OsGSL5蛋白在控制植物育性中的應用的製作方法

2023-05-12 07:05:41 4

OsGSL5蛋白在控制植物育性中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了OsGSL5蛋白在控制植物育性中的應用。本發明提供了抑制OsGSL5編碼基因表達的物質在調控植物育性中的應用；所述OsGSL5蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2。本發明的實驗證明，本發明利用反義核酸沉默水稻體內OsGSL5基因表達，得到不育水稻，從而證明OsGSL5基因可以調控水稻育性，該基因在花粉發育形成過程中所起的作用，特別是具有創造人工可控制雄性不育、創製雜交水稻以及創造轉基因生物安全的受體材料上具有重要的應用前景。
【專利說明】0sGSL5蛋白在控制植物育性中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及0SGSL5蛋白在控制植物育性中的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，它養活著全球一半的人口，如何提高水稻 的產量是關係到國計民生的重要問題。目前，我國絕大部分的稻米由雜交水稻產生，通過控 制花粉育性培育不育系是雜交水稻生產的關鍵。雜交水稻的生產使用的一些核基因或細胞 質雄性的不育系，在水稻雜交育種和增產中起了重要作用。
[0003] 水稻花粉發育是一個很複雜的細胞進程，涉及了花粉發育的所有環節，如減數分 裂、有絲分裂、絨氈層細胞的發育、花葯壁的形成等（Liu et al. 2005)。任何一個進程或 環節出現異常都可能造成植株育性降低，嚴重時甚至可能完全不育。我國的雄性不育研究 和利用在國際上處於領先地位。近年來應用現代細胞生物學技術、遺傳學和分子生物學 手段對模式植物水稻和擬南芥的雄性不育過程做了深入的研究，取得了一些新的研究結 果，如：擬南芥中的 EMSl (Zhao et al. 2002)、CERl (Aarts et al. 1995)、AtGSL2 (Dong et al. 2005)基因和水稻 UDTl (Jung et al. 2005)、MSP1 (Onomura et al. 2003)、GAMYB (Kaneko et al. 2004)、UDPG(Chen et al. 2007)、WDA1 (Jung et al. 2006)基因等，上述基因的突變直 接導致了植株的育性降低，有的完全不育。Emsl編碼一個受體激酶基因，該基因主要參與花 粉母細胞、絨氈層的發育。UDTl基因是小孢子發育的關鍵基因，該基因主要作用於減數分裂 時期，它對於絨氈層細胞的發育、小孢子母細胞的減數分裂以及中層的降解起作用。GAMYB 對於小孢子母細胞緊貼絨氈層細胞吸收營養進而進行正常的減數分裂是必需的。WDAl對於 水稻花粉壁蠟質層形成是必需的。對它們的研究加深了對植物雄性不育機理的理解。
[0004] 在被子植物花葯發育過程中，胼胝質（callose)是廣泛存在於植物細胞的多糖分 子，構成植物細胞壁的重要成分。胼胝質層介於細胞壁和質膜之間，對胼胝質的報導主要 是胼胝質參與花粉發育過程中的動態變化（Waterkeyn et al. 1962 ;Steiglitz. 1977)。小 孢子母細胞減數分裂的前期開始合成胼胝質，合成的胼胝質將小孢子母細胞包圍。由於胼 胝質可以降低細胞壁的滲透性，從而創造了一種與周圍組織隔開的相對獨立的環境。小孢 子母細胞減數分裂第一次分裂中期，小孢子的胼胝質壁開始消失，以增加細胞通透性，進行 營養輸送，四分體初期胼胝質壁達最厚。在小孢子母細胞完成減數分裂後，絨氈層適時分泌 胼胝質酶以分解包裹四分體的胼胝質，使小孢子釋放出來。胼胝質主要起著起屏障或分子 過濾器作用。胼胝體酶合成和分泌時間對於花粉的正常發育具有決定作用（Stanley and Linskens. 1974 ;Waterkeyn and Beinfait. 1970 ;Zhang et al. 2002) aFei 等（1999)對擬南 芥雄性不育突變體ms32超微結構觀察表明，絨氈層細胞過早形成了合成和分泌胼胝酶的 粗糙內質網，導致了包裹花粉母細胞和四分體的胼胝壁提前降解，致使花粉敗育。Worrall 等（1992)等將經過修飾的胼胝體基因與擬南芥減數分裂時期特異的啟動子融合轉入菸草 中。研究結果表明，在減數分裂期表達了胼胝體酶的轉基因植株，出現了部分或者是完全不 育的表型。缺少胼胝體壁的花粉母細胞的減數分裂表面上看似正常，但花粉壁的形成不是 高度有序的沉積，孢粉素在花粉壁表面隨機的分布。由此可以推斷，胼胝體壁的提前或者是 延遲降解都將會使小孢子的發育過程受到幹擾，並導致外壁沉積的異常造成植株不育。但 是關於花粉發育過程中胼胝質降解的分子調控機理報導很少。此外，胼胝的正常合成和降 解與植物抗病，抗逆，生長和發育，生長素信號傳導以及育性密切相關。


【發明內容】

[0005] 本發明的一個目的是提供抑制0sGSL5編碼基因表達的物質的用途。
[0006] 本發明提供的抑制0SGSL5編碼基因表達的物質的用途在調控植物育性中的應 用；
[0007] 所述0SGSL5蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2。
[0008] 上述應用中，所述調控植物育性為降低植物育性。
[0009] 本發明的一個目的是提供抑制0sGSL5編碼基因表達的物質的另外新用途。
[0010] 本發明提供的抑制0SGSL5編碼基因表達的物質在培養不育水稻中的應用。
[0011] 所述〇sGSL5蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2。
[0012] 上述應用中，所述抑制0sGSL5編碼基因表達的物質為DNA分子A，所述DNA分子A 的序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列或含有所述DNA 分子A的重組載體。
[0013] 上述應用中，所述重組載體為將所述DNA分子A插入表達載體pCambial390_Ubi 中得到的重組載體，在本發明的實施例中，重組載體0sGSL5i-pCambial390-UBI為將DNA分 子A插入表達載體pCambial390-Ubi中的SpeI和BamHI位點間得到的重組載體，其中DNA 分子A的序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列。
[0014] 表達載體pCambial390_Ubi為將序列表中序列4所示的Ubiquitin啟動子插入植 物雙元表達載體pCambial390的HindIII和PstI位點間，構成中間載體pCambial390_Ubi。
[0015] 上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
[0016] 本發明第三個目的是提供一種培育育性降低或者培育不育植物的方法。
[0017] 本發明提供的方法，包括如下步驟：將抑制0SGSL5編碼基因表達的物質導入目的 植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的育性低於所述目的植物；
[0018] 所述抑制0sGSL5編碼基因表達的物質為DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序 列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列。
[0019] 上述方法中，所述DNA分子A通過上述重組載體中導入目的植物中。
[0020] 上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
[0021] 本發明第四個目的是提供一種DNA分子。
[0022] 本發明提供的DNA分子，為如下1)或2):
[0023] 1)序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列的DNA 分子；
[0024] 2)在嚴格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。
[0025] 上述嚴格條件可為用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交並洗膜。
[0026] 本發明的實驗證明，本發明利用反義核酸沉默水稻體內0sGSL5基因表達，得到不 育水稻，從而證明0sGSL5基因可以調控水稻育性，該基因在花粉發育形成過程中所起的作 用，特別是具有創造人工可控制雄性不育、創製雜交水稻以及創造轉基因生物安全的受體 材料上具有重要的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為水稻不育突變體gsl5_l的突變表型
[0028] 圖IA :成熟期水稻野生型植株與不育植株形態比較：左為野生型，右為不育突變 體；圖IB :植株成熟後的稻穗，左為野生型，右為不育系；圖IC :抽穗時野生型花葯與突變 體花葯形態比較，左邊為野生型花葯，右邊為突變體花葯。圖ID :野生型植株（WT)的花粉 在經澱粉-碘化鉀染色後觀察；圖IE :突變體花粉在經澱粉一碘化鉀染色後觀察；
[0029] 圖2為突變體gsl5_l中0sGSL5基因分析
[0030] A為0sGSL5基因的結構和Tosl7插入位點分析，起始密碼（ATG)和終止密碼（TGA) 已經標出，方框表示0sGSL5基因的單外顯子，橫線表上基因的內含子；兩個到三角形分別 表示gsl5-l中Tosl7插入的位置。Pl，P2,表示跨T-DNA的兩條基因組引物，P3表示位於 gsl5-l突變體中T-DNA上的邊界引物；
[0031] B為T-DNA插入雜合植株後代的基因型檢測。植株基因型的確定當Pl和P3配對 時才可以擴增出目標產物，由於T-DNA插入片段太大，Pl與P2配對擴增的產物無法得到； 野生型植株由於沒有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對擴增沒有產物，但可以利用引物Pl 與P2配對擴增得到目標產物；而0sGSL5雜合T-DNA插入轉基因植株則Pl和P2配對以及 Pl和P3配對時都可以擴增得到產物。植株表型：20個Tl代單株中第2、5、9、13株為突變 表型，突變植株的基因型均為0sGSL5純合T-DNA插入，而正常植株的基因型為野生（以W 表示）或雜合型（以He表示），這一結果表明突變表型與0sGSL5基因內的T-DNA插入共分 離；
[0032] C為是RT-PCR分析0sGSL5在野生型（WT)和突變體gsl5-l中的表達，結果表明 0sGSL5在突變體中的表達被完全敲除。以Actin做為內標。
[0033] 圖3為野生型和突變體花葯石蠟切片的比較。
[0034] 圖3a_h為野生型花葯在小孢子時期、液泡化花粉時期、有絲分裂時期和成熟花粉 期的花葯橫切片。圖3i-p為表示突變體花葯在小孢子時期、液泡化花粉時期、有絲分裂時 期和成熟花粉期的花葯橫切片。Bars = 25 iim。
[0035] 圖4為利用反義核酸抑制野生型水稻內源0sGSL5的表達可以降低水稻育性
[0036] 圖5為3株RNA幹涉系的基因表達分析圖
[0037] 圖 6 為 0sGSL5i-pCambial390-UBI 載體結構圖

【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040] 實施例1、0sGSL5基因突變體gsl5-l獲得及表型
[0041] 一、gsl5_l突變體的獲得
[0042] l、gsl5_l突變體的獲得
[0043] 所用的水稻T-DNA插入突變體庫由中國農業科學陸軍生物技術研究所利用載 體PFX-E24. 2-15R構建而成（突變體庫的創建方法已經公開發表論文，見等見Wan等， Activation tagging, an efficient tool for functional analysis of the rice genome。 Plant Mol Biol. 2009Jan ；69 (1-2):69-80)〇
[0044] 挑選出10000份水稻轉基因品種"日本晴（為中國農業科學院生物技術所保持的 粳稻測序品種）"的種子，經浸種、催芽後播於秧田，35天後移栽至大田。每份材料種兩行， 每行10株，為一個家系，種植地點為河北廊坊萬莊中國農科院高新技術產業園內的試驗 田，按常規的水稻種植方法進行田間管理。經過大田篩選共獲到300個不育或育性低的突 變家系。其中，一個原始編號為S78的突變體表型為育性極低（如圖1A-E)，將突變體命名 為 gsl5-l。
[0045] 2、分離gsl5_l突變體T-DNA插入位點的側翼序列
[0046] 利用 PCR Walking 方法（Siebert 等，An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995, 23:1087-1088),分離了這個突變體的側 翼序列。根據側翼序列與水稻基因組的匹配位置確定插入位點，結果顯示該側翼序列位於 水稻的第6染色體上，插入位點對應於水稻基因組注釋網站（http://rice. plantbiology. msu. edu/)上的一個基因（登錄號：L0C_0s06g08380)，命名為0sGSL5,其核苷酸序列為序列 表中序列1，編碼的蛋白命名為0sGSL5,該蛋白的氣基酸序列為序列2。Tosl7插入到該基 因的第六外顯子中（見圖2A)。
[0047] PCR Walking方法分離得到的gsl5_l突變體T-DNA插入位點的側翼序列為序列 3〇
[0048] 3、Tosl7插入側翼序列與突變表型的共分離檢測
[0049] 為了證實花粉敗育的突變表型是由於0sGSL5基因內的Tos 17插入引起，本發明對 19個1'1代轉基因植株（其中，第2、5、9、13株為突變單株）進行了1' 〇817插入位點側翼序 列與突變表型的共分離檢測。共分離檢測的具體步驟為：（1)在0sGSL5基因Tosl7插入位 點兩側設計一對基因組引物Pl (5' ATT TGG GAC CTC AGC GAA GC 3')和P2 (5' TGA CTC AAG GGC TCT GIT GC 3'），在 Tosl7 上設計一條載體引物 LBl (P3:5,-CGG TTA CAT CTT CTC AAA CTC AAT GTG G-3'），如圖2B。在Tl代植株中，0sGSL5純合T-DNA插入植株只有 當Pl和P3配對時才可以擴增出目標產物；而由於Tosl7插入使Pl與P2配對擴增的產物 達到17kb，在設定的PCR反應程序無法得到相應PCR產物（這樣鑑定植株基因型的方法是 領域內的通用方法）。野生型植株由於沒有T-DNA的插入，所以Pl和P3配對擴增沒有產 物，但可以利用引物Pl與P2配對擴增得到目標產物。而0sGSL5雜合T-DNA插入轉基因植 株則Pl和P2配對以及Pl和P3配對時都可以擴增得到產物。
[0050] 應用CTAB法從19株Tl代單株中分別抽提總DNA作為模板，用⑴中引物組合 P1+P3和P1+P2進行PCR擴增。反應體系為20iiL，具體包含：DNA模板liiL;10倍體積 的 Taq 酶反應緩衝液 2 ii L ;2mM dNTPL 5 ii L ;25mM 鎂離子 L 2 ii L ; 10 ii M 引物 0? 2 ii L ;0? 3 單位Taq酶，加雙蒸水至20 ii L。反應參數設置如下：94°C 5min ;94°C 45sec，55°C 45sec， 72°C I. 5min，28cycles ;72°C 5min，25°C lmin。（3)將反應產物經瓊脂糖凝膠電泳，根據凝 膠上的帶型判定各個單株的基因型。
[0051] 實驗結果顯示，19株Tl代單株中，4株突變體表型植株的基因型均為0sGSL5純合 T-DNA插入，而其他15株表型正常的植株基因型為野生或雜合型（如圖2B)。這表明gsl5-l 突變體的突變表型是由於0sGSL5基因內的Tosl7插入造成，且該突變體表現為隱性純合突 變體。
[0052] 二、野生型和突變體不同時期花葯的石蠟切片觀察
[0053] RT-PCR分析0sGSL5在野生型（WT)和突變體gsl5-l中的表達，結果表明0sGSL5 在突變體中的表達被完全敲除（圖2C)。以Actin做為內標。
[0054] 取不同發育時期的來源於野生型和突變體的花葯在Carnoy固定液（無水乙醇： 冰醋酸：氯仿=6:1:3)固定24小時（花葯發育分為8個時期，詳情參考Feng，等.2001. Pollen development and its stages in rice (Oryza sativa L.). Chinese J. Rice Sci 15(1) :21-28.)。固定後的材料在系列酒精中脫水（70%酒精、90%酒精、95%酒精、無水酒 精總各順序放置30分鐘）。脫水後的材料浸蠟包埋，切片及展片，37°C烘箱烘乾（4 一 7d) 後置二甲苯中溶蠟，染色，中性樹膠封片，幹後鏡檢，自然風乾後置於顯微鏡觀察，拍照。
[0055] 結果如圖3顯示，突變體和野生型花葯的前4個時期沒有明顯差異（註：前4個時 期的沒有差異），從花葯發育的第5個時期開始，野生型的花葯絨氈層開始降解，到最後完 全消失，產生正常的花粉。而突變體的花葯絨氈層在應該降解的時候沒有正常降解，直至發 育的最後時期，最終導致花粉的敗育。
[0056] 實施例2、抑制0sGSL5的表達的物質在培育水稻不育材料中的應用
[0057] UDNA分子的製備
[0058] 根據0sGSL5基因的CDS序列（序列1)設計引物如下：5' -GCT TAT CTG AAA TCA TCT TGT CTC TC-3' 和 5' -CCA AGA TGC GGG AGA TCT G-3'。
[0059] 提取水稻日本晴幼苗總RNA，將RNA用逆轉錄酶合成cDNA。以反轉錄得到的cDNA 為模板，用上述引物進行PCR擴增，對PCR產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子 量約為540bp的條帶。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與 pMD19-TSimple(Takara)連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，根據 PMD19-T Simple載體上的羧卞青黴素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒，以該 重組質粒載體上的通用引物M13對其進行核苷酸序列測定。
[0060] 經過測序，該重組質粒上的PCR產物為序列表中序列1自5 ^末端第5171-5713 位核苷酸。
[0061] 2、Ubiquitin啟動子的獲得
[0062] 以玉米基因組DNA為模板，Pl和P2為引物，進行PCR擴增，得到2Kbp的PCR產物 即為Ubiquitin啟動子，核苷酸序列為序列表中序列4。
[0063] 擴增 ubiquitin 啟動子所用的引物：Pl: 5' -GCCCAAGCTTCTAGTGCAGTGCAGCGTGA C-3' 和 P2:5' -GCAACTGCAGGTACCTAGTGCAGAAGTAACACCA-3',
[0064] 3、抑制0sGSL5的表達的重組載體的獲得
[0065] 將上述2得到的序列表中序列4所示的Ubiquitin啟動子插入植物雙元表達載體 pCambial390 (該載體可購自 Cambia, Queensland. Australia)的 HindIII 和 PstI 位點間， 構成中間載體pCambial390_Ubi ;
[0066] 再將上述1得到的序列表中序列1自5 '末端第5171-5713位核苷酸的反向互補 片段（0sGSL5i)替換中間載體pCambial390-Ubi的SpeI和BamHI位點間的片段，得到重組 載體，命名為0sGSL5i-pCambial390-UBI (圖6,其中，，HPT代表潮黴素篩選標記。35S代表 花椰菜病毒的啟動子。UBI代表玉米啟動子UBI。HindIII、PstI、SpeI、BamHI代表各酶切 位點）。
[0067] 0sGSL5i-pCambial390_UBI為抑制0sGSL5的表達的重組載體，其中序列表中序列 1自5 ^末端第5171-5713位核苷酸的反向互補片段為抑制0sGSL5的表達的DNA分子A。
[0068] 經過測序，重組載體0sGSL5i-pCambial390-UBI為將DNA分子A插入表達載體 pCambial390-Ubi中的SpeI和BamHI位點間得到的重組載體，其中DNA分子A的序列為序 列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列。4、幹擾0sGSL5表達的轉 基因水稻的獲得
[0069] 構建好的重組載體電轉入（電轉化儀為eppendorf公司產品，本發明所用電壓為 1800V，具體操作參考該儀器的使用說明書）農桿菌（Agrobacterium tumefaciens)菌株 EHA105,轉化後的菌株命名為 0sGSL5i-pCambial390-UBI。
[0070] 將 0sGSL5i-pCambial390_UBI 轉入水稻粳稻品種日本晴（A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L. ssp. japonica)Stephen A. Goff, et al. Science 296, 92(2002)，以下也稱為野生型水稻）種子誘導的愈傷組織中，得到再生株系。具體如 下：
[0071] 1)種子愈傷組織誘導如下：選取飽滿、無黴變成熟水稻種子，用手工脫去穀殼（注 意保持胚完整），將脫穀殼米粒轉到50mL無菌三角瓶一加適量無菌水洗一次一棄水，倒入 75%酒精適量，搖動攪拌，放置30秒（過程中適當輕搖動混勻）一棄酒精一加適量無菌水 洗一次一棄水一倒入適量2% NaCLO,不時搖動攪拌，共處理30分鐘一棄NaCLO -用無菌水 洗3次，每次停留1分鐘一倒去無菌水，將種子從三角瓶轉到帶無菌濾紙的無菌培養皿中吸 幹。誘導培養基：MS+2, 4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+3. 6g/L植物凝膠（pH5. 8)。
[0072] 2)農桿菌介導的轉化
[0073] (1)挑選繼代約7天的胚性愈傷組織作為轉化受體材料。
[0074] (2)收集上述農桿菌重組菌體0sGSL5i-pCambial390-UBI，重懸於液體共培養培 養基（在YEP液體培養基的基礎上添加終濃度為100mg/L AS (乙醯丁香酮），調PH5. 2得到 的液體培養基）中，28°C，200rpm震蕩培養1-2小時；調整OD值至0. 2。
[0075] (3)將步驟⑵獲得的胚性愈傷組織浸泡步驟2)獲得的農桿菌菌液，然後進行菌 液浸泡，處理30min。
[0076] (4)將愈傷組織在無菌濾紙上吸乾，轉移到鋪有一層滅菌濾紙的固體共培養培 養基（在MS基本培養基的基礎上添加5mg/L 2,4-D、0.4g/L CH(水解酐酪素）、0.1mg/ L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA)、10g/L葡萄糖、20mg/L As (乙醯丁香酮）和3. 6g/L植物凝膠 (phytagel)，調PH至5. 2滅菌得到的固體培養基）上，19°C暗培養2-3天。
[0077] (5)將步驟⑷培養得到的愈傷組織轉出，無菌水漂洗3-4次，再用含50mg/L Cef(頭胞噻吶黴素）的無菌水漂洗，然後將愈傷組織放到滅菌的濾紙上。
[0078] (6)將步驟（5)得到的用無菌濾紙吸乾的愈傷組織轉移到選擇培養基（在MS基 本培養基的基礎上添加5mg/L 2, 4-D、0. 4g/L CH (水解酐酪素）、250mg/L Cef (頭胞噻吶黴 素）、50mg/L HPT和3. 6g/L植物凝膠（phytagel)，調PH至5. 8滅菌得到的固體培養基） 上，25°C暗培養，每兩周轉至繼代培養基上繼代一次。
[0079] (7)經步驟（6)所述3次繼代培養後，將生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到分化培養 基（在MS基本培養基的基礎上，添加lmg/L 6-苄氨基腺嘌呤（6-BA)、0. lg/L CH(水解酐酪 素）、250mg/L Cef(頭胞噻吶黴素）、50mg/L HPT 和 3. 6g/L 植物凝膠（phytagel)，調 PH 至 5. 8滅菌得到的固體培養基）上，25°C、16h、2000Lx光照培養，兩周左右新鮮的愈傷組織上 開始有綠色芽點出現，每15天繼代一次，兩次繼代後，長出小苗，轉移到生根培養基（在MS 基本培養基基礎上添加3g/L植物凝膠（phytagel)，調PH至5. 8滅菌得到的固體培養基） 進行生根培養。
[0080] (8)待生根培養長出完整小苗，將小苗轉入到壯苗培養基（1/2MS基本培養基的添 加3g/L植物凝膠（phytagel)，調PH至5. 8滅菌得到的固體培養基）上培養獲得到幼苗。
[0081] (9)將步驟（8)壯苗培養基上的幼苗，煉苗一周，在清水中將培養基漂洗乾淨，先 移栽到溫室，再移栽到大田中得到轉0sGSL5i-pCambial390-UBI TO代植株。共得到60株 獨立轉化苗。
[0082] 表1為所用培養基為MS基本培養基添加不同成分，具體如下：

【權利要求】
1. 抑制OsGSL5編碼基因表達的物質在調控植物育性中的應用； 所述OsGSL5蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於： 所述調控植物育性為降低植物育性。
3. 抑制OsGSL5編碼基因表達的物質在培養不育水稻中的應用。 所述OsGSL5蛋白的胺基酸序列為序列表中序列2。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特徵在於： 所述抑制0sGSL5編碼基因表達的物質為DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序列表 中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列或含有所述DNA分子A的重組 載體或含有所述DNA分子A的重組菌。
5. 根據權利要求4所述的應用，其特徵在於： 所述重組載體為將所述DNA分子A插入表達載體pCambial390-Ubi中得到的重組載 體； 所述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌。
6. 根據權利要求1-5中任一所述的應用，其特徵在於： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
7. -種培育育性降低或者培育不育植物的方法，包括如下步驟：將抑制0sGSL5編碼基 因表達的物質導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的育性低於所述目的植 物。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特徵在於：所述抑制OsGSL5編碼基因表達的物質為 DNA分子A，所述DNA分子A的序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的 反向互補序列； 所述DNA分子A具體通過權利要求5中的所述重組載體中導入目的植物中。
9. 根據權利要求7-8中任一所述的應用，其特徵在於： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為水稻。
10. -種DNA分子A，為如下1)或2): 1) 序列為序列表中序列1自5'末端第5171-5713位核苷酸的反向互補序列的DNA分 子； 2) 在嚴格條件下與1)雜交且編碼相同蛋白的DNA分子。
【文檔編號】C12N15/29GK104292319SQ201410478783
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】吳金霞, 張治國, 孫學輝, 路鐵剛 申請人:中國農業科學院生物技術研究所