生產核酸的拷貝的製作方法

2023-05-11 16:33:16

專利名稱：生產核酸的拷貝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種產生至少是部分核酸鏈的拷貝的方法。
在遺傳工程領域，經常有這樣的情況樣品中僅存在非常少量的核酸，而以研究或診斷測試為目的，則需要大量的全序列或部分序列核酸。也就是說，可能需要知道某種特定的核酸是否存在於樣品中(比如確定一個人是否被一種特定的病毒感染，可以是DNA，也可以是RNA，或者確定在他們的核酸中存在或不存在有特定的序列)。如果存在於樣品中的話，由於核酸的量是低於可檢測限度的，所以需要對樣品做擴增反應，這樣即可產生更多量的核酸(如果存在的話)。然後，可通過檢測來確定核酸的存在與否。如果檢測結果為陽性的，則證明核酸存在於原始樣品中。相反地，若結果為陰性的，那麼可以證明核酸不存在於原始樣品中。
本發明涉及不同的技術，用這些技術，可以使存在於或潛在存在於樣品中的核酸得到擴增，產生大量核酸。
根據本發明的第一個方面，提供了一種方法，用該方法可以產生至少是部分核酸鏈(「靶鏈」)的拷貝，靶鏈是存在於或潛在存在於樣品中的，本方法包含下列步驟(i)提供了一種固相支持系統，其上固著有大量的單鏈寡核苷酸，這些平鏈寡核苷酸能同靶鏈雜交。(ii)(a)清洗支持系統以除去未雜交物質。(iii)產生靶1鏈的拷貝，該鏈摻入了固相的寡核苷酸及包含同至少是部分靶鏈互補的核苷酸序列，也就是說生成的靶1鏈拷貝中至少有一部分是以靶鏈為模板而生成的，並且，如果需要，可以是靶1序列拷貝的全部。(iv)使同靶1鏈拷貝相雜交的靶鏈變性，然後可選擇使至少是部分的靶鏈同支持系統上的尚未轉變為靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交。(v)同時，(a)用固定於固相支持物上的靶1鏈拷貝作為模板來生成(從雜交幹靶1鏈上的引物來生成)靶2鏈拷貝，該鏈包括了感興趣的核酸序列，並且(b)用靶鏈為模板，如果他們已經同固定的寡核苷酸雜交了的話，再次產生至少是部分的靶1鏈拷貝，並且(如果需要)，可完成靶1鏈的形成，並且(vi)按所需要的次數重複步驟(iv)和(v)，在每次重複步驟(iv)和(v)時，用靶2鏈拷貝來進一步生成靶1鏈拷貝。
如前所述，本發明的方法對於含有或不含感興趣的核酸的樣品均有效。如果核酸不存在，那麼上面列出的步驟(iii)-(vi)將不會導致靶1鏈拷貝和靶2鏈拷貝的產生。此外，不能生成靶2鏈拷貝提供了有價值的信息，因為在實行的檢測步驟中，將確定靶2鏈拷貝的存在，若結果為陰性，則證明靶鏈不存在於原樣品中。
清洗步驟(ii)(a)使得未雜交物質從支持系統上被移去，這樣使得用於步驟(iii)中的靶鏈樣品將是無汙染的。因而，在原樣品中存在的汙染物將不會參與本發明方法的其後的反應。
在步驟(iv)中，靶鏈可同支持物上的未延伸寡核苷酸再雜交。或者在步驟(v)之前，可將原始的靶鏈從固相支持系統上移去。
按以下所述操作也是可取的在整個的從步驟(iii)-(vi)的順序操作中，在每次雜交反應後和/或在每次鏈合成反應後和/或連接反應後，洗滌固相支持系統和/或移去反應試劑。這樣，比如，在步驟v(b)中引入的過量的引物就可在(至少是部分的另外的)靶1鏈拷貝產生前被去除。
寡核苷酸優選地共價同固相支持物相聯。優選地，固相支持系統是是一種顆粒組成的系統並且寡核苷酸是固定於顆粒之上的。顆粒組成的支持系統的應用是其自聲權利的一個重要特徵。並且因此根據本發明的另一個方面，本發明提供了一種方法，用該方法可以產生至少是部分的核酸鏈(靶鏈)的拷貝，其中靶鏈是存在於或潛在存在於樣品中，本方法包括以下步驟(i)提供了一種顆粒組成的固相支持系統，其上固定有大量的單鏈寡核苷酸，這些寡核苷酸可同靶鏈雜交。(ii)提供了單鏈形式的靶鏈並且可使靶鏈同支持物上的寡核苷酸鏈雜交，寡核苷酸鏈的數目要遠遠大於靶鏈的數量。(iii)產生靶1鏈拷貝，其摻入了固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶鏈互補的核酸序列，也就是說生成的靶1鏈拷貝至少有一部分是以靶鏈為模板而生成的，並且，如果需要，可以完成靶1序列拷貝的形成。(iv)變性同靶1鏈拷貝相雜交的鏈並且可任選將至少是部分的先前的靶鏈同支持物上的尚未轉化為靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交。(v)同時，(a)用固定於固相支持物上的靶1鏈拷貝作為模板來生成靶2鏈(從同靶1鏈拷貝雜交的引物上生成)，該鏈包括感興趣的核酸序列，並且，(b)用靶鏈作為模板，如果靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，來進一步生成至少是部分的靶1鏈拷貝，並且(如果需要)可完成靶1鏈拷貝，而且(vi)按所需次數重複步驟(iv)和(v)，在步驟(iv)和(v)的每次重複中，用靶2鏈拷貝來進一步生成靶1鏈拷貝。
本發明的第二個方面的一個優選的特性是，步驟(ii)之後，在執行步驟(iii)之前，可以洗滌顆粒固相支持物以移去未雜交的物質。
優選的顆粒是非多孔型矽石，並且優選大小在50到200微米間的顆粒(更優選的是大小在100到200微米間)。這些顆粒可以含有交聯的矽氧烷基質，其中含有能同寡核苷酸反應的反應基團(比如環氧基團)，這樣，通過矽氧烷基質就可將寡核苷酸固定於支持物上。合適的顆粒在WO-A-93/13220(Tepnd)中有敘述。
更優選的是這些固相支持物上應被裝入一個柱中，這樣液體就可以容易地加入或移出。這樣的柱子的應用可以使得反應物(比如雜交緩衝液，核苷酸)能被容易地加入到反應體系中。再者，在任意一步完成後，可以簡便地對柱進行洗滌以移去過剩的反應物等，以便留下潔淨的樣品用來進行下一步反應。
在WO-A-93/13220中揭示了一種合適的柱子的製備法。
在上面的方案中，靶1鏈拷貝可通過許多途徑產生。首先，支持物上的寡核苷酸的定向可以使其作為引物(用雜交於其上的靶鏈或靶2鏈拷貝作為模板)在步驟(v)(b)中延伸從而直接產生靶1鏈拷貝。其次，定向的寡核苷酸也可能不能按前項所述的方式延伸。在這種情況下，需要加入游離的引物，這些引物同已經與固定的寡核苷酸雜交的靶鏈或靶2鏈拷貝進行雜交，然後向寡核苷酸方向延伸，結果最後同寡核苷酸會合併共同完成靶1鏈拷貝的製備。
本發明方法的一個特徵是，在步驟(ii)中，固相支持系統上的寡核苷酸的數量要大大多於將與之雜交的靶鏈的量。此處所說的大大多於指的是支持物上的寡核苷酸的總量要比徑步聚(ii)中引入的靶鏈的量多10倍，更優選的是多至少100倍，並且多至少1000倍則更佳。
步驟(v)(a)導致了靶2鏈拷貝的生成，該鏈包括有感興趣的核酸序列，在步驟(v)的最後(包括除了用固定於支持物上的寡核苷酸外還用液相的引物)，靶2鏈拷貝同靶1鏈拷貝雜交，在先執行步驟(v)之後，靶2鏈拷貝數較未延伸的寡核苷酸要低。因此，在第一次重複步驟(iv)時，靶2鏈拷貝(已經經變性從靶1鏈拷貝上解離下來)將趨向於同未延伸的寡核苷酸雜交，而同靶1鏈拷貝進行再雜交的趨勢則較前者小。這樣，在重複步驟(v)(b)時，靶2鏈拷貝同寡核苷酸的雜交將導致產生更多的靶1鏈拷貝，同時在步驟(v)(a)中更多的靶2鏈拷貝也將產生(通過先前生成的靶1鏈拷貝產生)。
步驟(iv)和(v)可按需要不斷重複。至少在此過程的前幾個循環中，每次生產步驟(v)都將生成更多量的靶2鏈拷貝，同時，當然也將會使未經延伸的寡核苷酸的量減少。這樣的早期階段將會使靶2鏈拷貝的數目呈幾何增長。在每次重複後續步驟(iv)後，靶2鏈拷貝同靶1鏈拷貝進行再雜交的可能性均將增長，這樣的結合不會導致產生更多的靶1鏈拷貝或靶2鏈拷貝。假若步驟(iv)和(v)重複得足夠地多，那麼將有這樣一點，在此點所有的或基本上所有的支持物上的原始的寡核苷酸都被延伸並產生了靶1鏈拷貝。若反應的進行能夠達到此點，則是理想的。
步驟(f)的產物包括其上固著有雙鏈核酸的固相支持系統。更確切地說，雙鏈包括一條鏈是靶1鏈拷貝，該鏈摻入有固定於支持物上的原始寡核苷酸，另一條鏈是與靶1鏈拷貝雜交的靶2鏈拷貝，該鏈摻入有感興趣的原始靶鏈的順序的拷貝。原始順序被複製的真實程度將依賴於諸如(i)在步驟(ii)中同寡核苷酸雜交的靶鏈的區域，和(ii)有步驟e(i)中同引物相雜交的靶1鏈拷貝的區域。
步驟(f)的產物可用於多種用途。首先，靶2鏈拷貝可從固定的靶1鏈拷貝上經變性解離下來。經收集，就可得到增量的感興趣的序列(增量是指同原始靶鏈的量相比)。一旦靶2鏈拷貝經變性並被從系統中移去，就可得到一固相支持系統，該系統可至少再用一次，以產生更多量的感興趣的序列，這一流程包括(vii)將引物同位點上的靶1鏈拷貝雜交，這樣，引物延伸後的產物是以靶1鏈拷貝為模板並包含有感興趣的序列。(viii)以靶1鏈拷貝作為模板延伸引物，並且(ix)產物鏈經變性從靶1鏈拷貝上解離並收集產物鏈。
步驟(vii)-(ix)優選重複至少一次，優選地是重複多次。每次重複步驟(vii)-(ix)產生的產物鏈的量基本相同。因此，以這種累加為基礎，重複步驟(vii)-(ix)導致的產物鏈的量的增加是線性的。為了最大限度地得到產物鏈，很明顯希望所有的或基本上所有的原始寡核苷酸均轉化為靶1鏈拷貝。
步驟(vi)或步驟(viii)中得到的產物的另一種用途是可用限性內切酶酶切雙鏈，使之從支持物上脫落，這種雙鏈產物可以克隆入一種載體或用作其它任意的用途。
應該清楚，本發明方法所產生的核酸能通過常規方法檢測，比如用酶標的可同核酸雜交的寡核苷酸檢測。
本發明的方法可通過多種途徑實施。
在第一種實施方案中，固定於固相支持系統上的寡核苷酸的方向是，當靶鏈雜交於其上並運用合適的酶系統時，寡核苷酸本身可延伸產生靶1鏈拷貝。這通常意味著寡核苷酸是通過它們的5′末端同固相支持系統相連，從而使延伸過程從5′向3′延伸。
在這個實施方案中，用於步驟(v)(a)中，生成靶2鏈拷貝的引物為液相引物，該引物可同靶1鏈拷貝的遠離支持物的一端的位點雜交，並向支持物端延伸以生成靶2鏈拷貝。應當理解在生成靶2鏈拷貝時，通過延伸固定的寡核苷酸可產生更多的靶1鏈拷貝(固定於支持物上)。
在最簡單的實施方法中，本發明的第一個實施方案用了一種固相支持系統，其上摻入有一種固定的寡核苷酸(用於同二條核酸鏈的一條靶鏈雜交)。在對本發明的第一個實施方案的改進方案中，固相支持系統上包含有二種不同的固定的寡核苷酸，一種寡核苷酸可同雙鏈核酸中的一條鏈雜交，而第二種寡核苷酸可同雙鏈核酸的另一條鏈雜交。應當理解伴隨這種改進，就可以生成兩類的靶2鏈拷貝，這二類拷貝是互補的並且(當雜交在一起時)可以生成至少是部分的原始雙鏈序列。
在本發明的第二個實施方案中，固定於固相支持系統上的寡核苷酸的方向是，當靶鏈同其雜交後，需引物再同靶鏈雜交並且(用合適的酶系)向著寡核苷酸延伸引物。在此種情況下，要完成靶1鏈拷貝的製備，需將引物延伸產物同寡核苷酸相連。本發明的這一實施方案通常意味著寡核苷酸足以其3′末端同固相支持系統相聯，引物(雜交於靶鏈上)的延伸是按5′到3′的方向向著支持物端進行延伸的。
對於本發明中的第二種實施方案，固相支持系統可以包括一種類型的固定的寡核苷酸或包括二種類型的固定的寡核苷酸，以產生互補的靶2鏈拷貝。
也可以將本發明實施方案1和實施方案2相結合以便使固相支持系統摻入有二種固定的寡核苷酸(同本發明的實施方案3相一致)，即(i)第一種本身可延伸以產生靶1鏈拷貝(正如本發明實施例1)的寡核苷酸，和(ii)第二種需要同引物延伸得到的產物連接的寡核苷酸(為了生成靶1鏈拷貝)，該引物是同靶鏈雜交的。
正如上面所述，固相支持系統可以摻入二種不同的固定的寡核苷酸，一種可同雙鏈核酸的一條鏈雜交，而另一種則可同雙鏈核酸的另一條鏈雜交。就本發明自身權利而言，這是一個重要的特性，因而根據本發明的第三個方面，提供了一種方法，用該方法可生成至少是部分的核酸鏈的拷貝，這些核酸存在於或潛在存在於樣品中，該方法包括以下步驟(i)提供了一種固相支持系統，其上固定有大量的二種不同的單鏈寡核苷酸0和0′，此二種寡核苷酸可以分別同雙鏈核酸的二條互補鏈中的一條雜交，也就是說互補雙鏈提供了靶1鏈和靶1′鏈，(ii)提供了單鏈形式的靶1和靶1′鏈並且使靶鏈同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數量基本超過靶鏈的數量，(iii)生成靶1和1′鏈的拷貝，每個拷貝均摻入有寡核苷酸0或0′中的一種，以及包含有同至少是部分靶1或靶1′鏈互補的一段核酸序列，即靶1或1′鏈的拷貝的合成至少在部分上是以各自的靶鏈為模板而分別進行的，從而產生了至少是部分的靶1或靶2鏈的拷貝。並且，如果需要，可生成全部的靶1和/或靶2的序列的拷貝，(iv)變性同靶1鏈拷貝相雜交的鏈並且可任選使至少是一部分前述的鏈同支持物上的有未轉化為靶1鏈的寡核苷酸再雜交，(v)同時(a)以固定於固相支持物上的靶1鏈拷貝為模板來生成靶2鏈拷貝(通過延伸同靶1鏈拷貝相雜交的引物實現)，後者含有感興趣的核酸序列，並且(b)如果該靶鏈已雜交於固定的寡核苷酸上的話，則用該靶鏈作為模板來進一步產生至少含部分靶1鏈的拷貝，並且(如果需要)可生成全部的靶1鏈拷貝，並且(vi)按所需次數重複步驟(iv)和(v)，以靶2鏈拷貝為模板，每次重複步驟(iv)和(v)都將進一步生成靶1鏈的拷貝。
本發明將用與附圖有關的實施例進一步說明，其中

圖1描述了裝置的一個實施方案，本發明的方法可通過此種裝置實施；圖2簡要描述了本發明實施方案1中的各步的過程；圖3簡要描述了本發明實施方案1中的一個另外的流程；圖4簡要描述了本發明實施方案2的流程；圖5簡要描述了本發明第二種實施方案中的一個另外的流程；圖6簡要描述了本發明的第三種實施方案的一個的流程；圖7簡要描述了本發明第三種實施方案的一個另外的流程；圖8和圖9圖示實施例1的結果；並且圖10和圖11圖示實施例2的結果。
首先參看圖1，圖中所示的裝置包括一個可流動通過的柱子1，柱中間是一個橫放的隔板，隔板上有顆粒支持物PA，隔板下是顆粒支持物PB。PA和PB分別含有固定於其上的寡核苷酸3和4，詳情見下。隔板2可允許液體流過但顆粒PA和PY不能通過。但是也可以不要隔板2而將支持物PA和PB混合在一起，這樣亦可行。
同柱2相連的是進流裝置，如圖所示。可加入雜交緩衝液，酶，核苷酸及清洗液。此外同柱2相連的還有貯存器5，從柱中流出的產物可注入其中並且也可將其中的產物再重新上柱。提供的加熱器6是在需要時加熱柱1的。最後，圖示的多個閥門的使用是用來將試劑加入或移出柱中。將液體加入或移出柱子可用注射器實現，比如正排量(positivedisplacement)注射器。
支持物PA和PB可以是如WO-A-93/13220中所述那樣。這樣，支持物是固相二氧化矽，其外表有矽氧烷基質，寡核苷酸3和4可(分別)結合於該基質上。寡核苷酸同支持物結合的方式在WO-A-93/13200中有記述。
支持物PA和PB僅在結合的寡核苷酸上有區別。考慮到DNA分子包含互補可雜交的鏈A和鏈B。固定於支持物PA上的寡核苷酸可同鏈A(當從鏈B上變性解離)雜交，同時，支持物PB上的寡核苷酸可以同鏈B雜交。
現在來參看圖2，該圖顯示了本發明的第一個實施例的運用，可用來生產令人感興趣的雙鏈序列的拷貝，雙鏈序列分別含有X、Y序列。柱子包括兩類顆粒，圖2中稱為P1和P2。為了圖解，鏈X和Y在其末端區假定含有任意的鹼基序列。
所包括的步驟如下1.含靶序列的DNA或者是柱外變性後然後加入柱中，或者是雙鏈DNA先加入柱中再原位變性。這二種情況中，DNA的變性是通過升高溫度或同化學物質接觸實現，這在本領域內是已知的。任意一種情況下，變性DNA在柱中同支持物混合。然後將柱子降溫，以使得靶物同顆粒上的寡核苷酸是可進行雜交。雜交反應在一很精確的溫度下發生，該溫度對於支持物上的核酸順序同靶物順序的結合是特異的(稱為反應的Tm(熔解溫度))。Tm由靶序列中鹼基的組成比率決定。含高的AT比值的DNA在均低的溫度下熔解，而含高的GC比值的DNA的熔解溫度則較高(在任意給定鹽濃度下)。
如圖所示，序列X(靶)的3′末端具有序列AAAA。(通過5′末端)固定於顆粒P1上的寡核苷酸含有序列TTTT，即該序列可同序列X的3′末端雜交，因而該鏈可被捕獲(步驟(b))。
Z鏈(靶)，如圖所示，在其3′末端有序列GGGG。(通過5′末端)固定於顆粒P2上的寡核苷酸有序列CCCC，其可同Y鏈3′末端區雜交，因此此鏈也可被捕獲(步驟(b))。2.在清洗柱子移去雜質(包括非靶物質、DNA、蛋白質，這些物質均有抑制作用)，脂類及鹽後，柱子繼續使用一種緩衝液清洗，該緩衝液對於方案中下一步的進行是有益的。然後加入聚合酶及核苷酸來延伸柱上結合的寡核苷酸，這些寡核苷酸可作為引物，因而可從引物複製被捕獲的鏈(步驟(c))從而生成固定於支持物上的靶1鏈拷貝。3.一旦反應完成，可清洗柱子以除去不想要的(未用的)試劑。4.其後，可將靶鏈從固定的靶1鏈拷貝上經變性解離(步驟(d))並且可同未經延伸的寡核苷酸再雜交，因為未經延伸的寡核苷酸的數量要遠遠大於原始的雙鏈分子的最初的量。5.在下一步(步驟(f))中，如圖所示，具有序列TTTT和CCCC的游離引物(溶相)被加入並同共價聯結顆粒P1和P2的那些鏈雜交。通過清洗步驟將過量的游離引物洗出柱子。6.現在加入酶和核苷酸(步驟(g))，以便使對於每個P1和P2顆粒，兩個延伸反應都同時發生，即(i)延伸那些同核酸鏈雜交，並被共價固定於支持物上的寡核苷酸(比如P1上的)TTTT(這一反應的方向是遠離支持物P1和P2的)以生成靶1鏈拷貝，並且(ii)延伸那些同共價固定於支持物上的鏈相雜交的游離引物(比如對於P1是CCCC)(這一麼應發生的方向是朝向支持物P1和P2)，這樣生成靶2鏈拷貝。
步驟(i)可使在顆粒P1上合成共價固定於支持物上的序列Z，另外該步可使在顆粒P2上合成共價固定於支持物上的序列X。步驟(ii)可導致顆粒P1上的序列X及顆粒P2上的序列Z的合成。這是以幾何級數複製靶DNA的開始。7.然後可以清洗柱以移去不需要的試劑。8.步驟(d)-(g)可按照所需次數重複。
在支持物上有大量過量的原始的固定寡核苷酸。因而，本過程起初的循環將按下進行(只考慮顆粒P1)。假定在步驟(g)結束時，顆粒P1有二條共價固定的鏈Z及二條同鏈Z雜交的鏈X。在第一次重複步驟(d)-(n)時，隨之的結果將是4條鏈X和鏈Z。在下一次重複後將每鏈有8條，等等。然而這種指數增長將受到固定於支持物上的寡核苷酸數目的限制。這樣，步驟(g)中合成的雜交鏈的量將漸漸增至這樣的水平在隨後的變性和再雜交步驟中(步驟(d)和(e))，一些鏈X將同未延伸的寡核苷酸雜交。而另外一些將同鏈Z雜交，而鏈Z是通過延伸固定的引物得到的。最後，所有固定引物都將被延伸並且顆粒P1上的雙鏈核酸將會飽和。(該結論對於P2同樣有效)。
雙鏈核酸可以從支持物上切下來(用合適的限性酶)。另一辦法是將步驟(g)中得到的靶2鏈拷貝產物經變性從支持物上解離下來。然後重複下列步驟，用其來產生按線性增長的靶2鏈拷貝。(i)將引物CCCC和TTTT同固定的靶1鏈拷貝雜交，(ii)延伸引物，並且(iii)變性並收集延伸產物(即靶2鏈拷貝)。
現在來談圖3，該圖顯示了圖2所示方案的一個改進方案。圖3中的方案以一雙鏈核酸開始，其中其X鏈有任意序列，正如圖示。在5′端為A，3′端為B，而另一條鏈則有任意末端序列C、D(A同C互補，B同D互補)。在A和B之間，部分的X鏈為序列L，同Y鏈上的序列M互補。
提供兩類顆粒P1和P2。顆粒P1上帶有大量的序列為M的寡核苷酸，後者通過5″末端固定於(顆粒支持物P1)上。顆粒P2上帶有大量的序列為L的寡核苷酸，後者通過5′末端固定於(顆粒支持物P2)上。
圖3中的方案同圖2中的一樣，也包括方案的各個步驟，因此不再贅述。但下列幾點需要指出在圖2的方法中，兩個固定的寡核苷酸(TTTT和CCCC)使得合成出的靶1鏈拷貝有互補的鹼基序列。這是由於一條寡核苷酸(CCCC)同序列X的末端相對應，而另一寡核苷酸(TTTT)同序列Z鏈的另一末端相對應。
與之相比，在圖3的方法中，鏈X是通過其中間區L同顆粒P1上的寡核苷酸M相雜交並且鏈Z是通過其中間區M同顆粒P2上的寡核苷酸L相雜交。在下面的延伸步驟中(步驟(c))，顆粒P1上產生的靶1鏈拷貝有如下序列5′M……………………………C3′同時顆粒P2上產生的則有如下序列5′L……………………………B3′這樣，這二種靶1鏈拷貝是不互補的。
在步驟(e)中，顆粒P1上靶2鏈拷貝產物的序列為3′L……………………………A5′這代表了部分的原始鏈X的拷貝，同樣，顆粒P2產生的靶2鏈拷貝產物的序列為3′M……………………………D5′也只代表了部分的原臺鏈Z的拷貝。
現在來說明圖4，圖4顯示了本發明的第二種實施方案。
本方法以雙鏈DNA開始，DNA含二鏈X、Y。在柱中用了二種顆粒P3和P4。
第一種顆粒P3上，寡核苷酸GGGG(通過其3′末端)固定於P3上，其可同鏈X的5′末端雜交。
寡核苷酸AAAA(也通過其3′末端)固定於另一種顆粒P4上，其將與鏈Z的5′末端區雜交。
變性靶DNA並同顆粒P3和P4雜交後，清洗顆粒去除汙染物(同前)。雜交反應捕獲感興趣的序列。
加入兩種游離產物(CCCC和TTTT)並同顆粒結合的DNA雜交。引物(TTTT)將同鏈X3′末端區雜交。另一引物(CCCC)將同鏈Z的3′末端雜交(步驟c)。
然後清洗顆粒來除去多餘的試劑。
向柱中加入酶的核苷酸(也有這樣的可能，即此步中同時加入引物)並且進行延伸反應，延伸反應將引物向支持物的方向延伸，但不連接到固定的寡核苷酸上(步驟d)。「**」在步驟(d)產物中代表延伸產物不同固定的寡核苷酸連接。
加入DNA連接酶使延伸(引物所得的)產物同固定的寡核苷酸連接，這樣就產生了固定於支持物上的靶1鏈拷貝(步驟e)。
在變性和再雜交後(步驟f)，再加入二種引物TTTT和CCCC。引物TTTT，同P4顆粒上的靶1鏈拷貝的3′末端雜交，並且也同顆粒P3上的已雜交的核酸雜交。同樣，引物CCCC也同固定於顆粒P3上的靶1鏈拷貝3′末端雜交，並且亦同顆粒P4上的已雜交的核酸雜交。
清洗柱子以除去過剩試劑。加入聚合酶及核苷酸並進行延伸反應(步驟g和h)。引物照圖所示延伸(產生靶2鏈拷貝)，然後(在清洗柱後)來進行連接反應，來完成在支持物P3和P4上的靶1鏈拷貝的製備。
步驟(f)-(i)可按所需次數重複以生成大量的靶1拷貝鏈和靶2拷貝鏈。後者最終被作為產物收集而前者(固定於其支持物上)可用來按前述的辦法生產更多的靶2鏈拷貝。
現在來談圖5，該圖顯示了圖4中方案的一個改進方案。
同圖3中相同，圖5中方案也以同樣的雙鏈DNA開始。此外，圖5中的方法用二種類型的顆粒，稱為顆粒P3，序列為M的寡核苷酸通過其3′末端固定於P3上，顆粒P4，序列為L的寡核苷酸通過其3′末端轉化於P4上。
圖5中的方法的各步反應次序同圖4中的一樣。圖5中的方法的產物包括固定有靶1鏈拷貝序列的支持物3′M…………………………D5′和3′L…………………………A5′這些支持物可用來產生更多的這些序列5′L…………………………B3′和5′M…………………………C3′這些序列存在於原雙鏈核酸中。
現在來說明圖6，該圖敘述了一種方法，該方法同本發明的第三種實施方案一致，是圖2和圖4中方法的結合。在圖6的方法中，第一種類型的顆粒通過3′末端(參看圖2中的P1顆粒)P5捕獲序列X(原始雙鏈核酸中的X序列)。第二種類型的顆粒P6則通過5′末端(參看圖4中的顆粒P4)來捕獲序列Y。
總的反應流程在圖6中描述。顆粒P5上進行的反應順序同顆粒P1上進行的很相似。P6上進行的各反應步驟則同顆粒P4上進行的一致。儘管顆粒P5和P6在一個柱中，但P6上發生的直接反應對P5無影響。
圖6的方法中產生的支持物可用來產生增量的X和Y序列，X和Y序列是存在於原始核酸中的。
圖6中的方法可以經改進而按圖7所示進行操作，它也是從圖3中所示的核酸類型開始。在圖7中，顆粒P5上具有序列為M的並通過5′末端固定於P5上的寡核苷酸(參見圖3中的P1顆粒)，同樣，P6顆粒上具有序列為L的並通過其3′末端固定於P6上的寡核苷酸(參看圖5中的P4顆粒)。圖7中的反應的順序同圖5或圖6中的相同。在這些步驟中，顆粒P5的功能同圖3中的顆粒P1相同，而顆粒P6的功能同圖5中的顆粒P4的目同。
圖7中的方法產生的支持物可用來生成增量的下列序列3′M…………………………C5′和3′L…………………………A5′這些序列存在於原始核酸樣品中。
參考下面非限定性的實施例，該發明通過實施例來闡述。實施例1在本實施例中，「緩衝液」指包括10mM Tris-HCl pH8.3，50mM KCl和1.5mM MgCl2的組合物。
24聚體寡核苷酸序列如下(I)(I)5′GGC GTC ATC ATG GTC ATA GCT GTT 3′將(I)通過其5′末端固定於顆粒支持物上(大小為105μm)，該顆粒以M-相的名子在3M有售，固定是用WO-A-93/13220(Tepnel)中描述的方法通過矽氧烷基質的實現的。每克顆粒支持物中含50μmol的過量的序列(I)。
在5個流過柱(flow through)裝置中每個裝入2mg的支持物，柱子內徑為2mm。支持物通過相距10mm的二塊過濾器板(frits)保持其位置。
向每個柱中加入25fmol的溶於緩衝液中的48聚體寡核苷酸，其序列(II)為(II)5′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGC TATGAC CAT GAT TAC GCC 3′然後將柱子在95℃保溫10分鐘。將溫度減至72℃。這一流程將使序列(II)同固定的序列(I)雜交。
用緩衝液清洗柱子，並將溫度降至57℃，再向柱中加入緩衝液，其中含有4種dNTP，每種0.2mM，以及1.25單位的聚合酶(棲熱水生菌)。
將柱子保溫於57℃2分鐘以與之雜交的48聚體寡核苷酸作模板延伸固定的24聚體寡核苷酸(序列(I))。
然後將柱子的溫度增至95℃，保溫2分鐘使48聚體序列(II)同延伸序列(I)變性解離。
將柱溫冷卻至72℃，向其中加入緩衝液，該緩衝液含有4種dNTP，每種0.2mM，以及1.25單位聚合酶(棲熱水生菌)和25pmol的生物素化的24聚體寡核苷酸，其序列(ii)為(III)5′AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′在72℃下保溫2分鐘以使序列II同未經延伸的序列(I)雜交，並使序列(III)同已延伸的序列(I)雜交。然後將柱子冷卻至57℃，保溫2分鐘以延伸序列(I)和(III)。
收集一個柱子中的支持物作下面敘述的檢測步驟之用。
剩下的柱子用上面詳述的方案再作以下的循環95℃變性(2分鐘)，加入序列(II)並在72℃再雜交(2分鐘)，57℃延伸(2分鐘)(儘管可用更短的時間)。在4個、9個、19個和29個循環後，收集支持物。(因此這些樣品分別經過了5次、10次、20次和30次的延伸反應)。
空白的實驗按下面所述進行。(a)一個柱子中含有其上固定有序列(I)的支持物及緩衝液。該柱用上面所述的方案來進行循環，但不向其中補加核酸或反應試劑。
所有收集到的樣品均用於下面的檢測方案。
收集的顆粒同鏈黴親和素-鹼性磷酸酶複合物反應。過量的複合物經洗滌移去，然後用商業出售的鹼性磷酸酶檢測系統(Ampak exDako)來處理顆粒。處理能使樣品隨時間而顯色並可在490nm下觀測。結果見圖8，該圖為吸收值對擴增溫育時間作圖。圖9是吸收值變化率對樣品經歷的延伸循環數作用。
從這些數據可清楚地看出擴增是指數擴增。實施例2除了序列(I)、(II)和(III)用下列序列(Ia)，(Iia)和(IIIa)分別代替之外，實施例1中的方案被重複應用。(Ia)5′ AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA 3′(IIa)5′ GGC GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT TCC TGT GTGAAA TTG TTA TCC GCT 3′(IIIa)5′GGC GTA ATC ATG GTC ATA GCT GTT 3′此外，對照實驗照下面的進行(b)用非互補(同序列(I))的生物素化的24聚體寡核苷酸作探針檢測一個含有已延伸的序列(I)的柱，該探針序列為5′CGC CAT TCA GGC TGC CGA ACT GTT 3′(c)一個柱子，其上含有固定有已延伸的序列(I)的支持物，保溫於4℃中作為循環為0的對照。
結果分別作圖，即圖10和圖11。可再次看出擴增是按指數進行的。
應該理解序列(II)和(Iia)是互補的。因為這樣就可通過用固定有序列(I)的顆粒同固定有序列(Ia)的顆粒的組合來實現序列(II)和(IIa)的擴增。
權利要求
1.一種生成至少是部分存在或潛在存在於樣品中的核酸鏈(靶鏈)拷貝的方法，該方法包括以下步驟(i)提供一種固相支持系統，其上固定有大量的能同靶鏈雜交的單鏈寡核苷酸。(ii)提供了靶鏈的單鏈形式並將其同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數量要大大超出靶鏈的數量，(ii)(a)清洗支持系統以除去未雜交的物質，(iii)生成靶1鏈的拷貝，該拷貝摻入有固定的寡核苷酸及包含同至少是部分靶鏈互補的核苷酸序列，也就是說生成的靶1鏈拷貝至少有一部分是以靶鏈為模板而生成的，並且，如果需要，可完成靶1鏈拷貝序列形成。(iv)變性同靶1鏈拷貝雜交的核酸鏈並且可選擇使至少是部分的前述鏈同支持物上的未轉變成靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交。(v)同時，(a)用固定於固相支持物上的靶1鏈拷貝為模板來合成(從雜交於靶1鏈拷貝的引物上合成)靶2鏈拷貝，靶2鏈拷貝含有感興趣的核酸序列，且(b)若靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，則可用其作為模板來合成更多的至少是部分的靶1鏈拷貝，並且(若需要)完成靶1鏈的形成，並且(vi)按所需次數重複步驟(iv)和(v)，每次重複步驟(iv)和(v)均用靶2鏈拷貝來生成更多的靶1鏈拷貝。
2.權利要求1的方法，其中的固相支持系統是一種顆粒系統，寡核苷酸被固定於顆粒上，
3.生成至少是部分核酸鏈(靶鏈)的拷貝的方法，靶鏈存在或潛在存在於樣品中，本方法包括步驟(i)提供一種顆粒固相支持系統，其上固定有大量的能同靶鏈雜交的單鏈寡核苷酸，(ii)提供了靶鏈的單鏈形式並且使靶鏈同固定於支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數量要大大超過靶鏈的數量，(iii)生成靶1鏈拷貝，該拷貝包括固定的寡核苷酸及同至少是部分靶鏈互補的核酸序列，即生成的靶1鏈拷貝至少有一部分是以靶鏈為模板而合成的，並且，如果需要，可完成靶1鏈拷貝序列的形成，(iv)變性同靶1鏈拷貝雜交的核酸鏈並且可選擇使至少部分的前述的鏈同支持物上的尚未轉變成靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交，(v)同時，(a)用固定於固相支持物上的靶1鏈拷貝為模板來生成(從雜交於靶1鏈拷貝的引物上合成)靶2鏈拷貝，靶2鏈拷貝含有感興趣的核酸序列，且(b)若靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，則可用其作為模板來進一步合成更多的至少是部分的靶1鏈拷貝，並且(若需要)完成靶1鏈拷貝的形成，並且(vi)按所需次數重複步驟(iv)和(v)，每次重複步驟(iv)和(v)均用靶2鏈拷貝來生成更多的靶1鏈拷貝。
4.權利要求3的方法，其中在步驟(ii)後，在執行步驟(iii)前清洗支持系統以移去未雜交的物質。
5.權利要求2到4的任一項的方法，其中顆粒是非多孔性二氧化矽
6.權利要求2到5任一項的方法，其中顆粒的大小在50到200微米。
7.權利要求2到6任一項的方法，其中寡核苷酸是通過矽氧烷基質固定於支持物上的。
8.權利要求2到7的任一項的方法，其中顆粒是在柱子中，液體可方便地加入或移出柱子。
9.權利要求1到8的任一項的方法，其中所有的或基本上所有的固定於支持物上的原始寡核苷酸都轉變成靶1鏈拷貝。
10.權利要求1到9的任一項的方法，其中支持物上的寡核苷酸的方向使得它們可以用靶鏈作為模板進行延伸或者是用雜交於其上的靶2鏈拷貝作為模板進行延伸，以產生靶1鏈拷貝。
11.權利要求2的方法，其中固相支持系統上包含兩種不同的固定的寡核苷酸，其方向如權利要求10中所述，一種的方向是使其能同雙鏈核酸的一條鏈雜交，另一種的方向是使其同雙鏈核酸的另一條鏈雜交。
12.權利要求1到9的任一項的方法，其中靶1鏈拷貝是這樣產生的，使引物同已經與固定的寡核苷酸雜交的靶拷貝或靶2鏈拷貝雜交，然後在步驟(v)(b)中向著寡核苷酸方向延伸引物，最後通過與寡核苷酸的連接來完成靶1鏈拷貝的製備。
13.權利要求11的方法，其中固相支持物上包含兩種不同的固定的寡核苷酸，其方向和權利要求12中所述，一種的方向是使其能同雙鏈核酸的一條鏈雜交，另一種的方向是使其能同核酸的另一條鏈雜交。
14.權利要求1到13的任一項的方法，其中固相支持系統包含兩種固定的寡核苷酸，包括(i)第一種可通過延伸其自身來生成靶1鏈拷貝的寡核苷酸，(ii)第二種(為了生成靶1鏈拷貝)需要同引物延伸生成的產物連接的寡核苷酸，引物同靶鏈雜交。
15.產生至少是部分存在於或潛在存在於樣品中的核酸鏈拷貝的方法，該方法包括下列步驟(i)提供了一種固相支持系統，其上固定有大量的兩種單鏈寡核苷酸0和0′中的每一種，每種寡核苷酸可同雙鏈核酸互補鏈中的一條雜交，互補的核酸二條鏈稱為靶1鏈和靶1′鏈，(ii)提供單鏈形式的靶1和靶1′鏈並使之同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數量要基本超過靶鏈的數量，(iii)生成靶1和1′鏈拷貝，每個拷貝均包含各自的寡核苷酸0或0′且核酸序列至少有一部分同靶1或靶1′鏈分別互補，即生成的靶1和靶1′鏈拷貝至少有一部分是以各自的靶鏈作為模板而合成的，並且，若需要，完成靶1序列和/或靶1′序列的拷貝的形成，(iv)變性同靶1和靶1′鏈拷貝雜交的靶1和靶1′鏈並且可任選將至少是部分的靶1和靶1′鏈同支持物上的尚未轉化成靶1鏈或靶1′鏈拷貝的寡核苷酸再雜交，(v)同時(a)用固定於固相支持物上的靶1和靶1′鏈拷貝作為模板來分別生成(從與靶1和靶1′鏈拷貝雜交的引物上生成)靶2和靶2′鏈拷貝並且(b)如果靶1和靶1′鏈拷貝已同固定的寡核苷酸雜交，則可以將其作為模板來進一步生成更多的至少是部分的靶1和靶1′鏈拷貝，並且(如果需要)可完成靶1鏈拷貝的形成，並且(vi)按所需次數重複步驟(iv)和(v)，每次重複步驟(iv)和(v)均用靶2和靶2′鏈拷貝來生成更多的靶1和靶1′鏈拷貝。
16.此前任意一項權利要求的方法還包括以下步驟(vii)將引物同靶1鏈拷貝在特定位點雜交以使用靶1鏈拷貝作為模板來延伸引物得到的產物含有感興趣的序列，(viii)用靶1鏈拷貝作為模板延伸引物，並且(ix)將產物鏈從靶1鏈拷貝上變性解離。收集產物鏈。
17.生產至少是部分核酸鏈(「靶鏈」)拷貝的方法，把鏈存在於或潛在存在於樣品中，該方法包括的步驟有(i)提供了一種固相支持系統，其上固定有大量的單鏈寡核苷酸，寡核苷酸能同靶鏈雜交，(ii)提供了靶鏈的單鏈形式，並使之同支持物上的寡核苷酸雜交，寡核苷酸的數量大大超過靶鏈的數量，(iii)產生靶1鏈拷貝，其包括固定的寡核苷酸以及含有至少有一部分同靶鏈互補的核酸序列，即生成的靶1鏈拷貝其序列至少有一部分是以靶鏈作為模板而生成的，並且，如果需要，可完成靶1序列拷貝的形成，(iv)將同靶1鏈拷貝雜交的鏈變性並且可任選將至少是部分的前述鏈同支持物上的尚未轉化成靶1鏈拷貝的寡核苷酸再雜交，(v)同時(a)用固定於固相支持物上的靶1鏈拷貝作為模板來生成(從同靶1鏈拷貝雜交的引物上)靶2鏈拷貝，靶2鏈拷貝中含有感興趣的核酸序列，並且(b)若靶鏈已同固定的寡核苷酸雜交，則可以其作為模板來進一步合成更多的至少是部分靶1鏈的拷貝，並且(如果需要)可完成靶1鏈拷貝的形成，且(vi)按所需次數重複步驟(iv)和(v)，每次重複均可用靶2鏈拷貝來進一步生成更多的靶1鏈拷貝。(vii)將引物同靶1鏈拷貝在特定位點雜交以使用靶1鏈拷貝為模板延伸的延伸產物包含有感興趣的序列(viii)用靶1鏈拷貝作為模板來延伸引物，並且(ix)將產物鏈從靶1鏈拷貝上變性解離並收集該產物鏈。
全文摘要
公開了一種方法，該方法用固定在固相支持物上的寡核苷酸來擴增核酸。靶核酸鏈(樣品中待分析)同寡核苷酸雜交並且用靶鏈作為模板來生產靶鏈拷貝(包含固定的寡核苷酸)。將靶鏈從靶鏈拷貝上變性解離並同未延伸的寡核苷酸再雜交。在下一步中，從與靶鏈雜交的寡核苷酸上合成出新的靶(1)鏈拷貝，並且用前面生成的靶(1)鏈拷貝可同時合成出靶(2)鏈拷貝。按所需的次數不斷重複下列步驟變性，再雜交，生成靶(1)和靶(2)鏈拷貝，就可以得到理想的擴增度。
文檔編號C12Q1/68GK1152946SQ9519420
公開日1997年6月25日 申請日期1995年5月30日 優先權日1994年5月28日
發明者S·J·明特 申請人:特普尼爾醫學有限公司