酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法
2023-05-12 06:59:21 2
專利名稱：：酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法
技術領域：
：本發明涉及一種酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法及其在醫藥和保健食品領域的應用，屬於醫藥
技術領域：
。技術背景黑刺菝葜(5Vm7axsco6/m'c做foC.H.Wright)又名短梗菝葜，是菝葜科菝葜屬植物，生於低山灌叢或山谷河岸，主產於陝西、甘肅等省，廣泛分布於北方地區，資源十分豐富。其根莖在我國北方代替威靈仙入藥，商品上稱為"鐵絲威靈仙"、"金剛刺"、"金剛藤"等。煎湯或浸酒內服；研粉、磨汁調敷或煎水洗外用；具除風溼、活血解毒、鎮驚息風和抗癌等功效，臨床上用於治療風溼性腰腿病、小兒驚風腸炎、瘰癧，瘡癤、癌腫等病症。中藥黑刺菝葜中主要含有甾體皂苷類化學成分，其中主要皂苷類為含有拉肖皂苷元的甾體皂苷及其類似物，是製備拉肖皂苷元(Laxogenin)極好的原料(專利"一種從黑刺菝葜植物中製備拉肖皂苷元的方法"，申請號為200710199224.X)，而且具有抗腫瘤、抗菌等活性(張存莉等，林業科學，2006,42(9):69-73;張存莉等，西北農林科技大學學報，2003,31(4):163-166.)，因此研究黑刺菝葜總皂苷的製備方法具有重要的意義。中草藥成分複雜，有活性成分，也有如蛋白質、果膠、澱粉、植物纖維等非活性成分，這些成分既影響植物細胞中活性成分的浸出，又影響中藥液體製劑的澄清度。選用相應的酶可將纖維素、澱粉、蛋白質、果膠等雜質分解去除，不僅有利於活性成分的提取，極大提高有效成分的得率，而且還可以回收利用酶解副產物，實現一物多用，清潔生產，保護環境。
發明內容本發明的目的是提供一種酶法提取黑剌菝葜總皂苷的方法。本發明製備的黑刺菝葜總皂苷提取物所涵蓋的各種皂苷類活性成分之中，最主要的是黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b、黑刺菝葜皂苷c及其類似物等成分。其中主要化合物結構如下:formulaseeoriginaldocumentpage6tableseeoriginaldocumentpage6作為黑刺菝葜總皂苷提取物，其中各皂苷類成分百分含量的總和為70100%(w/w)。為了實現上述目的，本發明的技術解決方案是；首先將中藥黑刺菝葜材料，乾燥，粉碎成30120目的粉末；按照一定的固液比，將粉末和水置於生物反應器中，攪拌成勻漿，調節pH值和溫度，分別或依次加入纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、糖化酶、複合酶製劑等其中的一種或任意幾種酶進行酶催化反應；酶解結束後，繼續在4(TC10(TC條件下保溫0.5h5h，促進甾體皂苷的浸出；然後過濾，濾渣中加入210倍量去離子水繼續提取兩次，每次13h，過濾，合併濾液，得粗總皂苷提取液；然後將粗總皂苷提取液進一步利用澄清處理法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、色譜法、液-液逆流分配色譜法等其中的任意一種方法，或這些方法的任意組合純化得總皂苷提取物。在使用這些方法進行製備時，一般包括以下幾個步驟(1)原料處理本發明所述材料，來源於百合科菝葜屬植物黑剌菝葜(5>m7x"o6/m'c做foC.H.Wright)。作為提取黑刺菝葜總皂苷的原材料，可以是市售黑刺菝葜飲片，也可以是黑刺菝葜塊根、鬚根、根莖、莖、巻須和葉子等任一部位或全部植株，其中優選的藥材部位為黑刺菝葜乾燥根及根莖。上述所述的黑刺菝葜包括未經任何炮製處理的原藥材及飲片，還包括各種炮製品。綜合產品的收率和純度兩個因素，黑刺菝葜原材料的粉碎粒度以30120目的粉碎粒徑提取效果最佳。(2)酶催化反應製備粗皂苷提取液按照固液比1:11:20(原料的質量克數和水的體積毫升比)將原料粉末和水置於生物反應器中，調節pH值，按照原料的質量克數與酶液的毫升體積比10000:11000:5，分別加入纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的複合酶，或階梯法加入各種酶，即依次加入其中的兩種或三種、四種酶，按照下表所示控制最適酶解溫度和pH值，酶解15h。酶催化反應的pH值和溫度酶種類酶活力(U/g)最適pH值最適酶解溫度(°C)纖維素酶■10004.56.53055果膠酶^10003.0102560澱粉酶法^15004.07.55090糖化酶^500003.56.55570複合酶^15003.07.04065酶解過程中時時有氧攪拌；酶解結束後，在4(TC10(TC繼續保溫0.5h5h，促進甾體皂苷的浸出；然後過濾，濾渣中加入210倍量去離子水繼續提取兩次，每次l3h，過濾，合併濾液，得粗總皂苷提取液。(3)粗總皂苷提取液的純化雖然運用酶技術對黑刺菝葜中的澱粉、膠體、蛋白進行了處理，但粗皂苷提取液中仍含有大量澱粉、膠體及蛋白等物質，需要進一步純化處理。可以使用澄清處理法，或溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、色譜法、液-液逆流分配色譜法等其中的任意一種方法，或這些方法的任意組合純化粗總皂苷提取液，得總皂苷提取物。當採用澄清處理法純化粗總皂苷提取液時，處理法包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任意一種澄清劑或其組合醇沉劑、明膠、高嶺土、各種樹脂、聚乙二醇、聚乙三醇、殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等。當採用萃取法進行製備進行時，先用低極性的酯類、垸烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質，然後用合適的極性溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得其中的總皂苷成分，得到總皂苷提取物。當採用大孔吸附樹脂法純化粗總皂苷提取液時，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、弱鹼性或弱酸性等任意一種類型，如D101、D4020、D3500、D941、D21、HP-20、HP-20、XDA-1、AB-8、HPD400、S-8、HZ-806等，其中優選的為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脫劑為水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中優選的為7095%的乙醇。當採用超臨界流體萃取法純化粗總皂苷提取液時，可以對黑刺菝葜粗皂苷提取液的直接進行萃取，也可以對上述任一方法和步驟所獲得的產物進行萃取。萃取時可以使用或不使用以下任一種類溶劑及溶劑混合物水、醇類、酮類及酯類溶劑。當採用柱色譜法純化粗總皂苷提取液時，其處理的對象可以是上述提取步驟所獲得的粗皂苷提取液，也可以是經上述澄清處理法、溶劑提取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化後的產物。所用的固定相可以是矽膠、聚醯胺、氧化鋁、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex-20系列)、C-8、C-18、活性碳、纖維素等，所用的洗脫液因固定相的不同而不同，一般是水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等組成的混合溶劑。當採用液-液逆流萃取法純化粗總皂苷提取液時，其處理的對象可以是上述提取步驟獲得的粗皂苷提取液，也可以是經上述澄清處理法、溶劑提取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化後的產物。一般是將粗總皂苷提取液混懸於水中，然後用低極性的酯類、烷烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質，然後用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得其中的總皂苷成分，得總皂苷提取物。(4)濃縮常壓或減壓條件下的薄膜蒸發、旋轉蒸發及煎煮等濃縮除去皂苷提取物中的溶劑。(5)乾燥真空乾燥或噴霧乾燥、冷凍乾燥等方法，除去皂苷中殘留溶劑，製備得黑刺菝葜總皂苷提取物。該提取物可以單獨或與其它任何中西藥或食物按任意比例配伍，用於製備藥物或功能性食品，所得的藥物或功能性食品可以是膠囊劑、片劑、丸劑、顆粒劑、口服液、糖漿、衝劑、酒劑、注射劑、膏劑、散劑、飲料等，也可以作為製備拉肖皂苷元(Laxogenin)及其類似物的原料。本發明質量控制方法可包括以下含量測定方法中的一種或兩種1.溶血指數法測定皂苷含量0.5%藥材浸出液的配製黑刺菝葜藥材粉末以等滲磷酸鹽緩衝液(或生理食鹽水)精確配製成0.5%濃度。溶血指數的測定取直徑、長短一致的9支小試管，分別精確吸入O.l、0.2、0.3.......0.9mL黑刺菝葜提取物，精密加緩衝液補足體積為lmL，各試管中再各精密加lmL2X血球懸浮液，各管搖勻後由可以產生完全溶血的黑刺菝葜提取物最低濃度來計算溶血指數。皂苷含量的測定用標準皂苷黑刺菝葜皂苷a或黑刺菝葜皂苷b配成適當濃度的溶液，同上法測定溶血指數，從標準皂苷與黑刺菝葜提取物的溶血指數計算黑剌菝葜皂苷的百分含量。2.HPLC-ELSD法分析黑刺菝葜皂苷的含量色譜條件蒸發光散射檢測器，色譜柱反相C18(4.6X150mm，5pm);流動相乙腈-水梯度洗脫，4080%(070min);流速1.0mL/Min;柱溫25°C。標準曲線繪製分別精密吸取黑刺菝葜標準皂苷黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b或黑刺菝葜皂苷c對照品溶液(1.0pg/|aL)0、2、5、10、15、20jaL注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，以對照進樣量(W)為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪製標準曲線。含量測定精密稱取3批黑刺菝葜提取物樣品各3份，每份約20mg，置於10mL量瓶中，加70%乙醇超聲溶解，並稀釋至刻度，搖勻，作為黑刺菝葜皂苷含量測定的供試樣品溶液，精密吸取上述供試樣品溶液20|iL注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，計算含量。具體實施例方式實施例1:酶法提取黑刺菝葜總皂苷提取物的方法黑刺菝葜乾燥根，粉碎，過80目篩，取粉末25g，按照固液比1:14(每g原料粉末加入pH值為4.5的NaAc-HAc緩衝液14mL)加入原料粉末和緩衝液於生物反應器中，調節溫度為45。C，再加入活力為40000U/g的纖維素酶0.025mL，酶解120min，酶解期間時時攪拌；然後升溫至6(TC，在此條件下保溫120min促進甾體皂苷的浸出，離心分離固體殘渣和濾液，用100mL去離子熱水洗滌濾渣，合併濾液，真空濃縮至100mL，冷凍乾燥，得黑刺菝葜總皂苷，測定黑刺菝葜總皂苷提取物中總皂苷含量為85%，測定黑剌菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b和黑刺菝葜皂苷c三種成分的含量之和為76/0。實施例2:酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法黑刺菝葜乾燥塊根，粉碎，過30目篩，取粉末25g，按照固液比1:7加入原料粉末和緩衝液置於生物反應器中，調節溫度為8CTC，再加入活力為20000U/g的澱粉酶0.01mL，酶解100min;然後降溫至50。C，加入活力為10000U/g的糖化酶0.02mL，酶解30min，離心分離固體殘渣和濾液，殘渣中加入用5倍量去離子浸提2次，合併濾液，真空濃縮至生藥濃度為5:1(W/W)，調節溫度為8(TC，加入15%殼聚糖溶液，靜置8h，過濾，濾液上已處理好的大孔型弱鹼性陰離子D392交換柱，用2倍樹脂床體積的2XNaOH溶液衝洗，衝洗液棄去，再用3倍純水衝洗，水衝洗液棄去；用5倍樹脂床體積的70%乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮至稠膏(50。C下相對密度為1.281.33)乾燥，得黑刺菝葜總皂苷提取物。測定黑刺菝葜總皂苷提取物中總皂苷含量為96%，測定黑刺菝葜皂苷a和黑刺菝葜皂苷b兩種成分的含量之和為91%。實施例3:酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法黑刺菝葜乾燥根莖，粉碎，過50目篩，取粉末25g，加入蒸餾水120mL,調節pH值為4.5,再加入纖維素果膠複合酶，其中活力為15000U/g的纖維素酶用量為0.04mL、活力為1000U/g的果膠酶酶用量0.05mL，升溫至50°C，酶解100min酶解期間時時攪拌，然後升溫至8(TC保溫180min促進甾體皂苷的浸出。離心分離固體殘渣和濾液，同法再用去離子水浸提濾渣2次，，合併濾液，將濾液通過AB-8型大孔吸附樹脂層析柱，吸附流速4BV/h，數值柱徑高比為1:7，上樣量為0.1g/mL(以生藥量計)；用水洗劑樹脂12BV，洗脫流速為6BV/h，衝洗液棄去；用90%乙醇洗脫8倍樹脂體積，洗脫流速為5BV/h，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，減壓乾燥得黑刺菝葜總皂苷。測定黑刺菝葜總皂苷提取物中總皂苷含量為90%,測定黑刺菝葜皂苷a、黑刺菝葜皂苷b和黑刺菝葜皂苷c三種成分的含量之和為89%。實施例4:酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法黑剌菝葜乾燥根莖，粉碎，過100目篩，加入粉末25g和60mL水置於生物反應器中，加入0.03mL的澱粉酶液，調節pH值為4.5，反應溫度為75°C，當碘試劑遇反應液不再變藍，酶反應結束，繼續保溫2h，促進甾體皂苷的浸出。離心分離固體殘渣和濾液，用lOOmL去離子熱水洗滌濾渣，合併濾液；依次用等體積的石油醚、正丁醇分別萃取5次，減壓回收、乾燥正丁醇萃取物得黑刺菝葜總皂苷提取物。測定黑刺菝葜總皂苷提取物中總皂苷含量為92%，測定黑刺菝葜皂苷a、黑剌菝葜皂苷b和黑刺菝葜皂苷c三種成分的含量之和為88%。實施例5:利用黑刺菝葜總皂苷提取物製備拉肖皂苷元的方法將總皂苷50毫克溶解在30mL濃度為lmol/LH2S04(MeOH:H20=l:l)溶液中，85t:熱水浴回流水解2h，反應液冷卻後，減壓濃縮除去甲醇，再用環己垸萃取，回收溶劑，N2乾燥得拉肖皂苷元，純度98%。權利要求1.酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於首先將中藥黑刺菝葜材料，乾燥，粉碎成30～120目的粉末；按照一定的固液比，將粉末和水置於生物反應器中，攪拌成勻漿，調節pH值和溫度，分別或依次加入纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、糖化酶、複合酶製劑等其中的一種或任意幾種酶，酶解一定時間；酶解結束後，繼續在40℃～100℃保溫0.5h～5h，促進甾體皂苷的浸出；然後過濾，濾渣中加入2～10倍量去離子水繼續提取兩次，每次1～3h，過濾，合併濾液，得粗總皂苷提取液；然後將粗總皂苷提取液進一步利用澄清處理法，或溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、色譜法、液-液逆流分配色譜法等其中的任意一種方法，或這些方法的任意組合純化得總皂苷提取物。2.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於在使用這些方法進行製備時，一般包括以下幾個步驟原料處理粉碎黑剌菝葜原材料，過30120目的篩。酶催化反應製備粗皂苷提取液按照固液比1:11:20(原料的質量克數和水的體積毫升比)將原料粉末和水置於生物反應器中，調節pH值，按照原料的質量克數與酶液的毫升體積比10000:11000:5，分別加入纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、糖化酶等其中一種酶或其中兩種或三種酶組成的複合酶，或依次加入其中的兩種或三種、四種酶，按照下表所示控制最適酶解溫度和pH值，酶解l5h。酶催化反應的pH值和溫度tableseeoriginaldocumentpage2酶解過程中時時有氧攪拌；酶解結束後，繼續在4(TC10(TC繼續保溫0.5h5h，促進甾體皂苷的浸出；然後過濾，濾渣中加入210倍量去離子水繼續提取兩次，每次l3h，過濾，合併濾液，得粗總皂苷提取液。粗總皂苷提取液的純化可以使用澄清處理法，或溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、色譜法、液-液逆流分配色譜法等其中的任意一種方法，或這些方法的任意組合純化得總皂苷提取物。濃縮常壓或減壓條件下的薄膜蒸發、旋轉蒸發及煎煮等濃縮除去皂苷提取物中的溶劑。乾燥真空乾燥或噴霧乾燥、冷凍乾燥等方法，除去皂苷中殘留溶劑，製備得黑刺菝葜總皂苷提取物。3.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於當採用澄清處理法純化粗總皂苷提取液時，處理法包括離心、抽濾、超濾、壓濾等方法，使用或不使用以下任意一種澄清劑或其組合醇沉劑、明膠、高嶺土、各種樹脂、聚乙二醇、聚乙三醇、殼聚糖以及天然澄清劑成品如101果汁澄清劑、ZTC+1天然澄清劑等。4.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於當採用萃取法純化粗總皂苷提取液時，先用低極性的酯類、烷烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質，然後用合適的極性溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得其中的總皂苷成分，得到總皂苷提取物。5.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於當採用大孔吸附樹脂法純化粗總皂苷提取液時，所用的大孔樹脂可以是非極性、弱極性、中等極性、弱鹼性或弱酸性等任意一種類型，如D101、D4020、D3500、D941、D21、HP-20、HP-20、XDA-1、AB-8、HPD400、S-8、HZ-806等，其中優選的為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脫劑為水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中優選的為7095%的乙醇。6.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於當採用超臨界流體萃取法純化粗總皂苷提取液時，可以對黑刺菝葜粗皂苷提取液的直接進行萃取，也可以對上述任一方法和步驟所獲得的產物進行萃取。萃取時可以使用或不使用以下任一種類溶劑及溶劑混合物水、醇類、酮類及酯類溶劑。7.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於當採用柱色譜法純化粗總皂苷提取液時，其處理的對象可以是上述提取步驟所獲得的粗皂苷提取液，也可以是經上述澄清處理法、溶劑提取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化後的產物。所用的固定相可以是矽膠、聚醯胺、氧化鋁、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex-20系列)、C-8、C-18、活性碳、纖維素等，所用的洗脫液因固定相的不同而不同，一般是水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等組成的混合溶劑。8.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於當採用液-液逆流萃取法純化粗總皂苷提取液時，其處理的對象可以是上述提取步驟獲得的粗皂苷提取液，也可以是經上述澄清處理法、溶劑提取法、大孔吸附樹脂法或超臨界流體萃取法初步純化後的產物。一般是將提取物混懸於水中，然後用低極性的酯類、垸烴類或醚類溶劑(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性雜質，然後用合適極性的溶劑，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是這些溶劑的混合物，萃取獲得其中的總皂苷成分，得總皂苷提取物。9.如權利要求1所述的酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法，其特徵在於該提取物可以作為製備拉肖皂苷元及其類似物的原料。全文摘要本發明公開了一種酶法製備黑刺菝葜總皂苷提取物的方法。將黑刺菝葜乾燥粉碎成30～120目的粉末，按照一定的固液比，將其和水置於生物反應器，控制pH值和溫度，分別或依次加入纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、糖化酶、複合酶等其中一種或任意幾種酶進行酶反應，酶解後，40℃～100℃保溫0.5h～5h；過濾，濾渣中加入去離子水再提取兩次，合併濾液得粗總皂苷提取液；然後將其利用澄清處理法、溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界流體萃取法、色譜法、液-液逆流分配色譜法等其中任意一種或這些方法的任意組合純化得總皂苷提取物。該提取物可作製備拉肖皂苷元及其類似物的原料，也可製備藥物或功能性食品。文檔編號A61K31/7048GK101229335SQ20081001753公開日2008年7月30日申請日期2008年2月22日優先權日2008年2月22日發明者劉華偉,周一萬,張存莉,樺管申請人:西北農林科技大學