在昆蟲-杆狀病毒系統中表達ibv-hn99膜蛋白基因的方法

2023-05-11 23:45:56

專利名稱：在昆蟲-杆狀病毒系統中表達ibv-hn99膜蛋白基因的方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種膜蛋白基因重組表達載體及在昆 蟲-杆狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis,IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious BronchitisVirus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的 呼吸、消化和泌尿生殖系統，造成蛋雞產蛋數量減少，蛋的品質下降；雛雞由於 呼吸道或腎臟感染而大批死亡。IBV的膜蛋白基因編碼M蛋白，M蛋白N端 位於病毒粒子外部並被糖基化，其主要組成部分跨膜3次，M蛋白含有224-225 個胺基酸殘基，分子質量為23ku， M蛋白橫跨囊膜，大部分在囊膜的內側面， 僅有一小部分糖基化的N端露在膜外，其C端無明顯的親水區或疏水區。M蛋 白的作用與病毒顆粒的形成有關。DAVIDF等在研究IBV糖蛋白結構與功能時 發現糖基化的M蛋白與IBV的感染性有關，M蛋白由於糖基化程度不同，導致了 M蛋白多態現象的產生(David F Stem, Bartholomew M Sefton. Coronavirus
Bronchitis Virus Glycoproteins^].Virology, 1982， p: 804-812.) 。 IBVE蛋白和M蛋 白的相互作用以及雙分子層的膜在VLP的形成和病毒出芽發揮著重要作用
(Emily Corse， Carolyn E， Machamer.The Cytoplasmic Tail of Infectious Bronchitis Virus E Protein Directs Golgi Targeting[J]. Virology, 2002, 76:1273-1284.)。 Ignjatovic研究發現Sl、 S2和M蛋白均可誘導細胞介導的免疫反應。同年， Ignjatovic J, Galli L在研究IBV結構蛋白免疫保護性時發現，M蛋白能夠誘導產生 低滴度的限制性的交叉反應抗體，但M蛋白免疫的雞不能抵抗強毒的攻擊
(Ignjatovic J, Galli L. Structural proteins of avian infectious bronchitis virus: role in immunity and protection[J]. Adv Exp Med Biol.)。在國內，陳萍等在2002年成功構 建了重組質粒PC-M(IBVWHNJ)，分別採用裸露的質粒DNA疫苗和脂質體包被的 M基因DNA疫苗免疫10日齡的雛雞，他們所製成的M基因DNA疫苗能誘導雞體 產生體液免疫和細胞免疫，對強毒攻擊有一定的抵抗力，M基因DNA疫苗對雞的 保護率可達70% 。(陳萍.間接ELISA檢測IBV DNA疫苗免疫抗體及IBV M基因表 達研究[A].2005年第二屆全國核酸疫苗與免疫研討會論文集[C].北京，2005:14.)儘管如此，對M蛋白進行疫苗開發的報導相當少，現在的IBVDNA疫苗的 研究主要集中在免疫原性較高的N基因和S基因，對免疫原性較低的M基因的 研究，國內外報導的都很少，因此，進一步研究M基因的免疫原性及其在IBV 中的作用，對開發IBV M基因的基因工程疫苗或M蛋白的ELISA診斷試劑盒 具有重要的意義。
杆狀病毒表達系統自1983年建立以來， 一直是應用最廣泛的真核表達系統 之一，它雖然具有很多突出的優勢，但是也表現出一些不足。杆狀病毒表達系統 在具體應用當中還有一個缺陷就是病毒感染昆蟲細胞後的病變及空斑難以識別， 特別是對初學者。由於表達外源蛋白的需要，Bacmid缺失了多角體蛋白基因， 使該系統就失去了天然的篩選標記，只能依靠病毒感染細胞後的病變來判斷。綠 色螢光蛋白基因eg^是一個廣泛使用的報告基因，早期的研究表明，它能在昆 蟲細胞中正常表達，並具有產生綠色螢光的能力，因此它也被應用到杆狀病毒表 達系統中，但以前的研究多是預先將其構建到轉移載體中，再通過轉座與外源基 因一起轉座到穿梭載體，從而指示病毒的侵染及蛋白質的表達，不能成為一個普 通使用的系統。

發明內容
本發明的目的在於提供一種膜蛋白基因重組表達載體及其構建方法；本發 明的另一目的在於提供一種在昆蟲-杆狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因 的方法。
本發明目的是通過以下技術方案實現的
一種膜蛋白基因重組表達載體，它同時含有麥芽糖標籤和綠色螢光蛋白基 因，定名為Bacmid-eg$-MBP-M。
所述的膜蛋白基因重組表達載體，所述的膜蛋白基因具有SEQIDNo.l所示 的核苷酸序列。所述的膜蛋白基因具有SEQIDNo.2所示的胺基酸序列。
膜蛋白基因重組表達載體的構建方法是按下述步驟進行的
(1) 在pFBDM載體的BamH I與￡coR I酶切位點之間插入MBP標籤，得 到杆狀病毒真核表達載體pFBDM-MBP。
(2) 以含有HN99株膜蛋白基因的質粒pMD18-T-M為模板，進行PCR擴 增和產物回收，反應參數為95'C預變性5min， 94"C變性45 s， 53'C退火45s， 72。C延伸2min， 35個循環;72。C延伸10min， (C結束反應。
(3) 將雞傳染性支氣管炎病毒HN99株膜蛋白基因PCR產物經￡&R I和 歷Vidm雙酶切，克隆入杆狀病毒真核表達載體pFBDM-MBP，得到重組表達質粒 pFBDM德P-M;(4)將所構建的重組表達質粒pFBDM-MBP-M轉化到DH10BAC-eGFP 菌中，得到重組表達載體Bacmid-egQ)-MBP-M。
在昆蟲-杆狀病毒系統中表達雞傳染性支氣管炎HN99株膜蛋白基因的方法 採用脂質體轉染法用重組的將上述表達載體Bacmid-egQ>MBP-M轉染Sf9細胞，
經兩代盲傳。
在昆蟲-杆狀病毒系統中表達雞傳染性支氣管炎HN99株膜蛋白基因的方法 的具體操作步驟如下
(1) 取10 pL重組質粒Bacmid-egQ>MBP/M加入到裝有320 的 TNM-FH培養基的Eppendorf管中；
(2) 另取Eppendorf管，每管加脂質體5 ^L，放置5 min;
(3) 將脂質體5 ]iL加入到330 含有重組質粒的培養基中，作用25 min;
(4) 用TNM—FH培養基衝洗6孔細胞培養板上已長成單層的Sf9細胞， 重複3次，吸出培養液，棄去；
(5) 將處理好的樣品液接種Sf9細胞，然後用封口膜封閉培養板，28。C培 養120 h;
(6) 分別收集Sf9細胞和培養上清，細胞培養液離心5 000 r/min， 4。C離 心5min，將上清移至一無菌管內70。C保存，該上清內可能含有重組病毒顆粒；
(7) 將上清接種細胞單層，盲傳2代。
本發明的有益效果本發明將重組轉移載體pF-MBP/M轉化到 DH10BAC-eGFP菌中，通過細菌內轉座和進一步PCR、三抗平板藍白斑篩選等 三個步驟可保證所得到的絕大部分重組克隆均為陽性。本發明所用到的轉座質 粒pF-MBP含有兩個多可隆位點。在兩個反向啟動子之間又可將原有的多克隆 位點再重複插入一次，因此該質粒具有同時可表達四個外源基因的潛力。本發 明中僅用到該質粒最右邊一個多角體啟動子和多克隆位點。將M基因插入 pF-MBP之前，在多角體啟動子下遊插入了MBP標籤，並將M蛋白與MBP標 籤融合表達。在MBP標籤的尾部有一 Factor Xa切割位點構成的軟接頭與M蛋 白連接，因此在MBP/M融合表達後可通過Factor Xa或Genenase I酶切掉軟接 頭而獲得不帶標籤的M蛋白。
本發明將重組基團DH10BAC-eGFP直接通過同源重組策略整合到Bacmid 的基因組中，再轉染五.co/!'細胞成為一個完整的新型BactoBac系統，從而更加 有效地指示病毒的侵染及蛋白質的表達，適於任何外源基因的插入和應用。以 Bacmid-egfy DNA轉染昆蟲細胞後，綠色螢光蛋白基因的表達起到了指示作用， 在表達外源蛋白時，可以根據綠色螢光指示細胞被感染的狀況，同時也可根據細胞感染狀況確定最佳的病毒感染複數(MOI)。將報告基因直接整合到Bacmid 基因組非必須區域後，每次構建重組病毒時，只需將待表達的外源基因克隆到 Bacmid-eg*即可，不必象從前那樣將報告基因和外源基因同時克隆到轉移載體 中，不僅省去了克隆工作的煩瑣，而且避免了在克隆雙基因工作中因選擇合適 酶切位點所面臨的困難。


圖1是pFBDM載體物理圖譜。
圖2是Bac-To-Bac杆狀病毒表達系統重組病毒構建和基因表達操作程序。 圖3是pFastBacHTa載體物理圖譜。 圖4是pFastBacHTa多克隆位點圖譜。 圖5是Bacmid-egfp的構建流程。 圖6是重組轉座子的PCR鑑定原理。
圖7是重組質粒酶切鑑定，M: DL8 OOO標準分子量，1,2: pF-MBP-M雙
酶切產物。
圖8重組轉座子PCR鑑定，M: DL8000分子量標準，1: Bacmid-egfy-MBP/M， 2:野生型杆狀病毒DNA， 3:對照。 圖9是未轉染Sf9細胞。 圖10是轉染72 h後發生病變的Sf9細胞。 圖11是轉染72h後Sf9細胞中的綠色螢光。
圖12是重組杆狀病毒的PCR鑑定，1: M13特異性引物鑑定M重組杆狀 病毒，2: M通用引物鑑定M重組杆狀病毒，M: DL8 000標準分子量。
圖13是重組杆狀病毒感染的細胞與對照SDS-PAGE(左)和Western-blot (右)
結果，1:野生型病毒對照，2:重組病毒表達樣品，3:正常Sf9細胞對照，M:
蛋白質分子量標準。
具體實施例方式
下面結合具體實施方式
對本發明作詳細說明。 實施例l重組表達載體的構建及其鑑定 1材料
1.1引物設計與合成
參照GenBank中發表的IBV M基因序列，採用引物設計軟體Prime Premier 5.0設計l對引物
上遊引物5 '-CGGAATTCAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAA-3'(五coi I ) 下遊引物 5'-CCCAAGCTTCTCTCTACACGCACACATTTAT-3'(州"dIII)引物購自上海生物工程公司。
1.2載體和菌株
載體pFBDM-MBP是在pFBDM載體的5awH I與五coR I酶切位點之間插 入了 MBP標籤，pFBDM的物理圖譜見圖1。
轉座質粒pFBDM-MBP含有兩個多可隆位點，在兩個反向啟動子之間又可 將原有的多克隆位點再重複插入一次，因此該質粒具有同時可表達四個外源基 因的潛力。本發明僅用到該質粒最右邊一個多角體啟動子和多克隆位點。將M 基因插入pF-MBP之前，在pFBDM載體多角體啟動子下遊、BamH I與￡coR I 酶切位點之間插入了 MBP標籤，並將M蛋白與MBP標籤融合表達。在MBP 標籤的尾部有一 Factor Xa切割位點構成的軟接頭與M蛋白連接，因此在 MBP/M融合表達後可通過Factor Xa或Genenase I酶切掉軟接頭而獲得不帶標 籤的M蛋白。
菌株DH10BAC-eGFP (攜帶AcMNPV-eGFP病毒基因組及輔助質粒的 DH10b菌)購自武漢大學醫學分子病毒學國家重點實驗室。 1.3細胞系及其培養基
草地貪夜蛾昆蟲細胞系Sf9(Spodopterafrugiperda)細胞和野生型病毒 wtAcMNPV購自武漢大學醫學分子病毒學國家重點實驗室。Grace's培養基、 乳白蛋白水解物購於GIBCO公司；酵母粉購於OXOID公司。TNM-FH昆蟲細 胞培養基1 000ml Grace's培養基中加酵母粉3.3g，乳白蛋白水解物3.3g，含 100U/ml青黴素、100U/ml鏈黴素、10%胎牛血清。
1.4酶和其他分子生物學試劑
各種限制性內切酶、T4DNA連接酶、抗生素、IPTG、 X-gal等為Sigma公 司產品；鹼性磷酸酶AP標記的羊抗兔IgG均購自北京中杉生物科技有限公司； DNA快速回收試劑盒購自上海申能博彩生物工程有限公司；質粒快速提取試劑 盒購自上海中科開瑞生物晶片科技股份有限公司；DNAMarker、蛋白質Marker 購自北京鼎國生物技術有限公司；小牛血清NCS和脂質體轉染試劑
(Lipofectin-2000)購於GIBCO/BRL公司；PVDF膜，購於Invitrogen公司； 氨苄青黴素(Ap)，卡那黴素(Kan)，慶大黴素(Gm)和四環素(Tet)購於 華美生物工程公司。其他的常規生化及分子生物學試劑均購自華美生物工程公 司。
1.6毒株
雞傳染性支氣管炎HN99株，該毒株己申請中國專利(專利申請號位為 200610018065.4)，並於2008年1月9號公開。1.5M13通用引物
用來檢測重組Bacmid、重組杆狀病毒的通用引物M13，購自大連TaKaRa 生物公司。
上遊引物為5'- GTT TTC CCA GTC ACG AC國3' 下遊引物為5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 1.6細菌培養基 三重抗性LB平板
製作添加四環素(Tet)、慶大黴素(Gen)、卡那黴素(Kana)、 IPTG、 X-Gal 的LB平板。各成分含量如下 Tet(lmg/ml) 綱pl Gen(7mg/ml) 8.7^1 Kana(10mg/ml) 500(il IPTG(100mmol/L) 167.85|al X-Gal (20mg/ml) 200jxl 塗LB平板時，首先塗X-Gal (20mg/ml) 40(il。
i:7主要儀器設備
二氧化碳培養箱；生化培養箱；SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳儀；低溫離心機； 離子水生成儀；PCR儀；高速低溫離心機；臺式離心機；紫外可見光光度儀3000 型；紫外分析儀97500型；超聲波細胞破碎機；超淨工作檯；空氣浴振蕩器 HZQ-C;微波爐；製冰機；電泳儀；微量移液器；電子天平；幹烤箱；恆溫培 養箱；冰箱等，均由武漢大學醫學分子病毒學國家重點實驗室提供。
2方法
2.1桿狀病毒Bac to Bac表達系統操作流程
杆狀病毒表達系統Bac to Bac重組病毒構建和基因表達操作程序如圖2。
2.2 Bacmid-eg*的構建流程
Bac-To-Bac杆狀病毒表達系統重組病毒構建和基因表達操作程序見圖2。 pFastBacHTa載體物理圖譜見圖3; pFastBacHTa多克隆位點圖譜見圖4; Bacmid-egQ)的構建流程圖5。
2.3 IBV HN99株M基因的PCR擴增及產物回收 2.3.1質粒pMD18-T-M的構建
(1) IBV增殖與RNA的提取
將HN99株病毒液分別經一定比例稀釋，接種10日齡SPF雞胚，37°。培養36 h後(棄去24 h內的死胚)，無菌收集尿囊液，4°C 5 000 r/min離心30 min， 取上清，再以27 000r/min離心2h，用吸管輕輕吸出上清棄去，管底留下大約1 mL，吹打，混勻。取該超離病毒液500 pL，加Trizol試劑500 ^L，劇烈震蕩1 min，室溫靜置5 min;力d 200 pL三氯甲烷，震蕩混勻30 s，靜置10 min; 4 。C 12 000r/min離心15min，取上清液(約500pL)加等量體積異丙醇混勻，靜置10 min; 4 。C 12 000r/min離心10min，棄上清；加入1 mL 75°/。乙醇，溫和振蕩混 勻，懸浮沉澱；4 °C 7,500 r/min離心5 min，棄上清，室溫乾燥lOmin;用20|iL DEPC水懸浮沉澱。立即進行反轉錄或置一20 "保存備用。
(2) RT-PCR擴增IBVHN99株M基因片段 (a)逆轉錄(RT)
按照Reverse Transcription System試劑盒說明書，以特異性下遊引物為引物 合成cDNA第一鏈。反應體系如表l，依次將以下試劑加入經DEPC水處理並 滅菌過的PCR反應管中
RNase Free H20 6 jiL
5 xRT Buffer 4
lOmmol/LdNTP 2 ^iL
RNase inhibitor 1 [jL
特異性下遊引物 1
ReverTraAce 1 fjL
Total RNA 5 |iL
總體積 20
反應參數為-42 °C 60min 95 。C 5min 4 。C 5 min
將反應後的產物瞬間離心，立即進行PCR或儲存於一20 'C。 (b) PCR擴增
以cDNA第一鏈為模板，按照以下反應體系和反應參數進行目的基因的擴
增5 |xL
上遊引物0.8 |iL
下遊引物0.8
10xPCR Buffer2pL
10mmol/LdNTP0.4 (iL
Taq DNA0.2 (iL
RNase Free H2010.8 |iL
總體積20
反應參數為95。C預變性5min， 94 °。變性45 s， 53 。C退火45 s， 72'C延 伸2min， 35個循環；72匸延伸10min， 4 。C結束反應。取15 iaLPCR產物於1.2%
瓊脂糖凝膠中進行電泳，並觀察結果。
(3) PCR產物的回收、純化與克隆
(a) PCR產物的回收
將以上PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，用紫外燈觀察電泳結果，當要回收 的DNA帶與引物帶完全分離時，停止電泳，在紫外燈下用刀片切下含有欲回收 帶的凝膠，用凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。
(b) PCR產物的純化
參照DNA快速回收試劑盒說明書的操作步驟進行純化。
(c) PCR產物的克隆 將純化的PCR產物與pMD18-T載體連接。連接體系為
純化後的PCR產物 luL
pMD18-T載體 luL
ddH20 3|aL
總反應體積 5iiL連接反應液16t:水浴放置過夜後，存於—2(TC備用。 2.3.2 M基因的PCR擴增及產物回收
以含有HN99株M基因的質粒pMD18-T-M為模板，按照以下反應體系和 反應參數進行目的基因的擴增
pMD18-T-M質粒0.1 pL
M基因上遊引物0.5 nL
M基因下遊引物0.5 nL
10xPCR Buffer2.0 pL
10謹ol/LdNTP0.4 nL
Taq DNA0.2 pL
RNase Free H2016.3 pL
總體積20 nL
反應參數為95。C預變性5min， 94。C變性45s， 53。C退火45s， 72。C延伸2 min， 35個循環；72'C延伸10min， 4'C結束反應。取15 jiLPCR產物於1.2%瓊 脂糖凝膠中進行電泳。在紫外燈下用刀片切下含有目的條帶的凝膠，用DNA回 收純化試劑盒回收M基因片段。
2.4重組質粒pFBDM-MBP/M (簡稱pF-MBP/M)的構建
2.4.1雙酶切及產物純化回收
取pF-MBP質粒和M基因PCR回收產物，分別進行￡coR I和歷Vzd III雙酶 切。反應體系為
pF-MBP質粒5 |jLM基因PCR產物15
10xbuffer10 pLlOxbuffer10
2 fit
倫d III2 (iL歷"d III2
ddH，O31d啦O21
總體積50 jaL總體積50
37'C水浴作用3 h， 1%瓊脂糖凝膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收pF-MBP 載體和M基因片段。 2.4.2連接、轉化
將以上經純化的目的基因和載體片段連接，其連接反應體系的組成為 M基因片段 13 nL
12載體片段 4 pL
連接Buffer 2 pL
T4 DNA連接酶 1 uL
總體積 20 pL
連接反應液16 "C水浴放置過夜，然後轉化DH10BAC DH5a (含 Bacmid-eg^i)感受態細胞。
2.4.3陽性重組子的篩選、鑑定
在轉化後過夜培養的LB瓊脂平板上，任意挑取8個白色單菌落接種於5 mL 含Amp的LB液體培養基中，37'C振蕩培養10 h左右。按小量鹼裂解法提取質 粒DNA。取3^於0.8%瓊脂糖凝膠中電泳鑑定，用空質粒作對照，鑑定有無 重組質粒。選取鑑定陽性的重組質粒進一步進行酶切鑑定和PCR擴增鑑定。
2.5轉座
(1) 取鑑定為陽性的重組質粒pF-MBP/M 10 pL，加入到100 (iL含有 DH10Bac-eGFP感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴45min。
(2) 42'C水浴中熱激200 s，迅速移至冰中冰浴5 min。
(3) 加入800pL新鮮SOC液體培養基，37°C， 150r/min輕搖1 h。
(4) 加入4fiL Tet、 l(iLKan、 0.2^iLGen， 37°C， 150r/min，培養4h。
(5) 取培養液100nL均勻塗在含Tet、 Kan、 Gen、 IPTG、 X-gal的LB平板 上，正向放置l 2h，直至液體被充分吸收，倒置平板，於37i:培養箱中培養 過夜，經過藍白斑篩選，得到陽性克隆，再進行PCR鑑定。
2.6重組轉座子的鑑定
2.6.1重組Bacmid DNA的提取與製備
(1) 分別用無菌牙籤挑取生長在含有三抗(Tet、 Kan、 Gen)的LB平板上 的白色單個菌落，接種到5mL含相應抗生素的LB液體培養基中，37°C， 250 r/min培養過夜。
(2) 次日將培養的菌液4。C， 12 000r/min離心30 s，吸棄上清，收集菌體 沉澱，加入300 冰預冷的溶液I ,重懸沉澱。
(3) 加入300 pL溶液I1，溫和顛倒數次混勻，冰浴靜置5min，使細菌裂解。
(4) 加入300 冰預冷的溶液m，輕微振蕩均勻，冰浴10min。
(5) 12 000r/min， 4。C離心10min，轉移上清至一個無菌Eppendorf管中。
(6) 加入等體積的酚/氯仿抽提一次，顛倒混勻時一定要溫和操作，以防 質粒DNA斷裂'。(7) 12 000r/min， 4。C離心10min，小心吸取上清，丟棄沉澱。
(8) 加入2倍體積的無水乙醇，-20沉澱過夜。
(9) 12 000r/min, 4'C離心10min，保留沉澱，去除上清。
(10) 加入室溫放置的70%乙醇lmL， 12 000r/min， 4。C離心10min，吸 棄液體，重複操作一次，將Eppendorf管倒置於無菌濾紙上37。C溫箱內乾燥。
(11) 將DNA沉澱溶於20pL含RNaseA(20ng/mL)的TE溶液中，37。C 放置30min以上，以消化RNA和重溶沉澱，然後-2(TC保存。
2.6.2重組轉座子的PCR鑑定
(1) 重組轉座子的PCR鑑定原理見圖6所示。
(2) PCR鑑定取所製備的質粒DNA作1: IOO稀釋，分別使用M13通 用引物、M基因特異引物進行PCR鑑定。M13通用引物反應體系如下
10xPCR buffer 5 pL
2.5mmol/L dNTPs 4pL
M13上下遊引物各 2.5 mL
質粒DNA 1 nL
TaqDNA 0.5抖L
ddH20_35.5
總體積 50 jiL
反應條件為94 。C預變性5 min; 94""C變性45 s， 55。C退火45 s， 72""C延伸 5min， 30個循環；72"C延伸10min。同時設立水對照和藍色菌落陰性對照。 3結果
3.1 pF-MBP-M質粒的篩選與酶切鑑定
選擇質粒凝膠電泳初步鑑定為陽性的質粒，進行雙酶切鑑定，經0.8%瓊脂 糖凝膠電泳分析表明，含M基因片段重組質粒經五^Rl+7^V^m雙酶切後，產 生了約6.0kb的pF-MBP載體條帶和0.7 kb的M基因條帶(圖7)，與預期結 果一致。陽性質粒測序結果表明，讀碼框正確，插入片段與原始序列相同，目 的基因克隆到了載體的預期位置，可以用於表達。
3.2重組轉座子PCR鑑定
含M基因片段重組陽性質粒轉化大腸桿菌Bacmid-eg^)感受態，發生轉座。 PCR鑑定，0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析表明，1道的重組轉座子產生了 4.6kp左 右帶(攜帶Bacmid-egQ)上的2.6kp左右序列和插入外源融合基因MBP/M的 2.0kb左右序列)，見圖8，與預期結果相符合，確定為陽性Bacmid穿梭載體， 將其命名為Bacmid-egQvMBP/M。實施例2 IBV-HN99膜蛋白基因在昆蟲-杆狀病毒系統中的表達
1. 重組表達載體Bacmid-egf^-MBP/M的構建 重複實施例1的方法構建重組表達載體Bacmid-egfi)-MBP/M。
2. 轉染
Sf9細胞培養使用含100U / mL青黴素，100 ng/mL鏈黴素，10%胎牛血清 的TNM—FH培養基培養， 一般每3d傳代一次，每次一傳三或一傳四。當95 %的Sf9細胞處於對數生長期時用於轉染試驗。採用脂質體轉染法用重組載體 Bacmid-egfi>MBP/M轉染Sf9細胞，空白對照為正常的Sf9細胞，陰性對照採 用野生型杆狀病毒AcNPV感染Sf9細胞。具體操作步驟如下
(1 )取10 nL重組質粒Bacmid-egfj)-MBP/M加入到裝有320 pL的TNM-FH 培養基的Eppendorf管中。
(2) 另取Eppendorf管，每管加脂質體5 pL，放置5 min。
(3) 將脂質體5 加入到330 含有重組質粒的培養基中，作用25 min。
(4) 用TNM—FH培養基衝洗6孔細胞培養板上已長成單層的Sf9細胞， 重複3次，吸出培養液，棄去。
(5) 將處理好的樣品液接種Sf9細胞，然後用封口膜封閉培養板，28°。培 養120 h。
(6) 分別收集Sf9細胞和培養上清，細胞培養液離心5 000 r/min， ^C離 心5min，將上清移至一無菌管內7(TC保存，該上清內可能含有重組病毒顆粒。
(7) 將上清接種細胞單層，盲傳2代。
3. 重組病毒的鑑定
3. 1鏡檢觀察細胞病變及綠色螢光
用重組杆狀病毒感染Sf9單層細胞72 h後，置6孔細胞培養板分別在倒置 顯微鏡和螢光顯微鏡下觀察有無細胞病變及綠色螢光。
3.2重組病毒DNA的提取 (O用100 pL細胞培養瓶培養Sf9細胞，待細胞長成單層時，更換培養基， 接種病毒收集液，置28"C培養72h。
(2) 吹打後，取出培養液，5 000r/min， 離心5 min。
(3) 取上清20 000r/min，離心1 h，棄取上清，保留沉澱。
(4) 用600 pL ddH20懸浮沉澱，加入100 SDS(10。/。)置37。C保溫1 h。
(5) 酚/氯仿抽提2次，加入1/10體積的乙酸鈉和等體積的異丙醇，一20。C 放置lh以上。(6) 12 000r/min，離心10min，沉澱DNA。
(7) 加入800 70%乙醇清洗2次，室溫晾乾。
(8) 加入50nLTE， 37。C放置30min以上以溶解DNA沉澱，然後放置於 一20"C冰箱中保存備用。
3.3重組病毒PCR鑑定
取提取的重組病毒DNA lnL作模板，以M基因特異性引物和M13通用引 物進行PCR鑑定，參照重組轉座子PCR鑑定的方法進行操作。
4. 蛋白質的SDS-PAGE凝膠電泳 4.1感染後Sf9細胞的收集
用重組杆狀病毒感染Sf9單層細胞72 h後收穫細胞，用彎頭吸管將培養瓶 中貼壁的Sf 9細胞輕輕刮下，轉移至Eppendorf管中，1 000 r/min離心5 min， 棄上清，用1 mL PBS (0.01 mmo1/ /L)洗滌細胞，Tip頭輕吹使細胞懸浮，1 000 r/min離心5 min，倒淨PBS,每個Eppendorf中加入1 mL無菌水，移到5 mL 的離心管中，冰浴條件下超聲波破碎細胞基因組DNA至溶液不粘為止，然後 用SDS-PAGE上樣緩衝液將細胞裂解，沸水煮樣品5min， 10 000 r/min離心5 min。
4.2表達產物的SDS-PAGE檢測
參考《分子克隆實驗指南》第2版(金冬鷹等譯，1999)製作SDS-PAGE 凝膠(凝膠濃度根據蛋白質分子量而定)。
取15pL樣品進行SDS-PAGE，採用不連續凝膠系統，濃縮膠4%、分離膠 12%,電泳條件為積層膠80V，分離膠120V恆壓。
5. 重組蛋白活性的Western Blot檢測
製備用於Western Blot分析的SDS-PAGE凝膠，以AcNPV病毒感染的Sf9 細胞、野生型AcNPV感染單層Sf9細胞和正常培養的Sf9細胞作為陰性對照。 用兔抗MBP多克隆抗體(12CA5克隆)進行Western雜交分析，檢測重組病 rAc-egQ)-MBP/M感染Sf9細胞72 h後MBP/M融合蛋白的表達。檢測方法如下
(1) rAc-egfp-MBP/M感染Sf9細胞72 h後，用彎頭吸管將培養瓶中貼壁 的Sf9細胞輕輕刮下，不連續SDS聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳條件 為恆流12 mA。待溴酚藍條帶距離膠下沿約1 cm時停止電泳。
(2) 用電轉印儀將凝膠上的蛋白質轉移至硝酸纖維素濾膜上，轉印條件為 恆流100 mA， l~2h。
(3) 取下濾膜，裝入雜交袋，在封閉緩衝液(lOmMTris-HCl， pH8.0， 150 mMNaCl， 5°/。脫脂奶粉，0.05%Tween-20)中室溫下封閉3 h，期間輕輕振搖。(4) 加入抗兔MBP多克隆抗體(1 : 500稀釋)，4'C雜交過夜，期間輕輕振搖。
(5) 雜交終止，以洗滌緩衝液TBST(10mMTris-HCl，pH8.0， 150mMNaCl， 0.05n/oTween-20)洗滌兩次，每次10min。
(6) 在5 mL封閉緩衝液中加入鹼性磷酸酶(AP)偶聯的羊抗兔IgG(l : 5000 稀釋)，室溫孵育lh，期間輕輕振搖。
(7) 以洗滌緩衝液TBST洗膜三次，每次10min; TBS(IO mM Tris-HCl， pH8.0， 150 mM NaCl)洗膜兩次，每次10 min。
(8) 取出纖維素膜，置50mLNBT/BCIP生色底物溶液中，輕輕振搖，至 出現藍紫色的反應信號，立即取出纖維素膜，細股流水衝洗掉雜交膜上殘餘的 生色液。待雜交膜空氣中自然乾燥後，記錄結果，拍照。
6. 轉染後細胞病變及綠色螢光觀察
Bacmid-egfi>MBP/M轉染Sf9細胞，經兩代盲傳後，在倒置顯微鏡下可見 轉染Sf9細胞核膨大，細胞折光性增加，細胞增大最後破碎，與正常Sf9細胞 差別明顯(圖9， 10)，在螢光顯微鏡下可以看到細胞漿內有大量綠色的螢光(圖 11)，表明己有大量重組病毒包裝成功。此時收集含有大量的重組杆狀病毒的細 胞上清。細胞沉澱用於SDS-PAGE和Westem-blot檢測蛋白表達。
7. 重組杆狀病毒的PCR鑑定
用出現病變的Sf9細胞提取DNA，分別用M13引物、M基因特異性引物 進行PCR鑑定，0.8%瓊脂糖凝膠電泳結果見圖10。由圖可見，成功地從病變 細胞中擴增出特異性片段，長度分別為4 600bp、 700bp，表明已經產生重組病 毒。
8. 表達產物的SDS-PAGE和Western Blot分析
以正常Sf9細胞和野生型病毒感染的Sf9細胞作為對照，對重組病毒感染 的Sf9細胞作SDS-PAGE，經染色、脫色後結果如圖13 (左)。從電泳所形成的 蛋白條帶上看，重組病毒組樣品比對照在約68ku處多出一條蛋白帶。
通過雜交後顯色反應，在硝酸纖維素膜上MW為68 ku附近出現明顯的雜 交條帶，說明表達的蛋白質與已知抗體發生了抗原-抗體反應，證明所表達的蛋 白就是目的蛋白，與預期結果一致，結果如圖4-13 (右)。<110〉河南農業大學
在昆蟲-杆狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法
2
DNAstar.
1 669 DNA 雞(Chicken)

met_peptide (3)…(14) (20,21,22)
1
Atggaaaatt gcactcttaa cactcagcag gcagctgagc ttttcaagga atacaactta 60 tttataaccg cattcctgtt gtttctcact atactacttc agtatggtta tgcaactagg 120 agtcggctca tctatatagt gaaaatgata gtgttgtggt gcttttggcc cctcaacatt 180 gcaataggtg taatttcatg tatataccca ccaaatacag gaggtcttgt cgcagcgata 240 atacttactg tatttgcgtg tctttctttt gttggttatt ggatccagag tttcagactc 300 tttaagcggt gtaggtcttg gtgggccttt aaccctgaga gcaatgccgt gggttcaata 360 ctccttacaa atggtcagca atgtaacttt gctatagaga gtgtgccaat ggtactatct 420 cctattatta agaatgccat tctttattgc gaaggccagt ggcttgctaa atgtgaacca 480 gatcacttgc ctaaagatat atttgtttgc acacctgata ggcgtaatat ctatcgtatg 540 gtgcag幼at 3C3Ctggtg3 cc^agcgg3肌c肪gaag3 gatttgctac gtttgtctat 600 gctaaacagt cagtagatac tggcgagcta gaaagtgtag caacaggagg aaataacctt 660 tacacataa 669 2 222 PRT 雞(Chicken)

CARBOHYD (2，4，5，10，11，12)
2
Met Glu Asn
Lys Glu Try
lie Leu Leu
lie Val Lys
Ala He Gly
Leu Val Ala
Val Gly Try
Ser Tip Tip
Leu Leu Thr
Pro Met Val
Glu Gly Gin
Asp lie Phe
Val Gin Lys
Ala Thr Phe
Glu Ser Val
Cys Thr Leu Asn Thr Gin Gin Ala Ala Glu Leu Phe
5 10 15
Asn Leu Phe lie Thr Ala Phe Leu Leu Phe Leu Thr
20 25 30
Gin Tiy Gly Try Ala Thr Arg Ser Arg Leu lie Tiy
35 40 45
Met lie Val Leu Trp Cys Phe Tip Pro Leu Asn lie
50 55 60
Val lie Ser Cys HeTry Pro Pro Asn Thr Gly Gly
65 70 75
Ala lie lieLeu Thr Val Phe Ala CysLeu Ser Phe
80 85 90
Trp lie Gin Ser Phe Arg Leu Phe Lys Arg Cys Arg
95 100 105
Ala Phe Asn Pro Glu Ser Asn Ala Val Gly Ser lie
110 115 120
Asn Gly Gin Gin Cys Asn Phe Ala lie Glu Ser Val
125 130 135
Leu Ser Prolielie Lys Asn Ala He Leu Try Cys
140 145 150
Trp Leu Ala Lys Cys Glu Pro Asp His Leu Pro Lys
155 160 165
Val Cys Thr Pro Asp Arg Arg Asn lie TryArg Met
170 175 180
Try Thr Gly Asp Gin Ser Gly Asn Lys Lys Arg Phe
185 190 195
Val Try Ala Lys Gin Ser Val Asp Thr Gly Glu Leu
200 205 210
Ala Thr Gly Gly Asn Asn Leu Try Thr.
215 220
權利要求
1.一種膜蛋白基因重組表達載體，其特徵在於它同時含有麥芽糖標籤和綠色螢光蛋白基因，命名為ACBacmid-egfp-MBP-M。
2. 根據權利要求l所述的膜蛋白基因重組表達載體，其特徵在於所述的膜 蛋白基因具有SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。
3. 根據權利要求l所述的膜蛋白基因重組表達載體，其特徵在於所述的膜 蛋白基因具有SEQ ID No.2所示的胺基酸序列。
4. 如權利要求1所述的膜蛋白基因重組表達載體的構建方法，其特徵在於該 方法是按下述步驟進行的(1) 在pFBDM載體的5amHI與五coRI酶切位點之間插入MBP標籤，得 到杆狀病毒真核表達載體pFBDM-MBP;(2) 以含有HN99株膜蛋白基因的質粒pMD18-T-M為模板，進行PCR擴增 和產物回收，反應參數為95-C預變性5min， 94'C變性45s, 53'C退 火45s， 72。C延伸2min， 35個循環；72。C延伸10min， 4。C結束反應；(3) 將雞傳染性支氣管炎病毒HN99株膜蛋白基因PCR產物經^roRI、iZ/"d III雙酶切，克隆入杆狀病毒真核表達載體pFBDM-MBP，得到重組表達 質粒pFBDM-MBP-M;(4) 將所構建的重組表達質粒pFBDM - MBP-M轉化到DH10Bac-eGF菌中， 得到重組表達載體Bacmid-egQ)-MBP-M。
5. —種在昆蟲-杆狀病毒系統中表達雞傳染性支氣管炎HN99株膜蛋白基因 的方法，其特徵在於採用脂質體轉染法用權利要求1所述的表達載體 Bacmid-egfp-MBP-M轉染Sf9細胞，經兩代盲傳。
6. 根據權利要求4所述的在昆蟲-杆狀病毒系統中表達雞傳染性支氣管炎 HN99株膜蛋白基因的方法，其特徵在於，該方法的具體操作步驟如下(1) 取10 nL重組質粒Bacmid-egfy-MBP/M加入到裝有320 的 TNM-FH培養基的Eppendorf管中；(2) 另取Eppendorf管，每管加脂質體5 ^L，放置5 min;(3) 將脂質體5 ^加入到330 含有重組質粒的培養基中，作用25 min;(4) 用TNM—FH培養基衝洗6孔細胞培養板上已長成單層的Sf9細胞， 重複3次，吸出培養液，棄去；(5) 將處理好的樣品液接種Sf9細胞，然後用封口膜封閉培養板，2S"C培養120 h;(6) 分別收集Sf9細胞和培養上清，細胞培養液離心5 000 r/min, 4。C離 心5min，將上清移至一無菌管內7(TC保存，該上清內可能含有重組 病毒顆粒；(7) 將上清接種細胞單層，盲傳2代。
全文摘要
一種在昆蟲-杆狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法，屬於生物工程領域。本發明還公開了一種膜蛋白基因重組表達載體，它同時含有麥芽糖標籤和綠色螢光蛋白基因，命名為ACBacmid-egfp-MBP-M。在昆蟲-杆狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法為採用脂質體轉染法用表達載體Bacmid-egfp-MBP-M轉染Sf9細胞，經兩代盲傳。本發明的在昆蟲-杆狀病毒系統中表達IBV-HN99膜蛋白基因的方法的構建對開發IBV M基因的基因工程疫苗或M蛋白的ELISA診斷試劑盒具有重要的意義。
文檔編號C12N15/40GK101560522SQ200810049558
公開日2009年10月21日 申請日期2008年4月15日 優先權日2008年4月15日
發明者仝宗喜, 維 原, 安森亞, 沛 崔, 崔保安, 張君濤, 張志平, 張惠茹, 張淑霞, 朱翠娟, 李小波, 李玉峰, 杜恩岐, 楊明凡, 白延傑, 董海聚, 叢 賀, 賀秀媛, 鄧立新, 陳紅英 申請人:河南農業大學