玉米乾旱響應基因ZmDIP1及其編碼蛋白的應用的製作方法

2023-05-12 06:11:41

專利名稱：玉米乾旱響應基因ZmDIP1及其編碼蛋白的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，特別涉及一種玉米乾旱響應基因ZmDIPl及其編碼蛋白的應用。
背景技術：
近年來，隨著全球氣候變暖，乾旱已成為我國作物生產中頻繁發生的自然災害。例如2010年3月我國西南地區發生的特大乾旱，造成3000多萬畝秋冬播農作物受災，夏糧減產一半以上，農業直接經濟損失超過100億元，程度之重、範圍之大均為歷史罕見。玉米作為中國重要的糧食作物，在整個生育期對水分的要求很高。中國半數以上玉米種植在西北、西南、華北和東北地區的旱地上，常因土壤乾旱而影響植株的生長發育，導致玉米的產量和品質降低，乾旱已成為制約我國玉米產量與品質提高的主要限制因子之一。因此，加強玉米 抗旱基因資源的挖掘和利用，對於培育玉米抗旱新品種，保障國家糧食安全，實現農業可持續發展具有重大意義。乾旱對作物生長、發育、代謝的影響主要表現在(I)乾旱脅迫影響了葉綠素的合成，促進了葉綠素的分解，從而影響了葉片的光合效率(Plant Molecular Biology, 1979,20: 37-44) ; (2)乾旱脅迫導致植株氮素代謝關鍵酶一硝酸還原酶(NR)的活性降低，而脯氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺和纈氨酸等大量積累；(3)乾旱脅迫導致葉片膜脂過氧化作用增強，膜透性增加，丙二醛(MDA)含量升高，出現電解質外滲。抗氧化保護酶SOD、POD、CAT等酶活性顯著下降。(4)乾旱脅迫降低了種子的萌發和幼苗的成活；(5)抑制了根系的生長，從而影響了礦質營養的吸收；(6)乾旱脅迫導致植株矮小，節間短，葉片小，易早衰。這些研究較好地闡明了乾旱對作物生長、發育及代謝影響的生理生化基礎，但缺乏對作物抗旱分子遺傳機理的研究。近年來，隨著分子生物學和基因組學研究的深入，作物抗旱基因的發掘成為作物遺傳資源與品種改良研究的熱點，越來越多的抗旱相關基因相繼被克隆和鑑定。按照抗旱基因的功能，可以把植物抗旱相關基因分為兩大類第一類為功能基因，主要在植物抗性中起保護作用。這一類基因主要包括滲透調節基因如海藻糖合成酶基因TPS1、脯氨酸合成酶基因P5CS、甘露醇合成基因MtlD、甜菜鹼合成酶基因BADH及多胺合成酶基因Odc等；保護生物大分子的活性基因如脫水蛋白基因BDN1、水通道蛋白基因AQP和晚期胚胎發生豐富蛋白LEA等。第二類基因為調節基因，主要在信號傳導和逆境基因表達過程中起調節作用，主要包括一些轉錄因子如DREB、MYB、bZIP、WRKY、NAC等。這些基因已在植物基因工程中得到應用。泛素化是生物體內蛋白質翻譯後的重要修飾之一，是蛋白質降解的信號。泛素連接酶E3是泛素化過程中的關鍵酶類，決定了泛素化修飾的特異性，在植物激素調控、逆境脅迫和病原菌防衛反應中起著重要的作用(Plant Cell, 2004, 16: 2795 - 2808; PlantCell, 2007, 19:1912 - 1929)。目前尚未見玉米中E3連接酶編碼基因的克隆與功能鑑定的報導。

發明內容
本發明提供一種受乾旱脅迫誘導表達的玉米基因ZmDIPl (drought-inducedprotein I)及其編碼蛋白的應用；該基因能提高植物對乾旱脅迫的抗性，尤其是能夠提高植物的抗旱能力和改造該基因後的玉米可以報告乾旱程度的基因。本發明所提供的玉米乾旱響應的基因，名稱為ZmDIPl，來源於玉米(Zea maysL.):是下述核苷酸序列之一(I)序列表中的SEQ ID No: I的核苷酸序列；(2)編碼序列表中的SEQ ID No:2蛋白質序列的DNA ；(3)與序列表中的SEQ ID No: I限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；
(4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQ ID No: I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件用0. 5XSSPE(0. 5XSSC), 0. 1%SDS的溶液，在60°C下雜交並洗膜。序列表中的SEQ ID No: I由843個鹼基組成，其編碼框為自5』端第1-840位鹼基，編碼具有序列表中的SEQ ID No:2的胺基酸序列的蛋白質。本發明的ZmDIPl基因所編碼的蛋白ZmDIPl，是下述胺基酸序列之一(I)序列表中的 SEQ ID No:2;(2)將序列表中的SEQ ID No:2的胺基酸殘基序列經過一至十二個胺基酸殘基的取代或缺失或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。序列表中的的SEQ ID No:2由280個胺基酸殘基組成。在一個實施方案中，該玉米乾旱響應基因的重組表達載體、轉基因細胞系和工程菌以及擴增該基因中任一片段的引物對。在另一個實施方案中，該玉米乾旱響應基因的應用，包括利用該基因檢測植物遭受乾旱脅迫程度的方法。在另一個實施方案中，可將ZmDIPl的啟動子與報告基因(gus)融合,將該構建ZmDIPl- gus轉化玉米，得到可以比較準確地估量植物受到乾旱脅迫程度的植株。上述重組表達載體均可按照常規方法構建。本發明的ZmDIPl是一個抗旱基因，可以在玉米受到乾旱脅迫時大量表達，以抵禦乾旱逆境。而ZmDIPl — gus的轉基因植株可以報告玉米乾旱程度。本發明中，乾旱處理的玉米幼苗葉片中，所述的泛素E3連接酶編碼基因ZmDIPl被誘導表達。本發明所述的蛋白ZmDIPl是植物泛素化蛋白降解途徑中的關鍵酶類，所以調控ZmDIPl的表達能夠調節植物對乾旱的抗性。因此所述的編碼乾旱誘導的基因ZmDIPl在植物抗旱領域具有廣闊的應用前景，其經濟效益潛力巨大。


圖I =ZmDIPlPCR產物的電泳圖；圖2 :玉米幼苗葉片中ZmDIPl基因響應乾旱脅迫的表達模式柱狀圖；圖3 =ZmDIPl基因植物表達載體構建示意圖4 :轉ZmDIPl基因的菸草株系表達水平柱狀圖；圖5 :轉ZmDIPl基因的菸草幼苗對乾旱脅迫處理的生長表型照片；圖6 :轉ZmDIPl基因的菸草幼苗對乾旱脅迫處理的生長表現柱狀圖。
具體實施例方式下面，本發明將用實施例進行進一步的說明，但是它並不限於這些實施例的任一個或類似實例。實施例I :材料處理玉米(Zea mays L.)自交系鄭58，購自河南省農業科學院作物所。 玉米材料處理A.種子消毒挑選飽滿的玉米種子，經0. 1%的升汞消毒後，置於28 °C，黑暗條件下發芽。B.乾旱脅迫處理將發芽的種子移至含蒸餾水的培養皿中，在溫度為24_26°C、溼度為60%、光暗交替周期為12h/12h的光照培養室中培養。待幼苗長至二葉一心(約10天)時，倒掉蒸餾水，進行20% PEG 6000溶液脅迫處理實驗。處理的時間分別為1、3、6、12、24、48小時；脅迫處理後的玉米作為實驗者，未做脅迫處理的玉米幼苗作為對照組。實施例2 :ZmDIPl (drought-induced protein I)基因的克隆A.玉米葉片總RNA的分離和純化I.總RNA的提取總RNA的提取按照TRIZOL (Invitrogen, USA)試劑說明書進行操作。2. RNA的純化(以總RNA為50 為例)(I)純化體系
RNASOpl
DNase (RNase Free, I u/|.i])6.25 (.il
RNase Inhibitor0.5 pi
10 XDNaseBuITer7.5
DEPC-H2O加至總體系100 pi(2 ) 37 °C溫浴 30 min，去除 RNA 中的 DNA。(3)加 DEPC-H2O 至 300 U I0(4)加入300 Ul的酚/氯仿(I: I)抽提。(5)加入等體積的異丙醇，_20°C沉澱1-2 h。(6)加入 30 40 DEPC-H2O 溶解。B. RT-PCR 擴增玉米 ZmDIPl 基因I.玉米葉片第一鏈cDNA合成將所述的玉米葉片總RNA吸取1-2 V- g於I. 5 ml離心管中，按照Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit產品說明進行反轉錄,得到玉米葉片第一鏈cDNA。
2. ZmDIPl 基因的 PCR 擴增以所述的第一鏈cDNA為模板，進行ZmDIPl基因的PCR擴增，得到PCR擴增產物。根據網站http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/ 中玉米表達序列標籤(ExpressedSequence Tag, EST)信息設計玉米的ZmDIPl基因的全長cDNA引物上遊引物(SEQ4) : 5 』 -ATGAGCTTCGTGTTCCGAG-3 』 ；下遊引物(SEQ5) : 5 』 -TTACACCATGTATGAAGCATC-3 』。PCR反應體系組成為cDNA 模板(約 50 ng) 1 W，上遊引物2 W，下遊引物2 W，10XPCR Buffer 5 Ex-Taq 酶1 W，10 X dNTPs 2 W，滅超水37 W。PCR擴增程序
權利要求
1.一種玉米乾旱響應基因，其特徵在於為下述核苷酸序列之一的基因(1)SEQ ID No: I ; (2)與SEQID No: I限定的核苷酸序列具有90%以上同源性的核苷酸序列； (3)在高嚴謹條件下可與SEQID No: I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.權利要求I所述玉米乾旱響應基因表達的蛋白質，其特徵在於為下述胺基酸殘基序列之一(1)SEQ ID No: 2 ; (2)SEQ ID No:2的胺基酸殘基序列經過一至十二個胺基酸殘基的取代或缺失或添加且對植物的生長發育具有調控作用的蛋白質。
3.含有權利要求I所述的玉米乾旱響應基因及其調控元件的表達載體。
4.含有權利要求I所述的玉米乾旱響應基因及其調控元件的轉基因細胞系。
5.含有權利要求I所述的玉米乾旱響應基因及其調控元件的工程菌。
6.擴增權利要求I所述的玉米乾旱響應基因及其調控元件中任一片段的引物對。
7.權利要求I所述的玉米乾旱響應基因及其調控元件中在植物生長發育中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，所述的植物包括單子葉植物和雙子葉植物。
9.根據權利要7所述的應用，其特徵在於將所述玉米乾旱響應基因的調控元件啟動子區域與報告基因gus融合後轉化玉米，在受過乾旱處理的轉基因玉米植株裡，其報告基因呈現誘導表達。
全文摘要
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及一種玉米乾旱脅迫應答基因ZmDIP1及其編碼蛋白與應用。主要提供了一個玉米抗旱基因及建立於此基因調控元件基礎上的有效檢測植物所受乾旱脅迫程度的方法。經檢測，該方法具有快速、準確估量玉米植株所受乾旱影響程度的特點。本發明為植物缺水檢測提供了一種快速、便捷、有效的方法，並為植物抗旱研究及乾旱育種提供了一個優質基因，具有較高的實際應用價值。
文檔編號C07K14/415GK102796747SQ20121029259
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月16日 優先權日2012年8月16日
發明者萬向元, 王美平, 王超 申請人:北京金冠豐生物技術有限公司