCR過程中可對產物實現均相、實時、定量檢測。根據螢光基團標記和實現能量共振轉移方式的不同，螢光PCR所用的探針可以分為五大類，分別是Taqman探針，分子信標，光標記引物，雜交探針，DNA-RNA-DNA嵌合探針。在實時螢光定量PCR技術中，定量PCR儀的發展是另一決定因素。多色多通道檢測是當今的主流趨勢，多通道指可同時檢測一個樣品中的多種螢光，使得在單管內可同時檢測多模板。目前，在大部分醫院都具有多通道的螢光PCR儀。此外，為滿足多色多通道檢測的需求，目前已開發了包括FAM，TET，VIC，HEX等近十種的螢光基團。但是，目前幾乎所有臨床上使用的都是單檢PCR產品，一次只能檢測出一種病原體，不利於對混合感染的檢測，而且操作過程相對費時，成本高。
發明內容本發明要解決的技術問題之一是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物。本發明要解決的技術問題之二是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的探針。本發明要解決的技術問題之三是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的方法。本發明要解決的技術問題之四是提供一種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物，包括以下引物對中的至少一對(1)用於擴增淋病奈瑟氏球菌靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO:1的至少15個連續核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:2的至少15個連續核苷酸；(2)用於擴增解脲支原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO:3的至少15個連續核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:4的至少15個連續核苷酸；(3)用於擴增沙眼衣原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO:5的至少15個連續核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO:6的至少15個連續核苷酸。較佳地，所述引物對至少包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2;禾口/或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;禾口/或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。在本發明的另一方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的探針，包括至少以下的一種寡核苷酸序列(1)與上述引物對擴增的淋病奈瑟氏球菌的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:7或其互補序列的至少15個連續核苷酸；(2)與上述引物對擴增的解脲支原體的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:8或其互補序列的至少15個連續核苷酸；(3)與上述引物對擴增的沙眼衣原體的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:9或其互補序列的至少15個連續核苷酸。較佳地，所述探針至少包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9中的一種寡核苷酸序列。在本發明的另一方面，提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的方法，包括以下步驟-(1)提取核酸樣本；(2)用至少一對上述的引物序列，以步驟(l)提取的核酸為模板，擴增病原體的耙核酸序列；(3)檢測擴增產物，並分析結果。較佳地，所述步驟(2)中還包括加入能與步驟(2)所用引物對擴增的靶核酸序列進行雜交的探針序列。在本發明的另一方面，還提供了一種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒，包括至少一對本發明所述的引物序列。較佳地，所述試劑盒還包括至少一種本發明所述的探針序列，該探針序列與所含引物序列擴增的耙核酸序列進行雜交。更佳地，所述試劑盒包含以下引物和探針組合中的至少一種組合(1)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:7;(2)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;(3)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:9。在本發明中，術語"引物"是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發合成與核酸鏈互補的引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉錄酶)存在下，在一種合適的緩衝液中並在合適的溫度下進行上述合成。優選的引物是單股寡脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決於該引物的設計用途，但一般在1525個核苷酸之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩定的雜交複合物。引物不必反應模板的準確序列，但必須充分互補，以與模板雜交並引發DNA合成。在本發明中，術語"探針"是指能識別特異核苷酸序列的帶標記的一段單鏈DNA或RNA分子，它只與被檢測的特定核苷酸序列結合。探針位置儘可能地靠近上遊引物。為保證結合特異性，探針的合適長度一般在1545個核苷酸之間。由於採用上述技術方案，本發明的檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法，可以在一個反應管內同時檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)三種不同的病原體，不僅提高性傳播疾病的早期檢出率，而且減少醫務人員的操作時間，降低成本，並減輕病人經濟負擔。圖1是本發明檢測的淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種病原體的電泳圖；圖2是本發明單獨檢測淋病奈瑟氏球菌的螢光定量PCR圖；圖3是本發明單獨檢測解脲支原體的螢光定量PCR圖；圖4是本發明單獨檢測沙眼衣原體的螢光定量PCR圖；圖5是本發明同時檢測淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種病原體的螢光定量PCR圖。具體實施方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)的引物、探針序列及方法1.淋病奈瑟氏球菌的引物和探針根據淋病奈瑟氏球菌的靶核酸序列(GenbankAcession:M10316)，選擇合適的區域設計引物與探針，共設計了兩組引物和探針，經過實驗比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下NG-Fl:5'-GCTACGCATACCCGCGTTGC-3'(SEQIDNO:1，位於靶序列3141-3160bp)NG-Rl:5'-CGAAGACCTTCGAGCAGACA-3'(SEQIDNO:2，位於靶序列3531-3512bp)NG-Fl，NG-Rl的擴增產物長391bp(見圖1),對應於靶序列的隱蔽質粒區。雜交探針NG-PI:FAM-5'-CTGTTTMGTCGTCCAGCTCGTTC-3'-BHQ1(SEQIDNO:7，位於耙序列3251-3275bp)經檢測，NG-F1、NG-R1、NG-PI檢測的靈敏度能達到E3水平(見圖2)。2.解脲支原體的引物和探針根據解脲支原體的靶核酸序列(GenbankAcession:X51315),選擇合適的區域設計引物與探針，共設計了兩組引物和探針，經過實驗比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下UU-Fl:5'-CAGGTAAATTAGTACCAG-3'(SEQIDNO:3，位於靶序列543-560bp)UU-R1:5'-ACGACGTCCATAAGCAACT-3'(SEQIDNO:4，位於靶序列757-739bp)UU-F1，UU-R1的擴增產物長215bp(見圖l)，位於尿酶基因區。UU-Pl:HEX-_CCGTCCTATCCAAGTTGGATCACA-B即(SEQIDNO:8，位於耙序列643-666bp)經檢測，UU-F1、UU-R1、UU-P1檢測的靈敏度能達到E3水平(見圖3)。3.沙眼衣原體的引物和探針根據沙眼衣原體的靶核酸序列(GenbankAcession:CP000052)，選擇合適的區域設計引物與探針，共設計了兩組引物和探針，經過實驗比較，選擇了其中的一組，具體的序列如下CT-Fl:5'-CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3'(SEQIDNO:5，位於靶序列604-624bp)CT-Rl:5'-TCCTCAGAAGTTTATGCACT-3'(SEQIDNO:6，位於耙序列803-784bp)CT-F1，CT-R1的擴增產物長200bp(見圖1)，對應於耙序列的隱蔽質粒區。CT-PI:ROX-5'-GAGAGAACGTGCGGGCGATTTGC-3'-BHQ2(SEQIDNO:9，位於耙序列688-711bp)經檢測，CT-F1，CT-R1，CT-P1檢測的靈敏度能達到E3水平(見圖4)。4.引物合成及純化方法合成方法是固相亞磷酸三酯法進行化學DNA合成，純化方法為聚丙烯醯胺凝膠電泳，引物在使用前經稀釋後，使用紫外分光光度計進行檢測、重定量，確保其A260/A280〉1.7。5.探針合成及純化方法探針合成採用兩步法，第一步用亞磷酸三酯法將R印orter連接於DNA的5'端。第二步是採用Postlink方法將NHS活化酯化的Quencher連接上去(R印orter可用FAM，HEX，TET等；Quencher採用TAMRA，BHQ1,BHQ2等，可修飾於3'端或DNA中間)。因考慮到螢光染料在鹼性環境中不穩定，採用的合成單體為Fastamidite，以保證螢光的穩定性。探針純化方法採用的是PAGE凝膠電泳法基礎上的HPLC純化，第一步是在Postlink連接Quencher之前，用PAGE將大部分的雜質去掉，特別是將可能會與Quencher連接形成副產物的雜質去掉，這有助於Quencher連接效率的提高和後面的純化工作；第二步是在連接了Quencher之後再用PAGE電泳在一定條件下將其它雜質除去，以獲得比較高純度的產品；第三步即過dHPLC進行純化，對於純化後產品將檢驗其出峰位置及純度，再用紫外分光光度計在260nm波長下定量。探針在使用前經稀釋後，使用紫外分光光度計進行檢測、重定量，確保其A260/A280〉1.7。6.其他材料純化水符合《中國生物製品主要原輔材料質控標準》要求，Hot-Start酶由超生生物公司提供、dNTP(dATP:dCTP:dGTP:dUTP=25mM:25mM:25mM:25mM)、UNG酶由普洛麥格公司提供。所有化學試劑為分析純或分析純以上級別，所有試劑均檢驗合格。7.對照品(1)陰性對照品純化水。替代試驗檢驗合格。(2)陽性對照品已知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質粒DNA溶液。8.檢測方法本發明應用多重PCR螢光原理，在同一反應管內同時檢測淋球菌、解脲支原體、沙眼衣原體，在同一反應管內加入各自的引物與探針，由於三種探針的5'端分別標記不同波長的報告螢光，PCR反應進行時，不同的報告螢光基團釋放螢光，螢光測定儀器分別讀取三種波長的螢光信號進行分析，使三種病原體的檢測在一次實驗中完成。對反應的條件進行優化，最終確定的反應體系及反應條件如下(1)多重螢光PCR反應體系(選用40pL反應體系)40|nL反應體系中含有2.5pL10XPCRreactionbuffer(Mg2+free),3mmol/LMg2+，0.125mmol/LdNTP，0.25nmol/LNG_F，0.25網ol/LNG-R，0.125|iimol/LNG-P，0.25pmol/LUU-F，0.25pmol/LUU-R，0.156|mnol/LUU-P，0.25|umol/LCT_F，0.25)nmol/LCT-R，0.3125pmol/LCT-P，Hot-Start聚合酶2U，UNG酶0.2U，，模板量為3pL，補充水至40pL。(2)多重螢光PCR擴增條件PCR擴增條件確定為42°C5分鐘、95。C15分鐘預變性；95°C15秒、60°C60秒；37°C恆溫。採用的PCR儀為ABIPRISM7000PCR螢光檢測儀，選定檢測螢光為FAM，HEX,ROX通道，並在PCR循環第二步60°C時收集螢光信號。儀器檢測通道選擇通道l，2，4;其它為默認值。檢測結果如圖5所示，在圖5中，三條上升的曲線中最上面一條曲線代表NG，中間的第二條曲線代表UU，第三條曲線代表CT。根據樣品、陽性對照、陰性對照及臨界對照的Ct值確定樣品中是否存在三種病原體的DNA，從而判定病人的病原體感染情況。實施例2檢測淋病奈瑟氏球菌(NG)、解脲支原體(UU)、沙眼衣原體(CT)的試劑盒的製備1.本發明試劑盒所採用的原材料(1)引物及探針本發明的引物及探針由上海生工生物工程技術服務有限公司負責合成。(2)其他材料純化水符合《中國生物製品主要原輔材料質控標準》要求，Hot-Start酶由超生生物公司提供、dNTP(dATP:dCTP:dGTP:dUTP=25mM:25mM:25mM:25mM)、UNG酶由普洛麥格公司提供。所有化學試劑為分析純或分析純以上級別，所有試劑均檢驗合格。(3)對照品1)陰性對照品純化水。替代試驗檢驗合格。2)陽性對照品己知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質粒DNA溶液。2.檢測方法(1)標本裂解、從存有分泌物懸濁液的離心管中取樣300^1於0.5ml離心管中，15000rpm離心10分鐘，棄上清；加入裂解緩衝液50^1。於IO(TC加熱IO分鐘，15000rpm離心5分鐘，取3^1上清進行PCR反應。要注意，裂解後的標本應保存在-2(TC，如結果有疑問，應取出重複檢測，直至有了明確的結果後才可丟棄。每次重複實驗前，都要將裂解標本離心(13000rpm，5分鐘)後取用。(2)PCR反應試劑的製備1)引物及探針的製備引物，探針均為50D/管，將裝有引物或探針的1.5ml離心管13000rpm離心數秒，使引物乾粉聚集於管底，加入500|til純化水，振蕩混勻後靜置10分鐘，探針需要避光靜置，使之充分溶解，13000rpm離心數秒。2)IOO人份三聯檢PCR反應液的製備取4ml10Xbuffer，0.2ml25畫1/LdNTP，0.2ml50nmol/LNG-F，0.2ml50^imol/LNG-R，0.lml50|umol/LNG-P，0.2ml50pmol/LUU-F，0.2ml50nmol/LUU-R，0.125ml50,ol/LUU-P，0.2ml50^mol/LCT-F，0.2ml50^imol/LCT-R，0.25ml50,ol/LCT-P，用純化水定容至35ml，充分混勻。3)反應液的質控用待檢的反應液檢測陰性內控品、陽性內控品，靈敏度內控品，檢測結果符合陰性內控品的CT值大於38或無CT值，陽性內控品CT《28，靈敏度內控品CT=2933，則為合格。(3)Hot-start聚合酶和UNG酶混合液(含0.5U/|iilHot-star聚合酶和0.05U/|nlUNG酶)的製備和質控分別取2500UHot-start聚合酶、250UUNG酶混合，配備5ml酶溶液。替代試驗合格。(4)裂解緩衝液的製備取1MTris-HC1(pH8.0)溶液10ml，0.5MEDTA(pH8.0)2.0ml，5MNaCl20ml，10%TritionX-100100ml,補加純化水定容至1000ml，充分混勻後高壓滅菌。替代試驗合格。(5)對照品的製備1)陽性對照品的製備和質控取含已知濃度的NG、UU、CT病原微生物質粒DNA溶液，用TE稀釋，用企業內控品測定陽性對照品CT《28。2)臨界對照品的製備取已知濃度的NG、UU、CT病原微生物菌液，用純化水稀釋10倍。用企業內控品測定臨界對照品CT<36。(6)半成品檢定用企業內控品檢定。1)特異性檢定取8份臨床確診為NG、UU、CT均為陰性的標本作為陰性(特異性)參考品並進行PCR試驗，操作嚴格按照試劑盒說明書進行——陰性符合率應為100%，為合格。2)準確性檢定取臨床確診為NG、UU、CT均為陽性的標本各3份作為準確性參考品，進行PCR試驗，操作嚴格按照試劑盒說明書進行——陽性符合率應100%，3)靈敏度檢定用高滴度(107copies/ml濃度用相關的檢測標準品標定)的臨床標本以10倍的梯度逐級稀釋至103copies/ml，取103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml作為企業內控敏感性參考品或已經定量的標準株103copies/ml、104copies/ml、105copies/ml、106copies/ml作為敏感性參考品。取103copies/ml滴度的淋病奈瑟氏球菌，解脲支原體，沙眼衣原體混合，作為三檢試劑的臨界參考品，檢測結果CT符合CT二3236。4)精密度檢定用1份臨界對照，重複做10次，CT值變異係數不得大於15%。(7)分裝、貼籤、包裝1)分裝用微量移液器將準備好的試劑分裝入清潔的離心管中，蓋緊管蓋，裝量如表1所示表l成份標識量(pl)實際分裝量&1)PCR反應液840900裂解緩衝液12001200Hot-start聚合酶+UNG酶4850陰性對照200200臨界對照200200陽性對照20202)貼籤'將檢驗合格的標籤，貼在相應的離心管上。3)包裝按照試劑盒的組成成份，將相應的離心管插入盒內襯上，裝入盒中，放入說明書，封口。試劑盒組裝要求如下表2所示表2tableseeoriginaldocumentpage193.試劑盒成品檢定(1)外觀檢定檢定方法目測。檢定標準試劑盒包裝完整無缺，並附有說明書；各試劑組分齊全、試劑分裝量符合組成要求。(2)特異性檢定、準確性檢定、靈敏度檢定、精密度檢定同半成品檢定。4.保存及有效期在-2(TC保存條件下，自檢定合格之日起有效期為6個月。5.試劑盒使用說明本發明的試劑盒採用核酸擴增技術結合螢光標記探針雜交方法對NG、UU、CT的DNA進行定性檢測。使用方法(1)試劑準備按標本的數量和所需的對照數量配製反應體系，存於4。C。(2)標本裂解從存有分泌物懸濁液的離心管中取樣300nl於0.5ml離心管中，15000rpm離心10分鐘，棄上清；加入裂解緩衝液50^1。於IO(TC加熱10分鐘，15000rpm離心5分鐘，取3|il上清進行PCR反應。(3)加樣在準備好的PCR反應液中分別加入裂解標本上清液或定標品。(4)PCR反應按說明設定程序，在螢光PCR儀上進行擴增。保存於-2(TC保存，在有效期內使用。序歹U表〈110〉上海申友健海生物技術有限責任公司檢測人泌尿生殖道病原體的引物、探針及方法〈130〉NP-07-115579〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1<211〉20腿〈213〉人工序列〈220〉引物〈400>1gctacgcatacccgcgttgc20〈210〉2〈211〉20腿人工序列〈220>〈221>misc—feature〈223>引物<400〉2cgaagaccttcgagcagaca20〈210〉3<211〉18〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<221〉misc一feature<223〉引物〈400〉3caggtaaattagtaccag18〈210〉4misc—feature〈223>引物<400〉4acgacgtccataagcaact19〈210〉5<211〉21〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉misc—feature引物〈400〉5ctaggcgtttgtactccgtca21620〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈221>misc—feature引物〈400〉6tcctcagaagtttatgcact20724〈212>腿〈213〉人工序列〈400〉7ctgtttaagtcgtccagctcgttc24<210〉8〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8ccgtcctatccaagttggatcaca24<210〉9〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9gagagaacgtgcgggcgatttgc2權利要求1.一種檢測人泌尿生殖道病原體的引物，其特徵在於，包括以下引物對中的至少一對(1)用於擴增淋病奈瑟氏球菌靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO1的至少15個連續核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO2的至少15個連續核苷酸；(2)用於擴增解脲支原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO3的至少15個連續核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO4的至少15個連續核苷酸；(3)用於擴增沙眼衣原體靶核酸序列的引物對，其第一引物序列含有SEQIDNO5的至少15個連續核苷酸，其第二引物序列含有SEQIDNO6的至少15個連續核苷酸。2.如權利要求l所述的引物，其特徵在於，所述引物對至少包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:2;禾口/或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4;和/或SEQIDNO:5、SEQIDNO:6。3.—種檢測人泌尿生殖道病原體的探針，其特徵在於，該探針包括至少以下的一種寡核苷酸序列(1)與權利要求1所述引物對擴增的淋病奈瑟氏球菌的耙核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:7或其互補序列的至少15個連續核苷酸；(2)與權利要求1所述引物對擴增的解脲支原體的耙核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:8或其互補序列的至少15個連續核苷酸；(3)與權利要求1所述引物對擴增的沙眼衣原體的靶核酸序列進行雜交的寡核苷酸序列，該序列包含SEQIDNO:9或其互補序列的至少15個連續核苷酸。4.如權利要求3所述的探針，其特徵在於，所述探針至少包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9中的一種寡核苷酸序列。5.—種檢測人泌尿生殖道病原體的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)提取核酸樣本；(2)用至少一對權利要求1所述的引物序列，以步驟(l)提取的核酸為模板，擴增病原體的耙核酸序列；(3)檢測擴增產物，並分析結果。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中還包括加入能與步驟(2)所用弓I物對擴增的靶核酸序列進行雜交的探針序列。7.—種檢測人泌尿生殖道病原體的試劑盒，其特徵在於，包括至少一對權利要求1所述的引物序列。8.如權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，還包括至少一種權利要求3所述的探針序列，該探針序列與所含引物序列擴增的靶核酸序列進行雜交。9.如權利要求8所述的試劑盒，其特徵在於，包含以下引物和探針組合中的至少一種組合(1)SEQIDNO:1、SEQIDNO:2禾QSEQIDNO:7;(2)SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:8;(3)SEQIDNO:5、SEQIDNO:6和SEQIDNO:9。全文摘要本發明公開了檢測人泌尿生殖道病原體的引物和探針，以及運用該引物和探針對人泌尿生殖道病原體進行檢測的方法。本發明方法可以在一個反應管內同時檢測淋病奈瑟氏球菌、解脲支原體和沙眼衣原體三種不同的病原體，不僅提高性傳播疾病的早期檢出率，而且減少醫務人員的操作時間，降低成本，並減輕病人經濟負擔。文檔編號C12Q1/68GK101117646SQ20071009393公開日2008年2月6日申請日期2007年7月6日優先權日2007年7月6日發明者張愛民,慧熊,謝立群,陳嘉錚申請人:上海申友健海生物技術有限責任公司