人類原癌基因及其編碼的蛋白的製作方法

2023-05-12 03:11:56 3

專利名稱：人類原癌基因及其編碼的蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的原癌基因，其與之前報導的原癌基因無同源
性，但具有誘導癌症轉移的能力；還涉及其編碼的蛋白。
背景技術：
已知高等動物包括人通常具有大約30,000個基因，^f旦每一個個 體中^f又表達所述基因的約15%。因此，研究發現所有生命現象即生 殖、分化、穩態、對刺激的反應、細胞周期控制、衰老和凋亡(程 序性細胞死亡)等均依賴於哪些基因^皮選"^並表達(Liang, R and A. B. Pardee, 257: 967-971， 1992 )。
病理現象例如腫瘤生成是通過遺傳變異引起基因表達的改變 而誘導。因此，比較不同細胞之間的基因表達可能是理解多種生物 學才幾制的才艮本而主要的途徑。例如，由Liang和Pardee才是出的mRNA 差異顯示法(Liang, P. and A. B. Pardee, 5Wewce 257: 967-971, 1992 ) 已經有效用於搜尋胂瘤抑制基因、細胞周期調節相關基因以及凋亡 相關的轉錄調節基因等，並且也廣泛應用於詳細i兌明〗又在一個細月包 內發生的不同基因的聯繫。
綜合腫瘤生成的多個結果，現在已經才艮道了多種遺傳改變例如 喪失特異性染色體雜合性、原癌基因的激活以及其他腫瘤抑制基因 包括p53基因的失活在。腫瘤組織中累積而形成人類腫瘤(Bishop, J. M.， Ce〃 64: 235-248, 1991; Hunter, T., Ce// 64: 249-270， 1991 )。而且，
據報導10-30%的癌通過擴增原癌基因而活化。因此，原癌基因的 激活在多種癌症的病因學研究中發揮重要的作用，而且科研人員已 經多方嘗^式以-洋細i兌明該作用。
因此，本發明者發現一種用於產生肺癌及宮頸癌的機制在原癌 基因水平作了研究，因此該原癌基因，命名為人類遷移誘導基因， <又在癌細胞中表現出特殊增高的表達水平。該原癌基因可有效用於 -珍斷、予貞防和治療多種癌症例3o月市癌、白血病、子宮癌、淋巴瘤、
結腸癌、皮等。

發明內容
因此，設計本發明以解決該領域現存的問題，因此本發明的一 個目標是提供新的原癌基因及其片段。
本發明的另一個目標是提供包括所述每一種原癌基因及其片 —敬的重組載體以及由所述重組載體中每一種所轉化的樣i生物。
本發明的另外 一 個目標是提供由每一種所述原癌基因編碼的 蛋白及其片段。
本發明的另外一個目標是提供用於i貪斷瘙症及癌症轉移的試 劑盒，其包括每一種所述原癌基因或其片段。
本發明的另外一個目標是提供用於"^斷癌症及癌症轉移的試 劑盒，其包括每一種所述蛋白或其片段。
為了實現上述目標，本發明提供了一種具有DNA序列SEQID NO: 1的原癌基因或其片段。
根據另 一 個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體；以及由該重組載體專^f匕的孩吏生物。
根據另外一個目標，本發明提供了 一種具有胺基酸序列SEQ ID NO:2的蛋白或其片段。
本發明4是供了一種具有DNA序列SEQ ID NO: 5的原癌基因或 其片段。
根據另 一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的微生物。
才艮據另外一個目標，本發明4是供了一種具有胺基酸序列SEQ ID NO: 6的蛋白或其片^殳。
本發明提供了 一種具有DNA序列SEQ ID NO: 9的原癌基因或
其片段。
根據另 一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的樣i生物。
根據另外一個目標，本發明提供了一種具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10的蛋白或其片4殳。本發明才是供了一種具有DNA序列SEQ ID NO: 13的原癌基因或其片4殳。
根據另 一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的樣i生物。
根據所述另外一個目標，本發明提供了一種具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 14的蛋白或其片4殳。 本發明提供了一種具有DNA序列SEQ ID NO: 17的原癌基因 或其片段。根據另 一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的孩t生物。根據另外一個目標，本發明提供了 一種具有胺基酸序列SEQ ID NO: 18的蛋白或其片段。本發明才是供一種具有DNA序列SEQ ID NO: 21的原癌基因或 其片段。根據另一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的糹鼓生物。根據另外一個目標，本發明提供了 一種具有胺基酸序列SEQ ID NO: 22的蛋白或其片段。本發明提供了一種具有DNA序列SEQ ID NO: 25的原癌基因 或其片H根據另 一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重《且載體專爭〗匕的孩i生物。根據所述另外一個目標，本發明提供了一種具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 26的蛋白或其片革殳。本發明才是供了一種具有DNA序歹'J SEQ ID NO: 29的原癌基因 或其片段。根據另一個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的微生物。
根據另外一個目標，本發明提供了 一種具有胺基酸序列SEQ ID NO: 30的蛋白或其片段。本發明提供了一種具有DNA序列SEQ ID NO: 33的原癌基因 或其片段。根據另 一 個目標，本發明提供了包含所述原癌基因或其片段的 重組載體以及由該重組載體轉化的孩t生物。根據另外一個目標，本發明提供了 一種具有胺基酸序列SEQ ID NO: 34的蛋白或其片^:。根據所述另外一個目標，本發明提供了用於診斷癌症以及癌症 轉移的試劑盒，包括所述原癌基因及其片段。才艮據另外一個目標，本發明才是供了用於it斷癌症以及癌症轉移 的試劑盒，包括所述原癌蛋白及其片段。


本發明優選的具體實施方式
的這些和其它特徵、方面及優勢將 在下面的詳細i兌明中結合附圖估支充分闡述。在附圖中圖l是一個凝月交圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定L276811 DNA片段是否在正常肺組織、左側肺癌 組織、從左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌細胞中 表達；圖2是一個凝月交圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定CC231 DNA片革殳是否在正常外子宮頸組織、宮頸 月中瘤組織、轉移性淋巴結腫瘤組織以及CUMC-6癌細胞中表達；圖3是一個凝月交圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定L789DNA片段是否在正常肺組織、左側肺癌組織、 乂人左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌細胞中表達；圖4是一個凝膠圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定L986DNA片段是否在正常肺組織、左側肺癌組織、 從左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌細胞中表達；圖5是一個凝膠圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定L1284 DNA片段是否在正常肺組織、左側肺癌組 織、從左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌細胞中表 達；圖6是一個凝月交圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定CA367 DNA片,殳是否在正常外子宮頸組織、宮頸 肺瘤組織、轉移性淋巴結腫瘤組織以及CUMC-6癌細月包中表達；圖7是一個凝膠圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定CA335 DNA片,殳是否在正常外子宮頸組織、宮頸 腫瘤組織、轉移性淋巴結腫瘤組織以及CUMC-6癌細胞中表達；圖8是一個凝月交圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定CG263 DNA片^殳是否在正常外子宮頸組織、宮頸 腫瘤組織、轉移性'淋巴結腫瘤組織以及CUMC-6癌細月包中表達；圖9是一個凝月交圖，示出了差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR) 的結果，以確定CG233 DNA片l殳是否在正常外子宮頸組織、宮頸 腫瘤組織、轉移性淋巴結腫瘤組織以及CUMC-6癌細胞中表達；圖10 (a)是一個凝膠圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本 發明的原癌基因MIG3是否在正常肺組織、左側肺癌組織、從左肺
轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549和NCI-H358肺癌細胞系 中表達。圖lO(b)是一個示圖，示出了通過將圖10(a)中的相 同樣品與(3 -肌動蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖ll是一個凝月交圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明 的原癌基因MIG8是否在正常外子宮頸組織、子宮癌組織、轉移性 宮頸淋巴結組織以及宮頸癌細月包系中表達；圖12是一個示圖，示出了通過將圖11中的相同樣品與(3-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖13 (a)是一個凝膠圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本 發明的原癌基因MIGIO是否在正常肺組織、左側肺癌組織、乂人左 肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549和NCI-H358肺癌細胞 系中表達。圖13 (b)是一個示圖，示出了通過將圖13 (a)中的 相同才羊品與p -月幾動蛋白糹笨4十雜交所獲4尋的RNA印跡結果；圖14 (a)是一個凝月交圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本 發明的原癌基因MIG13是否在正常肺組織、左側肺癌組織、從左 肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549和NCI-H358肺癌細胞 系中表達。圖14(b)是一個示圖，示出了通過將圖14(a)中的 相同樣品與p -月幾動蛋白神罙針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖15 (a)是一個凝膠圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本 發明的原癌基因MIG14是否在正常肺組織、左側肺癌組織、從左 肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549和NCI-H358肺癌細胞 系中表達。圖15(b)是一個示圖，示出了通過將圖15 (a)中的 相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果； 圖16是一個;疑月交圖，示出了 RNA印跡的結果，以確定本發明 的原癌基因MIG18是否在正常外子宮頸組織、子宮癌組織、轉移 '性宮頸'淋巴結組織以及宮頸癌細月包系中表達；圖17是一個示圖，示出了通過將圖16中的相同樣品與(3-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖18是一個凝月交圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明 的原癌基因MIG19是否在正常外子宮頸組織、子宮癌組織、轉移 性宮頸淋巴結組織以及宮頸癌細胞系中表達；圖19是一個示圖，示出了通過將圖18中的相同樣品與P-月幾動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖20是一個凝膠圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明 的原癌基因MIG5是否在正常外子宮頸組織、子宮癌組織、轉移性 宮頸'淋巴結組織以及宮頸癌細月包系中表達；圖21是一個示圖，示出了通過將圖20中的相同樣品與P-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖22是一個凝膠圖，示出了 RNA印跡的結果，以確定本發明 的原癌基因MIG7是否在正常外子宮頸組織、子宮癌組織、轉移性 宮頸淋巴結組織以及宮頸癌細胞系中表達；圖23是一個示圖，示出了通過將圖22中的相同樣品與P-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖24(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG3是否在12個泳道的多個人類正常組織中表達，
圖24 (b)是一個示圖，示出了通過將圖24 (a)中的相同樣品與 P -肌動蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖25是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG8是否在12個泳道的多個人類正常組織中表達；圖26是一個示圖，示出了通過將圖25中的相同樣品與P-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖27(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG10是否在12個泳道的多個人類正常組織中表 達，圖27 (b)是一個示圖，示出了通過將圖27 (a)中的相同才羊 品與(3 -肌動蛋白^罙針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖28(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG13是否在12個泳道的多個人類正常組織中表 達，圖28 (b)是一個示圖，示出了通過將圖28 (a)中的相同樣 品與p -月幾動蛋白#笨針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖29(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG14是否在12個泳道的多個人類正常組織中表 達，圖29 (b)是一個示圖，示出了通過將圖29 (a)中的相同樣 品與P -肌動蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖30是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG18是否在12個泳道的多個人類正常組織中表達；圖31是一個示圖，示出了通過將圖30中的相同樣品與(3-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；
圖32是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG19是否在12個泳道的多個人類正常組織中表達；圖33是一個示圖，示出了通過將圖32中的相同樣品與(3-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖34是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG5是否在12個泳道的多個人類正常組織中表達；圖35是一個示圖，示出了通過將圖34中的相同樣品與(3-肌動 蛋白4笨針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖36是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG7是否在12個泳道的多個人類正常組織中表達；圖37是一個示圖，示出了通過將圖36中的相同樣品與P-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖38(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG3是否在人類癌細胞系中表達，圖38 (b)是一 個示圖，示出了通過將圖38(a)中的相同樣品與(3-肌動蛋白探針 雜交所獲得的RNA印跡結果；圖39是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG8是否在人類癌細胞系中表達；圖40是一個示圖，示出了通過將圖39中的相同樣品與(3-月幾動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖41(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG10是否在人類癌細胞系中表達，圖41 (b)是一
個示圖，示出了通過將圖41 (a)中的相同樣品與P-肌動蛋白探針 雜交所獲得的RNA印跡結果；圖42(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG13是否在人類癌細胞系中表達，圖42 (b)是一 個示圖，示出了通過將圖42(a)中的相同樣品與P-肌動蛋白探針 雜交所獲得的RNA印跡結果；圖43(a)是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發 明的原癌基因MIG14是否在人類癌細胞系中表達，圖43 (b)是一 個示圖，示出了通過將圖43 (a)中的相同樣品與(3-肌動蛋白探針 雜交所獲得的RNA印跡結果；圖44是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG18是否在人類癌細胞系中表達；圖45是一個示圖，示出了通過將圖44中的相同樣品與P-月幾動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖46是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG19是否在人類癌細胞系中表達；圖47是一個示圖，示出了通過將圖46中的相同樣品與(3-月幾動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖48是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG5是否在人類癌細胞系中表達；圖49是一個示圖，示出了通過將圖48中的相同樣品與(3-月幾動 蛋白糹笨針雜交所獲得的RNA印跡結果；圖50是一個示圖，示出了RNA印跡的結果，以確定本發明的 原癌基因MIG7是否在人類癌細胞系中表達；圖51是一個示圖，示出了通過將圖50中的相同樣品與P-肌動 蛋白探針雜交所獲得的RNA印跡結果；以及圖52至60是示圖，示出了十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電 泳(SDS-PAGE )的結果，以確定將本發明的原癌基因MIG3， MIG8, MIG10, MIG18, MIG13, MIG14, MIG19, MIG5和MIG7分別轉化入 大腸桿菌中後，在L-阿拉伯糖誘導前後所表達蛋白的大小。
具體實施方式
下文將參照附圖對本發明的優選具體實施方式
詳細加以闡述。 1. MIG3本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因3 (MIG3)(下文中， 稱為MIG3原癌基因)，具有在SEQ ID NO: 1中列出的2，295bp全 長DNA序列。在SEQ ID NO: 1的DNA序列中，對應於核苷酸序列位置 89-709 (707-709:終止密石馬子)的可讀才匡是一個全長蛋白編石馬區， 而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 2中列出並包含 206個胺基酸(下文中，稱為"MIG3蛋白")。SEQ ID NO: 1的DNA序列已經以編碼號AY239293 4諸存於美 國國立衛生研究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其DNA序列與智人cDNA: FLJ23513 fis，克隆體LNG03869基因的序列類似，後者以編碼號 AK027166儲存於所述悽t據庫中。本發明的原癌基因表達的蛋白包
含206個胺基酸，胺基酸序列在SEQ ID NO: 2中列出，分子量約 23 kDa。2. MIG8本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因8 (MIG8)(下文中， 稱為原癌基因MIG8 )，具有在SEQ ID NO: 5中列出的3,737bp全長 DNA序列。在SEQ ID NO: 5的DNA序列中，對應於核苦酸序列位置 113-1627 ( 1625-1627:終止密碼子)的可讀框是一個全長蛋白編碼 區，而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 6中列出並 且包含665個胺基酸(下文中，稱為"MIG8蛋白")。SEQ ID NO: 5的DNA序列已經以編碼號AY311389儲存於美 國國立衛生研究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其胺基酸序列與智人凋亡抑 制因子5( API5 )基因的胺基酸序列一致，後者以編碼號NM_006595 和NM_021112儲存於所述資料庫中。但其一部分DNA序列不同於 所述智人凋亡抑制因子5 ( API5 )基因的DNA序列。本發明的原癌基因表達的蛋白包含504個胺基酸，並且胺基酸 序列在SEQIDNO:6中列出，分子量約57 kDa。3. MIG10本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因10 (MIG10)(下文中， 稱為原癌基因MIG10),具有在SEQIDNO:9中列出的1，321bp全 長DNA序列。
在SEQ ID NO: 9的DNA序列中，對應於核苷酸序列位置 23-1276 ( 1274-1276:鄉冬止密石馬子)的可讀才匡是一個全長蛋白編石馬 區，而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 10中列出並 且包含417個胺基酸(下文中，稱為"MIG10蛋白")。SEQ ID NO: 9的DNA序列已經以編石馬號AY423725儲存於美 國國立衛生研究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其DNA序列與智人磷酸甘 油酸激酶1基因以及智人石粦酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase ) 1 (PGK1)基因的DNA序列一致，後者分別以編碼號BC023234 和NM一000291 4諸存於所述悽t據庫中。本發明的原癌基因表達的蛋白包含417個胺基酸，而胺基酸序 列在SEQ IDNO:10中列出，分子量約45 kDa。4. MIG13本發明的原癌基因，人類遷移i秀導基因13 (MIG13)(下文中， 稱為原癌基因MIG13)，具有在SEQ ID NO: 13中列出的l，019bp 全長DNA序列。在SEQ ID NO: 13的DNA序列中，乂於應於核苷酸序列 f立置 11一844 ( 842-844:終止密碼子)的可讀衝匡是一個全長蛋白編碼區， 而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 14中列出並且包 含277個胺基酸(下文中，稱為"MIG13蛋白")。SEQ ID NO: 13的DNA序列已經以編》馬號AY3 3 6090儲存於美 國國立衛生研究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其部分DNA序列與Cot 25-標準4匕(Cot 25-normalized )智人(人類)B細月包(Ramos細月包系)
的全長cDNA克隆CS0DL001YE02基因的DNA序列類似，後者以 編碼號CR613087儲存於所述資料庫中。本發明的原癌基因表達的蛋白包含277個胺基酸，並且胺基酸 序列在SEQ ID NO: 14中列出，分子量約31 kDa。5. MIG14本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因14 (MIG14)(下文中， 稱為原癌基因MIG14)，具有在SEQ ID NO: 17中列出的l,142bp 全長DNA序列。在SEQ ID NO: 17的DNA序列中，只於應於核苦酸序列-位置 67-1125 ( 1123-1125:會冬止密石馬子)的可讀才匡是一個全長蛋白編碼; 區，而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 18中列出並 且包含206個胺基酸(下文中，稱為"MIG14蛋白")。SEQ ID NO: 17的DNA序列已經以編碼號AY336091儲存於美 國國立衛生研究院(NIH )的GenBank悽t據庫中(^>布日期2004 年12月31日)，並且DNA測序結果表明其DNA序列與智人RAE1 RNA輸出1同系物(S. pombe ) ( RAE1 ) 以及智人(人類)的Cot 25標準化的胎盤(Placenta Cot 25-normalized)全長cDNA克隆 CS0DI002YP18的基因的序列相同，分別以編碼號NM—003610和 CR626728儲存於所述資料庫中。本發明的該原癌基因表達的蛋白包含352個胺基酸，並且氨基 酸序列在SEQ ID NO: 18中列出，分子量約39kDa。 6. MIG18本發明的原癌基因，人類遷移i秀導基因18 (MIG18)(下文中， 稱為原癌基因MIG18)，具有在SEQ ID NO: 21中列出的3,633bp 全長DNA序列。在SEQ ID NO: 21的DNA序列中，對應於核苦酸序列位置 215-2212 (2210-2212:終止密碼子)的可讀框是一個全長蛋白編 碼區，而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 22中列出 並且包含665個胺基酸(下文中，稱為"MIG18蛋白")。DNA測序結果表明本發明的原癌基因MIG18與智人SH3結構 域激酶結合蛋白1 (SH3KBP1 ) (GenBank編碼號NM_031892 )具 有才目同的蛋白質序歹ll ( Take, H., et al.， Was1. Coww.268: 321-328, 2000 )，後者通過結合於c-Cbl基因而發揮作用以轉導 表皮生長因子相關信號(Langdon, W. Y" et al.，屍艦胸/. Jcac/. f/&4 86: 1168-1172, 1989)， l旦其部分DNA序列不同於智人SH3結 構域激酶結合蛋白1基因的DNA序列。本發明的該原癌基因表達的蛋白包含665個胺基酸，而胺基酸 序列在SEQIDNO:22中列出，分子量約73kDa。7. MIG 19本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因19 (MIG19)(下文中， 稱為原癌基因MIG19),具有在SEQ ID NO: 25中列出的4，639bp 全長DNA序列。在SEQ ID NO: 25的DNA序列中，對應於核苦酸序列位置 65-2965 (2963-2965:終止密碼子)的可讀框是一個全長蛋白編碼 區，而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQIDNO:26中列出並 且包含966個胺基酸(下文中，稱為"MIG19蛋白")。SEQ ID NO: 25的DNA序列已經以編碼號AY450308 4諸存於美 國國立衛生研究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其部分蛋白質序列與智人膜 組分，染色體17，表面標記物2 (卵巢癌抗原CA125) (M17S2)， 轉錄變異體3基因(以編碼號NM_031862儲存於所述^t據庫中) 的蛋白質序列一致，但其部分DNA序列不同於所述基因的DNA序 列。本發明的該原癌基因表達的蛋白包含966個胺基酸，而胺基酸 序列在SEQIDNO:26中列出，分子量約107 kDa。8. MIG5本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因5 (MIG5)(下文中， 稱為原癌基因MIG5),具有在SEQIDNO: 29中列出的833bp全長 DNA序列。在SEQ ID NO: 29的DNA序列中，對應於核香酸序列位置 159-737 (735-737:終止密碼子)的可讀框是一個全長蛋白編碼區， 而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 30中列出並且包 含192個胺基酸(下文中，稱為"MIG5蛋白")。SEQ ID NO: 29的DNA序列已經以編碼號AY279384儲存於美 國國立衛生石開究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其DNA序列與智人ras相 關C3肉毒桿菌毒素底物1 (rho家族，小GTP結合蛋白Racl) (RAC1),轉錄變異體Racl基因的DNA序列一致，其分別以編碼 號NM 006908儲存於所述悽史據庫中。 本發明的該原癌基因表達的蛋白包含192個胺基酸，而其胺基酸序列在SEQIDNO:30中列出，分子量約21 kDa。 9. MIG7本發明的原癌基因，人類遷移誘導基因7 (MIG7)(下文中， 稱為原癌基因MIG7 )，具有在SEQ ID NO: 33中列出的2,364bp的 全長DNA序列。在SEQ ID NO: 33的DNA序列中，對應於核苦酸序列位置 1435-1685 ( 1683-1685:終止密碼子)的可讀一匡是一個全長蛋白編 碼區，而來自該蛋白編碼區的胺基酸序列在SEQ ID NO: 34中列出 並且包含76個胺基酸(下文中，稱為"MIG7蛋白")。SEQ ID NO: 33的DNA序列已經以編碼號AY305872儲存於美 國國立衛生研究院(NIH)的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31日)，而DNA測序結果表明其部分DNA序列分別與染 色體14上的智人T細胞受體oc 5基因座(TCRA/TCRD，以編碼號 NG_001332儲存)、智人T細胞受體oc 5基因座(全核苦酸序列的 1—250529石成基)(1/5的吾P分)(以糹扁石馬號AE000658、 AE000521禾口 U85195儲存)以及智人(N6-腺苷)-甲基轉移酶基因(以編碼號 AF283991儲存於所述悽t據庫中)的DNA序列相同。本發明的該原癌基因表達的蛋白包含76個胺基酸，並且氨基 酸序列在SEQ ID NO:34中列出，分子量約9kDa。同時，由於密碼子的簡併性或者考慮到對於存活生物表達所述 原癌基因的密碼子的優選，本發明的原癌基因可以在編碼區進行多 種^f務飾而不改變該編碼區表達的致癌蛋白的胺基酸序列，以及在不 影響基因表達的範圍內對編碼區以外的區域進行多種修飾或改變。 這種修飾基因也包括在本發明的範疇內。因此，本發明還包括具有
的DNA序列與所述原癌基因以及所述原癌基因的片段基本相同的 多核苷酸。術語"基本相同的多核苦酸"指的是這樣的DNA，其 編碼相同的翻譯蛋白產物且與本發明的原癌基因具有至少80%，優 選至少90%,以及最優選至少95%的DNA序列同源性。而且，在不改變所述蛋白功能的範圍內，可以在所述蛋白的氨 基酸序列中置換、添加或缺失一個或多個胺基酸，並且4艮據應用可 僅使用部分蛋白。這種修飾的胺基酸序列也包括在本發明的範疇 內。因此，本發明還包括具有的胺基酸序列與所述致癌蛋白以及所 述蛋白的片段基本相同的多肽。術語"基本相同的多肽"指的是這 樣的多肽，其具有至少80%,優選至少90%，以及最優選至少95%的 序列同源性。本發明的原癌基因和蛋白可以分離自人類癌組織，或者按照已 知用於合成DNA或肽的方法而合成。而且，這樣製備的基因可插 入本領域中已知的用於在樣i生物中表達的載體中，以獲得表達載 體，然後該表達載體可以導入恰當的宿主細胞中，例如大腸桿菌、 酵母細胞等。在這種轉化的宿主中，可以大量複製本發明的基因 DNA或可以大量生產其蛋白。一旦構建了該表達載體，則才艮據生產該基因或蛋白的宿主細胞 種類，可以'除當；也選4%和組合表達調節序列例如啟動子和糹冬止子、 自主複製序列、分泌信號等。已證實本發明的基因為強致癌基因，能夠形成肺癌，因為諸如 RNA印跡的分析方法表明該基因在正常肺組織中幾乎不表達，而在 肺癌組織和肺癌細胞系中則過表達。而且已證明這些基因是癌症轉 移相關基因，能夠誘導癌症轉移，因為其在轉移性淋巴結癌組織中 表達增加。除了上皮組織例如肺癌，本發明的原癌基因也在其他癌 性腫瘤組織中高度表達，例如白血病、子宮癌、淋巴瘤、結腸癌、 皮膚癌等。因此，認為本發明的原癌基因是多種腫瘤生成中的共有癌基因，並且可以有效用於i貪斷多種癌症並生產轉化的動物。例如，利用所述原癌基因i貪斷癌症的方法包4舌這衝羊的步-驟，即 所述原癌基因的全部或部分作為證明(proves)與從受試者體液中 才是耳又的核酸雜交後，通過本領域中已知的多種方法衝企測所述原癌基 因來確定受試者是否具有本發明的原癌基因。利用放射性同位素、 酶等標記的4笨針可以4艮容易證實所述基因存在於組織樣品中。因 此，本發明提供含有全部或部分所述原癌基因的試劑盒，用於i貪斷 癌症。通過將本發明的原癌基因導入哺乳動物例如嚙齒類如大鼠體 內，可以獲得轉化的動物，而且優選在至少8細胞期之前的受精卵 期將所述原癌基因導入。這樣製備的轉化動物可以有效用於搜尋致 癌物質或抗癌物質如抗氧化劑。來自本發明的原癌基因的蛋白可有效用於產生作為i貪斷工具 的抗體。按照本領域中已知的常身見方法可以利用從本發明的原癌基 因或其片,殳表達的蛋白產生作為單克隆抗體或多克隆抗體的本發 明的抗體，因此，通過利用本領域中已知的方法，例如酶聯免疫吸 附試驗(ELISA)、放射性免疫測定(RIA)、夾層分析法、聚丙烯 醯胺凝膠上的蛋白質印跡或免疫印跡等，來確定所述蛋白是否在受 試者的體液樣品中表達，乂人而這種抗體可用來i貪斷癌症和癌症轉 移。而且，本發明的原癌基因可用來構建以失控方式持續生長的癌 細胞系，並且這種細胞系可以，例如，從利用轉染了所述原癌基因 的成纖維細胞在棵鼠背中形成的瘤組織而產生。這種癌細胞系可有 效用於搜尋抗癌劑等。
下文將參照優選實施例來詳細闡述本發明。然而，本文中提出的闡述僅是優選實施例，僅用於說明的目的， 而不限制本發明的範疇。實施例1:肺瘤細胞的培養以及總RNA的分離 l-l:MIG3、 MIGIO、 MIG13以及MIG14(第一步)腫瘤細胞的培養為了實施所述mRNA差異顯示法，取得正常肺組織、並從肺 癌患者得到原發性肺癌組織以及轉移至右肺的癌組織，其中上述患 者在外;f+手術之前未進4於過抗癌治療和/或方文射治療。在差異顯示法 中，A549 (美國才莫式i咅養物4史藏中心(American Type Culture Collection); ATCC號CCL-185 )用作人類肺癌細胞系。將從得到的組織獲得的細胞以及A549肺癌細胞系在 Waymouth's MB 752/1培養基(Gibco )中培養，該i咅養基含2 mM 穀氨醯胺，lOOIU/ml青黴素，100 |ug/ml《連黴素和10%胎牛血清(Gibco, U.S.)。本實驗中採用的培養細胞處於指數生長期，且本文 採用的細胞通過臺盼藍染料排阻實驗表現出至少95%的生存力(Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed.， A. R. Liss, New York, 1987 )。(第二步)RNA的分離和mRNA差異顯示法利用市售系糹克RNeasy總RNA i式劑盒(Qiagen Inc., Germany ), 從正常肺組織、原發性肺癌組織、轉移性肺癌組織以及A549細胞 (每一種均在第一步中得到)分離總RNA樣品，隨後利用messageclean i式劑盒(GenHunter Corp., Brookline, MA, U.S.) 一尋DNA汙染物乂人RN A才羊品中去除。l-2:MIG8、 MIG18、 MIG19、 MIG5以及MIG9(第一步)腫瘤細胞的培養為了實施所述mRNA差異顯示法，從患子宮肌瘤已行子宮切 除術的患者4尋到正常外子宮頸組織，以及,人在外考牛手術之前未進4亍 過抗癌治療和/或》文射治療的子宮癌患者得到原發性宮頸腫瘤組織 和轉移性淋巴結腫瘤組織。在差異顯示法中，CUMC-6 (Kim, J. W. Wa/.， Gj"eco/. (9"co/. 62: 230-240, 1996 )用作人類宮頸癌細胞系。將從得到的組織獲得的細胞以及CUMC-6細胞系在 Waymouth's MB 752/1培養基(Gibco )中培養，該培養基含2 mM 穀氨醯胺，100IU/ml青黴素，100 jug/ml 4連黴素和10%胎牛血清(Gibco, U.S.)。本實驗中採用的培養細胞處於指數生長期，且本文 中採用的細胞通過臺盼藍排阻實驗表現出至少95%的生存力(Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss， New York, 1987 )。(第二步)RNA的分離和mRNA差異顯示法利用市售系糹充RNeasy總RNA i式劑盒(Qiagen Inc., Germany )， /人正常外子宮頸糹且織、原發性宮頸腫瘤組織、轉移性'淋巴結肺瘤紐— 織以及CUMC-6細胞(每一種均在第一步中得到)分離總RNA樣 品，卩逭後矛J用message clean i式齊寸盒(GenHunter Corp., Brookline, MA, U.S.) 一誇DNA汙染物乂人RNA才羊品中去除。 實施例2:差異顯示逆專爭錄-聚合酶《連反應(DDRT-PCR) 2-1: MIG3利用稍作改良的逆4爭錄-聚合酶《連反應(RT-PCR，由Liang, P. 和A. B.Pardee 4是出)實施差異顯示逆庫爭錄。首先，利用具有SEQ ID NO:3給出的DNA序列的錨定引物 H-T11A( 5-AAGCTTTTTTTTTTTC-3',RNAimage試劑盒，Genhunter, Cor., MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1-1的第一步中得 到的總RNA每種各0.2 ju g實施逆轉錄。然後，在存在0.5 mM [ oc -35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的4苗定引物以及引物 H-AP22 (5'畫AAGCTTTTGATCC-3')實施PCR反應，而H-AP22具有隨才幾 5， 11-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 4給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進行共40個擴增循 環，包#舌95°C40移、的變性步-驟、4(TC2分4中的退火步-驟和72°C40 秒的延伸步驟，然後是72。C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在用於DNA測序的6°/。聚丙烯 醯胺測序凝膠中，然後利用放射自顯影來證實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切取具有L276-811 cDNA(鹼基位置從SEQ ID NO: 1的1862 -2166)的305個石鹹基對(bp)條帶。將切出的凝月交加熱 15分4中以洗脫該L276-811 cDNA,然後在上述相同條件下用相同的 引物重複PCR反應，以再次擴增L276-811 cDNA,只是在此裡未 <吏用[a -"S]標記的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20fiM dNTP。
2-2: MIG8利用稍作改良的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR，由Liang, P. 和A. B. Pardee提出)實施差異顯示逆轉錄。首先，利用具有SEQ ID NO: 7給出的DNA序列的錨定引物 H-T11C ( 5-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage 試劑盒， Genhunter， Cor" MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例l甲2的第 一步中得到的總RNA每種各0.2 jug實施逆轉錄。然後，在存在0.5 mM [ot_35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的4苗定引物以及引物 H-AP23 (5'-AAGCTTGGCTATG-3')實施PCR反應，其中H-AP23具有隨 才幾的5， ll-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 8給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進行共40個擴 增循環，包括95°C40秒的變性步驟、4CTC2分鐘的退火步驟和72 °C40秒的延伸步驟，然後是72°C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在6%聚丙烯醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用》支射自顯影來證實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切取帶有CC231 cDNA (SEQ ID NO: 5鹼基位置 3142-3483 )的342個鹼基對(bp)的條帶。將切出的凝膠加熱15 分鐘以洗脫該CC231cDNA,然後在上述相同條件下用相同的引物 重複PCR反應，以再次擴增CC231 cDNA,只是在這裡未使用[a -"S]標記的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 |u M dNTP。2-3: MIG10首先，利用具有SEQIDNO: 11給出的DNA序列的錨定引物 H-T11C ( 5-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'， RNAimage 試劑盒， Genhunter, Cor., MA， U.S.)作為4笛定寡-dT引物，對實施例1-1第一 步中得到的總RNA每種各0.2iug實施逆轉錄。然後，在存在0.5 mM [oc-35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的錨定引物以及引物 H-AP23 (5'-AAGCTTGGCTATG-3')實施PCR反應，其中H-AP23具有隨 機的5， - ll-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 12給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進4亍共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、40。C2分鐘的退火步驟和 72。C40秒的延伸步驟，然後是72。C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在6%聚丙烯醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用放射自顯影來證實差異表達的條帶位置。乂人幹凝月交中切耳又284個石成基對(bp )帶有L789 cDNA ( SEQ ID NO: 9的石鹹基位置1022 -1305 )的條帶。將切出的凝膠加熱15分鐘 以洗脫該L789cDNA，然後在上述相同條件下用相同的引物重複 PCR反應，以再次擴增L789 cDNA,只是在這裡未使用[oc -"S]標 "i己的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 n M dNTP。2-4: MIG13首先，利用具有SEQIDNO: 15給出的DNA序列的錨定引物 H畫T11C ( 5-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'， RNAimage 試劑盒， Genhunter， Cor.， MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1第一 步中得到的總RNA每種各0.2 jug實施逆轉錄。然後，在存在0.5 mM [ oc -35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的4苗定引物以及引物 H-AP21 (5'-AAGCTTTCTCTGG-3')實施PCR反應，其中H-AP21具有隨 才幾的5， - ll-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQID NO: 16給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進4亍共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、4(TC2分鐘的退火步驟和 72°C40秒的延伸步驟，然後是72°C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在6 %聚丙烯醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用放射自顯影來證實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切取295個石成基對(bp )帶有L986 cDNA ( SEQ ID NO: 13的鹼基位置685-979 )的條帶。將切出的凝膠加熱15分鐘以 洗脫該L986 cDNA,然後在上述相同條件下用相同的引物重複PCR 反應，以再次擴增L986 cDNA，只是在這裡未使用[ot -"S]標記的 dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 |u M dNTP。2-5: MIG14首先，利用具有SEQIDNO: 19給出的DNA序列的錨定引物 H-T11A ( 5畫AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage 試劑盒， Genhunter, Cor., MA， U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1第一 步中4尋到的總RNA每種各0.2 jug實施逆專爭錄。然後，在存在0.5 mM [ oc -35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的4苗定引物以及引物 H-AP21 (5'-AAGCTTTCTCTGG-3')實施PCR反應，其中H-AP21具有P逭 機的5， - 11-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 20糹合出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進4亍共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、4(TC2分鐘的退火步驟和 72。C40秒的延伸步驟，然後是72"C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在6 %聚丙烯醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用放射自顯影來證實差異表達的條帶位置。
乂人幹凝—月交中切耳又276個石鹹基對(bp )帶有L1284 cDNA( SEQ ID NO: 17的鹼基位置823-1098)的條帶。將切出的凝膠加熱15分鐘 以洗脫該L1284 cDNA,然後在上述相同條件下用相同的引物重複 PCR反應，以再次擴增L1284cDNA,只是在這裡未使用[oc-358]標 i己的dATP ( 1200 Ci/mmole )禾口 20 ju M dNTP。2-6: MIG18首先，利用具有SEQ ID NO: 23給出的DNA序列的錨定引物 H畫T11A ( 5-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage 試齊'J盒， Genhunter， Cor.， MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1第一 步中得到的總RNA每種各0.2 jug實施逆轉錄。然後，在存在0.5 mM [ oc -35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的錨定引物以及引物 H-AP36 (5'-AAGCTTCGACGCT-3')實施PCR反應，其中H-AP36具有隨 才幾的5， - 11-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 24給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進4亍共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、40°C2分鐘的退火步驟和 72°C40秒的延伸步驟，然後是72°C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片,殳溶解在6 %聚丙烯醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用放射自顯影來證實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切取221個石成基對(bp )帶有CA367 cDNA ( SEQ ID NO: 21的石成基位置2920-3140)的條帶。將切出的凝膠加熱15 分鐘以洗脫該CA367 cDNA,然後在上述相同條件下用相同的引物 重複PCR反應，以再次擴增CA367 cDNA，只是在這裡未使用[a -358]標記的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 M M dNTP。 2-7: MIG19首先，利用具有SEQ ID NO: 27給出的DNA序列的錨定引物 H-T11A ( 5-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage 試劑盒， Genhunter, Cor.， MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1第一 步中得到的總RNA每種各0.2 mg實施逆轉錄。然後，在存在0.5 mM [ a -35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的4苗定引物以及引物 H-AP33 (5'-AAGCTTGCTGCTC-3')實施PCR反應，其中H-AP33具有隨 才幾的5， _ 11-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 28給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進4亍共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、40。C2分鐘的退火步驟和 72°C40秒的延伸步驟，然後是72°C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在6 %聚丙歸醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用放射自顯影來證實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切取381個石鹹基對(bp )帶有CA335 cDNA ( SEQ ID NO: 25的石成基4立置4123-4503 )的條帶。 一誇4刀出的凌是月交力口次A 15 分鐘以洗脫該CA335 cDNA，然後在上述相同條件下用相同的引物 重複PCR反應，以再次擴增CA335 cDNA,只是在這裡未使用[cc -35S]標記的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 ju M dNTP。2-8: MIG5利用稍作改良的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR，由Liang,P.和 A. B. Pardee才是出)實施差異顯示逆專爭錄。首先，利用具有SEQ ID NO: 31給出的DNA序列的錨定引物 H-T11G( 5-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage 試劑盒，
Genhunter, Cor" MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1第一 步中4尋到的總RNA每種各0.2 實施逆4爭錄。然後，在存在0.5 mM [ a -35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的錨定引物以及引物 H-AP26 (5'畫AAGCTTGCCATGG-3')實施PCR反應，其中H-AP26具有隨 才幾的5， - 11-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 32給出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進行共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、40。C2分鐘的退火步驟和 72°C40秒的延伸步驟，然後是72°C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片賴:溶解在6 %聚丙烯醯胺測序凝月交中， 用於DNA測序，然後利用力丈射自顯影來i正實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切耳又263個鹼基對(bp )帶有CG263 cDNA ( SEQ ID NO: 29的石威基位置476-738 )的條帶。將切出的凝月交加熱15分 4中以洗H該CG263 cDNA,然後在上述相同條4牛下用相同的引物重 復PCR反應，以再次擴增CG263 cDNA，只是在這裡未4吏用[cc -35S] 才示i己的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 n M dNTP。2-9: MIG7利用改良的逆轉錄-聚合酶《連反應(RT-PCR,由Liang, P.和 A.B.Pardee提出)實施差異顯示逆轉錄。首先，利用具有SEQ ID NO: 35給出的DNA序列的錨定引物 H-T11G ( 5-AAGCTTTTTTTTTTTG匿3'， 脂Aimage 試齊'J盒， Genhunter, Cor., MA, U.S.)作為錨定寡-dT引物，對實施例1第一 步中得到的總RNA每種各0.2 jug實施逆轉錄。
然後，在存在0.5 mM [a-35S] dATP ( 1200 Ci/mmole )的情況 下，利用相同的錨定引物以及引物 H-AP23 (5'-AAGCTTGGCTATG-3')實施PCR反應，其中H-AP23具有隨 才幾的5， - ll-mer引物(RNAimage引物組1-5 )H-AP 1至40中SEQ ID NO: 36糹會出的DNA序列。PCR反應在以下條件下進4亍共40 個擴增循環，包括95。C40秒的變性步驟、40。C2分鐘的退火步驟和 72°C40秒的延伸步驟，然後是72°C5分鐘的一個最後延伸步驟。將PCR反應中擴增的片段溶解在6 %聚丙烯醯胺測序凝膠中， 用於DNA測序，然後利用放射自顯影來i正實差異表達的條帶位置。從幹凝膠中切取327個鹼基對(bp )帶有CG233 cDNA ( SEQ ID NO: 33的石威基位置1903-2229)的條帶。將切出的凝膠加熱15 分4中以洗脫該CG233 cDNA,然後在上述相同條4牛下用相同的引物 重複PCR反應，以再次擴增CG233 cDNA,只是在這裡未使用[oc ,S]標記的dATP ( 1200 Ci/mmole )和20 ju M dNTP。實施例3:克隆利用TA克隆系統(Promega, U.S.)，接照生產商手冊將上述均 已經過再次擴增的L276-811 PCR產物、CC231 PCR產物、L789 PCR 產物、L986PCR產物、L1284PCR產物、CA367PCR產物、CA335 PCR產物、CG263 PCR產物以及CG233 PCR產物分別插入 pGEM-T EASY載體中。(第一步)連接反應^!尋實施例2中均已經過再次擴增的L276-811 PCR產物、CC231 PCR產物、L789 PCR產物、L986 PCR產物、L1284 PCR產物、 CA367PCR產物、CA335 PCR產物、CG263 PCR產物以及CG233 PCR產物每種各2 y 1 ， pGEM-T EASY載體1 ul ( 50 ng ), T4
DNA連4妄酶 (10X糹爰衝液)1 u 1以及T4 DNA連4妄酶(3 weiss 單4立/u 1; Promega) 1 u 1加入0.5 ml試管中，並加入蒸4留水至終 體積10 ul。將該連接反應混合物14。C醉育過夜。(第二步)TA克隆的轉化將五.cW JM109 ( P薩ega， WI, U.S.)在10 mlLB液體培養基 (10g細菌用胰蛋白腖，5g細菌用酵母提取物，5gNaCl)中孵育， 直至600nm處的光密度達到約0.3-0.6。將該孵育的混合物置於冰中 約10分鐘，於4 。C 4,000 rpm離心10分鐘，然後棄上清並收集細 胞。將收集的細月包沉澱物置於10 ml 0.1 M水冷的CaCl2中約30分 鍾至1小時，以生成感受態細月包。將產物再次於4。C 4,000 rpm離 心10分鐘，然後棄上清、收集細胞並懸浮於2ml 0.1 M冰冷的CaCI2 中。將該感受態細胞懸浮液200 w 1轉移至新的樣i量離心管 (microfuge)中，並向管中加入第一步中製備的連接反應產物2u 1。 將4尋到的混合物在42匸水浴中孵育90秒，然後(TC-驟冷。向管中 加入800u 1 SOCi咅養基(2.0 g細菌用月夷蛋白腖，0.5 g細菌用酵母 提取物，1 ml 1 M NaCl， 0.25 ml 1 M KC1， 97 ml TDW, 1 ml 2 M Mg2+, lml2M葡萄糖)，然後將得到的混合物在旋轉式振蕩培養箱(220 rpm)中37。C孵育45分4中。用玻璃棒將25 u lX-gal (儲存於40mg/ml 二甲基曱醯胺中) 塗布於LB盤(補充了氨千青黴素且已提前放入37。C培養箱中)上， 力口入25u 1轉化的糹田月包，再次用玻璃棒塗布，然後37。C孵育過夜。 孵育後，選擇3-4個形成的白色菌落，並將每一種選擇的細胞均接 種培養於補充了氨千青黴素的LB盤上。為了構建質粒，選擇認為 已經分別導入連4妄反應產物的菌落，並在10 ml高營養(terrific) 液體培養基(900 ml TDW, 12 g細菌用胰蛋白腖，24 g細菌用酵母提
耳又物，4 ml甘油，0.17 M KH2P04, 100 ml 0.72 N K2HP04 )中培養，所 述連接反應產物即轉化的大腸桿菌才朱JM109/L276-811 、 JM109/CC231 、 JM109/L789 、 JM109/L986 、 JM109/L1284 、 JM109/CA3 67 、 JM109/CA3 35、 JM109/CG263和JM109/CG23 3 。實施例4:重組質粒DNA的分離利用WizardTM Plus Minipreps DNA純4bi式劑盒 (Promega， U.S.), 4要照生產商手冊將L276-811質粒DNA、 CC231質粒DNA、 L789質粒DNA、 L986質粒DNA、 L1284質粒DNA、 CA367質粒 DNA、 CA335質粒DNA、 CG263質粒DNA和CG233質粒DNA 中的每一種從所述轉化的大腸桿菌抹中分離出來。證實用限制性內切酶ECoRI處理部分每種分離的質粒DNA, 通過在2%;疑月交中電泳，L276-8U、 CC231、 L789、 L986、 L1284、 CA367、 CA335、 CG263和CG233的部分序列分別插入該質粒中。實施例5: DNA測序分析 5-1: MIG34誇實施例2中4f到的L276-811 PCR產物:接照常失見方法擴增、 克隆並再次擴增。利用S叫uenase 2.0版DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH, U.S.), 一尋4尋到的L276-811 PCR片段按照雙脫氧鏈終止法進行測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 1的核苦酸序列位置 1862-2166,其在本發明中命名為"L276-811"。
利用5'隨機引物H-AP22和3'錨定引物H-T11A，對上述得到的 305bp cDNA片4殳例如L276-811進4亍差異顯示逆轉錄-聚合酶鏈反 應(DDRT-PCR)，隨後利用電泳來i正實。如圖1所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常肺組織、左 側肺癌組織、從左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌 細月包中差異表達。如圖1可以看出，該305bp的cDNA片I殳L276-811 在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及A549肺癌細月包中表達，^旦在正 常肺組織中不表達。該L276-811在癌組織特別是轉移性癌組織中 表達最高。5-2: MIG8將實施例2中得到的CC231 PCR產物4姿照常失見方法擴增、克 隆並再次擴增。利用Sequenase2.0片反DNA測序^式劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH， U.S.)，將得到的CC231 PCR片段按照乂又脫氧4連終止法進4於測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 5的核苷酸序列位置 3142-3483,其在本發明中命名為"CC231"。利用5'隨機引物H-AP23和3'錨定引物H-T11C，對上述得到的 342bp cDNA片段例如CC231進行差異顯示逆轉錄-聚合酶鏈反應 (DDRT-PCR )，隨後利用電泳來證實。如圖2所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外子宮頸組 織、轉移性淋巴結組織以及CUMC-6細胞中差異表達。如圖2可以 看出，該342bp的cDNA片段CC231在宮頸癌、專爭移性'淋巴結組 織以及CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組織中不表達。5-3: MIGIO將實施例2中得到的L789 PCR產物按照常規方法擴增、克隆 並再次擴增。利用Sequenase2.0片反DNA測序^式劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH, U.S.)，將得到的L789 PCR片段按照雙 脫氧4連終止法進行測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 9的核苷S臾序列位置 1022 -1305，其在本發明中命名為"L789"。利用5'隨機引物H-AP23和3'錨定引物H-T11C，對上述得到的 284bp cDNA片段例如L789進行差異顯示逆轉錄-聚合酶鏈反應 (DDRT-PCR ),隨後利用電泳來i正實。如圖3所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常月申組織、左 側肺癌組織、從左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌 細月包中差異表達。如圖3可以看出，該255bp的cDNA片革殳L276 在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及A549肺癌細胞中表達，j旦在正 常肺組織中不表達。該L276基因在癌組織特別是轉移性癌組織中 表達最高。5-4:MIG13將實施例2中得到的L986 PCR產物4安照常失見方法擴增、克隆 並再次擴增。利用Sequenase2.0片反DNA測序^式劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH, U.S.)，對得到的L986 PCR片段按照雙 脫氧鏈終止法進行測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 13的核苷酸序列位 置685-979,其在本發明中命名為"L986"。利用5'隨機引物H-AP21和3'錨定引物H國T11C，對上述得到的 295bp cDNA片段例如L986進行差異顯示逆轉錄-聚合酶《連反應 (DDRT-PCR )，隨後利用電泳來證實。如圖4所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常肺組織、左 側肺癌組織、^人左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌 細胞中差異表達。如圖4可以看出，該255bp的cDNA片,殳L986 在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及A549肺癌細胞中表達，^旦在正 常肺組織中不表達。該L276-811基因在癌組織特別是轉移性癌組 織中表達最高。5畫5:MIG14將實施例2中得到的L1284PCR產物:接照常^L方法擴增、克隆 並再次擴增。利用S叫uenase2.0片反DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH, U.S.)，對得到的L1284 PCR片段按照雙脫氧4連終止法進4於測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 17的核苷酸序列位 置823-1098,其在本發明中命名為"L1284"。利用5'隨^L引物H-AP21和3'錨定引物H-T11A，對上述得到的 276bp cDNA片段例如L1284進行差異顯示逆轉錄-聚合酶鏈反應 (DDRT-PCR)，隨後利用電'泳來i正實。如圖5所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常肺組織、左 側肺癌組織、從左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549肺癌 細胞中差異表達。如圖5可以看出，該276bp的cDNA片段L1284 在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及A549肺癌細月包中表達， <旦在正 常肺組織中不表達。該L1284基因在癌組織特別是轉移性癌組織中 表達最高。
5-6:MIG18將實施例2中得到的CA367 PCR產物4安照常失見方法擴增、克 隆並再次擴增。利用Sequenase2.0版DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH， U.S.)，對得到的CA367 PCR片段按照雙脫氧4連終止法進ff測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 21的核香酸序列位 置2920-3140，其在本發明中命名為"CA367"。利用5'隨機引物H-AP36和3'錨定引物H-T11A,對上述得到的 221bp cDNA片,殳例如CA367進4亍差異顯示逆轉錄-聚合酶《連反應 (DDRT-PCR),隨後利用電;永來i正實。如圖6所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外子宮頸組 織、轉移性淋巴結組織以及CUMC-6細胞中差異表達。如圖6可以 看出，該221bp的cDNA片段CA367在宮頸癌糹且織、哞爭移性'淋巴 結組織以及CUMC-6癌細胞中表達，4旦在正常組織中不表達。5-7: MIG19將實施例2中得到的CA335 PCR產物4妄照常關見方法擴增、克 隆並再次擴增。利用S叫uenase2.0版DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH， U.S.)，對得到的CA335 PCR片l史4姿照 雙脫氧《連終止法進4於測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 25的核苦酸序列位 置4123-4503，其在本發明中命名為"CA335"。 頁利用5'隨機引物H-AP33和3'錨定引物H-T11A，對上述得到的 381bp cDNA片段例如CA335進行差異顯示逆轉錄-聚合酶鏈反應 (DDRT-PCR)，隨後利用電;水來i正實。如圖7所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外子宮頸組 織、轉移性淋巴結組織以及CUMC-6細胞中差異表達。如圖7可以 看出，該381bp的cDNA片段CA335在宮頸癌組織、轉移性淋巴 結糹且織以及CUMC-6癌細月包中表達，^旦在正常ia織中不表達。5-8:MIG5將實施例2中得到的CG263 PCR產物按照常夫見方法擴增、克 隆並再次擴增。利用Sequenase2.0版DNA測序^式劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH， U.S.),對得到的CG263 PCR片段按照雙脫氧《連終止法進4於測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 29的核苷酸序列位 置476 -738，其在本發明中命名為"CG263"。利用5'隨機引物H-AP26和3'錨定引物H-T11G，對上述得到的 263bp cDNA片^殳例如CG263進4亍差異顯示逆轉錄-聚合酶4連反應 (DDRT-PCR ),隨後利用電泳來證實。如圖8所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外子宮頸組 織、轉移性淋巴結組織以及CUMC-6細胞中差異表達。如圖8可以 看出，該263bp的cDNA片段CG263在宮頸癌組織、轉移性淋巴 結組織以及CUMC-6癌細胞中表達，^f旦在正常組織中不表達。 5- 9: MIG7將實施例2中得到的CG233 PCR產物按照常失見方法擴增、克 隆並再次擴增。利用S叫uenase2.0版DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH, U.S.),對得到的CG233 PCR片l殳4安照 雙脫氧《連終止法進4於測序。所述基因的DNA序列對應於SEQ ID NO: 33的核苷酸序列4立 置1903-2229，其在本發明中命名為"CG233"。利用5'隨機引物H-AP23和3'錨定引物H-T11G,對上述得到的 327bp cDNA片段例如CG233進行差異顯示逆轉錄-聚合酶鏈反應 (DDRT-PCR ),隨後利用電泳來證實。如圖9所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外子宮頸組 織、轉移性淋巴結組織以及CUMC-6細胞中差異表達。如圖9可以 看出，該327bp的cDNA片段CG233在宮頸癌ia織、專爭移性'淋巴 結組織以及CUMC-6癌細月包中表達，-f旦在正常組織中不表達。實施例6:全長原癌基因的cDNA序列分析6- 1: MIG3"P標記的L276-811用作探針來篩查噬菌體入gtll人胚肺成纖 糹,糹田月包(lung embryonic fibroblast) cDNA文庫(Miki， T. W a/., 83: 137-146， 1989)。 乂人所述人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長 MIG3 cDNA克隆，其中2295bp片段插入pCEV-LAC載體中，然後 於2003年2月19日以編碼號AY239293儲存於U.S.NIH的GenBank 悽史才居庫中(/>布日期2004年12月31日)。
通過限制性內切酶7Vort剪切插入人pCEV載體中的MIG3克隆， 並將其從抗氛千青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體中 分離出來(Miki, T. e, a/" G匿83: 137-146, 1989 )。通過T4 DNA連4妻酶連4妻含MIG3基因的pCEV-LAC載體，以 獲得MIG3質粒DNA，然後用連4妻的克隆轉化大腸桿菌DH5 cc 。在SEQ ID NO: 1的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的全 長可讀框對應於核苦酸序列位置89-709，並且編碼由SEQ ID NO: 2 的206個胺基酸組成的蛋白。6-2: MIG832P-標記的CC231用作探針來篩查噬菌體人gtll人胚肺成纖維 糹田月包cDNA文庫(Miki, T. "/., 83: 137-146, 1989 )。 乂人戶斤述人 胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長MIG8 cDNA克隆，其中 3737bp片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年6月1日以編 碼號AY311389儲存於U.S. NIH的GenBank資料庫中(公布日期 2004年12月31日)。通過限制性內切酶7Vort剪切插入人pCEV載體中的MIG8克隆， 並將其從抗氨千青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體中 分離出來(Miki, T. da/.，83: 137-146, 1989)。通過T4 DNA連接酶連接含MIG8基因的pCEV-LAC載體，以 獲得MIG8質粒DNA,然後用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a 。MIG18( 8 )的全長DNA序列由3737 bp組成，並在SEQ ID NO:5中列出。
在SEQ ID NO: 5的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的全 長可讀才匡對應於核苦酸序列位置113-1627,並且編石馬由SEQ ID NO: 6的504個胺基酸組成的蛋白。6-3: MIG 1032P-標記的L789用作糹罙針來篩查噬菌體入gtl 1人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫(Miki, T. W a/" 83: 137-146, 1989 )。 乂人所述人胚 肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長MIG 10 cDNA克隆，其中1321 bp 片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年9月26日以編碼號 AY423725儲存於U.S. NIH的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31曰)。通過限制性內切酶iVo I剪切插入入pCEV載體中的MIG10克 隆，並將其從抗氨苄青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體 中分離出來(Miki， T. e "/" Ge"e 83: 137-146, 1989)。通過T4 DNA連接酶連接含MIG10基因的pCEV-LAC載體， 以獲得MIG10質粒DNA,然後用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a 。在SEQ ID NO: 9的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的全 長可讀框對應於核苷酸序列位置23 -1276,並且編碼由SEQ ID NO: 10的417個胺基酸組成的蛋白。6-4: MIG 133￥-標記的L986用作探針來篩查噬菌體人gtll人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫(Miki, T. " a/., G", 83: 137-146, 1989 )。從所述人胚 肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長MIG13 cDNA克隆，其中1019bp 片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年7月7日以編碼號AY336090儲存於U.S. NIH的GenBank資料庫中(公布日期2004 年12月31曰)。通過限制性內切酶7Vo/1剪切插入人pCEV載體中的MIG13克 隆，並將其,人抗氨苄青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體 中分離出來(Miki, T. 83: 137-146， 1989 )。通過T4 DNA連接酶連接含MIG13基因的pCEV-LAC載體， 以獲得MIG13質粒DNA，然後用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a 。在SEQ ID NO: 13的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的 全長可讀框對應於核苷酸序列位置11-844，並且編碼由SEQ ID NO: 14的277個胺基酸組成的蛋白。6-5: MIG14"P-標記的L1284用作探針來篩查噬菌體人gtll人胚肺成纖維 糹田月包cDNA文庫(Miki， T. Gewe 83: 137—146, 1989 )。 乂人戶斤述人胚月巿成纖維細月包cDNA文庫獲4尋全長MIG14 cDNA克隆，其中 1142bp片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年7月4日以編 碼號AY336091儲存於U.S. NIH的GenBank悽t據庫中(^>布日期 2004年12月31曰)。通過限制性內切酶7VWI剪切插入ApCEV載體中的MIG14克 隆，並將其,人抗氨苄青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體 中分離出來(Miki, T. w"/"83: 137-146, 1989 )。通過T4 DNA連接酶連接含MIG14基因的pCEV-LAC載體， 以獲得MIG14質粒DNA，然後用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a 。
在SEQ ID NO: 17的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的 全長可讀衝匡只於應於^亥苷酸序列^f立置67-1125，並且編石馬由SEQ ID NO: 18的352個胺基酸組成的蛋白。6-6: MIG18"P-標記的CA367用作^笨針來篩查噬菌體人gtll人胚月市成纖維 細胞cDNA文庫(Miki， T. " 83: 137-146, 1989 )。 乂人所述人胚肺成纖維細月包cDNA文庫獲得全長MIG18 cDNA克隆，其中 3633bp片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年9月30日以 編碼號AY423734 4渚存於U.S. NIH的GenBank悽t據庫中(公布日 期2004年12月31曰)。通過限制性內切酶M rt剪切插入入pCEV載體中的MIG18克 隆，並將其從抗氨苄青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體 中分離出來(Miki, T. 83: 137-146, 1989 )。通過T4 DNA連接酶連接含MIG18基因的pCEV-LAC載體， 以獲得MIG18質粒DNA，然後用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 oc 。MIG18的全長DNA序列由3633bp組成，並在SEQ ID NO: 21中列出。在SEQ ID NO: 21的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的 全長可讀框對應於核苷酸序列位置215-2212，並且編碼由SEQ ID NO: 22的665個胺基酸組成的蛋白。6-7: MIG19"P-標記的CA335用作探針來篩查噬菌體A gtll人胚肺成纖維 糹田胞cDNA文庫(Miki, T."/., G匿83: 137-146， 1989 )。從所述人
胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長MIG19 cDNA克隆，其中 4639bp片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年10月26日以 編碼號AY450308儲存於U.S. NIH的GenBank資料庫中(公布日 期2004年12月31曰)。
通過限制性內切酶7Vo I剪切插入ApCEV載體中的MIG19克 隆，並將其從抗氨苄青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體 中分離出來(Miki， T. G騰83: 137-146， 1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含MIG19基因的pCEV-LAC載體， 以獲得MIG19質粒DNA,然後用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 oc 。
MIG19的全長DNA序列由4639bp組成，並在SEQ ID NO: 25中列出。
在SEQ ID NO: 25的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的 全長可讀框對應於核苷酸序列位置65-2965,並且編碼由SEQ ID NO: 26的966個胺基酸組成的蛋白。
6-8: MIG532P-標記的CG263用作:探針來篩查噬菌體入gtll人胚肺成纖維 糹田月包cDNA文庫(Miki, T. a/.， 83: 137-146, 1989 )。 乂人戶斤述人 胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長MIG5 cDNA克隆，其中833bp 片段插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年4月19日以編碼號 AY279384儲存於U.S. NIH的GenBank ^t據庫中(？>布日期2004 年12月31曰)。
通過限制性內切酶剪切插入入pCEV載體中的MIG5克隆， 並將其從抗氨千青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體中 分離出來(Miki, T. w a/.，83: 137-146, 1989 )。通過T4 DNA連接酶連接含MIG5基因的pCEV-LAC載體，以 獲得MIG5質粒DNA，然後用連4妾的克隆轉化大腸桿菌DH5 a 。MIG5的全長DNA序列由833bp組成，並在SEQ ID NO: 29中列出。在SEQ ID NO: 29的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的 全長可讀一匡對應於一亥苷S吏序列4立置159-737，並且編碼由SEQ ID NO: 30的192個胺基酸組成的蛋白。6-9: MIG7"P-標記的CG233用作探針來篩查噬菌體人gtll人胚肺成纖維 細月包cDNA文庫(Miki, T. " "/., G置83: 137-146， 1989 )。從所述人 胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得全長MIG7 cDNA克隆，其中 2364bp片,殳插入pCEV-LAC載體中，然後於2003年5月24日以 編碼號AY305872儲存於U.S. NIH的GenBank資料庫中(公布日 期2004年12月31日)。通過限制性內切酶剪切插入入pCEV載體中的MIG7克隆， 並將其從抗氨千青黴素的pCEV-LAC噬菌粒載體形式的噬菌體中 分離出來(Miki, T. " a/.，83: 137-146， 1989 )。通過T4 DNA連接酶連接含MIG7基因的pCEV-LAC載體，以 獲得MIG7質粒DNA,然後用連4妄的克隆轉化大腸桿菌DH5 a 。MIG7的全長DNA序列由2364bp組成，並在SEQ ID NO: 33中列出。
在SEQ ID NO: 33的DNA序列中，估計本發明的原癌基因的 全長可讀框對應於核苷酸序列位置1435-1665，並且編碼由SEQID NO: 4(34)的76個胺基酸組成的蛋白。實施例7:多種細胞中的基因的RNA印跡分才斤7-1: MIG3, MIG10, MIG13以及MIG14以與實施例1中相同的方式,人正常肺組織、左側肺癌組織、,人 左肺轉移至右肺的轉移性肺癌組織以及A549和NCI-H358(美國模 式培養物收藏中心；ATCC No. CRL-5807 )肺癌細胞系中揭_耳又總 RNA樣品。為了確定MIG3、 MIGIO、 MIG13和MIG14基因中每一種的表 達水平，將從所述組織和細胞系每一種4是耳又的變性總RNA樣品每 種各20jug在1%曱醛瓊脂糖凝膠中電泳，然後將得到的瓊脂糖凝 月交壽爭^多至尼龍月莫(Boehringer-Mannheim, Germany)上。 一尋印跡與 "P標記的並隨機預處理的全長MIG cDNA探針雜交，其中探針是 利用 Rediprime II卩逭才幾prime才示i己系糹克((Amersham, United Kingdom )所製備。該RNA印跡分析重複兩次，因此用密度計對得 到的印跡加以定量並用(3-肌動蛋白進行標準化。圖10(a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG3原癌基因是否 在正常肺組織、肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細胞系(A549 和NCI-H358 )中表達。如圖10 (a)中所示，表明MIG3原癌基因 的表達水平在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及A549和NCI-H358 肺癌細胞系中顯著增加，但在正常肺組織中很低或未才僉測到。圖10(a)中，泳道"正常，，表示正常肺組織，泳道"癌"表示肺癌組 織，泳道"轉移，，表示轉移性肺癌組織，以及泳道"A549"和"NCI-H358"每一種均表示肺癌細胞系。圖10 (b)示出了 RNA 印跡結果，通過將相同樣品與P -肌動蛋白一笨針雜交而表明存在mRNA轉錄物。圖24 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG3原癌基因是否 在12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、心 髒、4黃糹文月幾、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以 及外周血白細胞組織。圖24 (b)示出了 RNA印跡結果，通過將相 同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖24 (a )中所示，MIG3 mRNA轉錄物(大約4.0kb )在正常組織中孩吏 弱表達。圖38 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG3原癌基因是否 在人類癌細月包系中表達，例如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549 ,口 G361 ( Clontech )。圖38 (b)示出了脂A印跡 結果，通過將相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA 轉錄物。如38 (a)中所示，表明MIG3原癌基因在前髓細胞白血 病細胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓細月包源性白血病細胞 系K-562、成淋巴細胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細月包 系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549以及皮膚癌細胞 系G361中表達才及高。圖13 (a)示出了RNA印跡結果，以確定MIG10原癌基因是 否在正常肺組織、肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細胞系(A549 和NCI-H358 )中表達。如圖13 (a)中所示，表明MIG10原癌基 因的表達水平在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細胞系(A549 和NCI-H358 )中顯著增力口，但在正常肺組織中4艮j氐或未4企測到。 圖13 (a)中，泳道"正常，，表示正常肺組織，泳道"癌"表示肺 癌組織，泳道"轉移"表示轉移性肺癌組織，以及泳道"A549"和 "NCI-H358"每一種均表示肺癌細胞系。圖13 (b)示出了 RNA
印跡結果，通過將相同樣品與P -肌動蛋白探針雜交而表明存在m腦A轉錄物。圖27 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG10原癌基因是 否在12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、 心臟、衝黃紋月幾、大腸、胸H月年髒、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺 以及外周血白細胞組織。圖27 (b)示出了 RNA印跡結果，通過將 相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖 27(a)中所示，MIG10mRNA專爭錄物(大約2.0 kb )在正常糹且織 中極^f敬弱表達。圖41 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG10原癌基因是 否在人類癌細月包系中表達，例如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549禾口 G361 ( Clontech )。圖41 (b)示出了 RNA 印跡結果，通過將相同樣品與(3-肌動蛋白l笨針雜交而表明存在 mRNA轉錄物。如41 (a)中所示，表明MIG10原癌基因在前髓細 胞白血病細胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓細胞源性白血 病細月包系K-562、成'淋巴細l包白血病細月包系MOLT-4、伯基特'淋巴 瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549以及皮膚 癌細胞系G361中表達極高。還可以觀察到除了 2.0kb的mRNA轉 錄物以外，還表達約2.4kb的mRNA轉錄物。圖14 ( a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG13原癌基因是 否在正常肺組織、肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細"包系(A549 和NCI-H358 )中表達。如圖14 (a)中所示，表明MIG13原癌基 因的表達水平在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細胞系(A549 和NCI-H358 )中顯著增加，但在正常肺組織中很低或未檢測到。 圖14 (a)中，泳道"正常，，表示正常肺組織，泳道"癌"表示肺 癌組織，泳道"轉移，，表示轉移性肺癌組織，以及泳道"A549"和 "NCI-H358"每一種均表示肺癌細胞系。圖14 (b)示出了固A
印跡結果，通過將相同樣品與|3 -肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。圖28 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG13原癌基因是 否在12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、 心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺 以及外周血白細胞組織。圖28 (b)示出了 RNA印跡結果，通過將 相同樣品與P-月幾動蛋白4笨針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖 28 ( a)中所示，MIG13 mRNA轉錄物(大約1.7kb的優勢轉錄物 以及1.4kb的轉錄物)在正常組織中表達極孩t弱或未檢測到。圖42 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG13原癌基因是 否在人類癌細胞系中表達，例如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549禾口 G361 ( Clontech )。圖42 (b)示出了 RNA 印跡結果，通過將相同樣品與P -肌動蛋白探針雜交而表明存在 mRNA轉錄物。如圖42 U)中所示，表明MIG13 m認A轉錄物 (大約1.7kb的優勢轉錄物以及1.4kb的轉錄物)在前髓細胞白血 病細月包系HL-60、 HeLa子宮癌細月包系、j曼性骨逸細月包源性白血病細月包 系K-562、成'淋巴細月包白血病細胞系MOLT-4、伯基特'淋巴瘤細胞 系Raji、結腸癌細月包系SW480、肺癌細月包系A549以及皮膚癌細月包 系G361中表達才及高。圖15 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG14原癌基因是 否在正常肺組織、肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細月包系(A549 和NCI-H358 )中表達。如圖15 (a)所示，表明MIG14原癌基因 的表達水平在肺癌組織、轉移性肺癌組織以及肺癌細胞系(A549 和NCI-H358 )中顯著增加，Y旦在正常月申iEL織中^^氐或未才企測到。 圖15中，泳道"正常"表示正常肺組織，泳道"癌，，表示肺癌組 織，泳道"轉移"表示轉移性肺癌組織，以及泳道"A549"和 "NCI-H358"每一種均表示肺癌細胞系。圖15 (b)示出了 RNA
印跡結果，通過將相同樣品與(3 -肌動蛋白糹笨針雜交而表明存在m腦A轉錄物。圖29 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG14原癌基因是 否在12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、 心臟、橫糹丈肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺 以及外周血白細胞組織。圖29 (b)示出了 RNA印跡結果，通過將 相同樣品與P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖 29 ( a )所示，MIG14 mRNA轉錄物(大約1.3kb的伊乙勢轉錄物以 及2kb的轉錄物)在正常組織中表達極;微弱或未;f企測到。圖43 (a)示出了 RNA印跡結果，以確定MIG14原癌基因是 否在人類癌細月包系中表達，例^口HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549禾口 G361 ( Clontech )。圖43 (b)示出了 RNA 印跡結果，通過將相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在 mRNA轉錄物。如43 (a)所示，表明MIG14 mRNA轉錄物(大 約1.3kb的優勢轉錄物以及2kb的轉錄物)在前髓細胞白血病細胞 系HL-60、 HeLa子宮癌細l包系、t曼性fl細月包源性白血病細月包系 K-562、成淋巴細月包白血病細月包系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細月包系 Raji、結腸癌細月包系SW480、肺癌細月包系A549以及皮月夫癌細月包系 G361中表達才及高。7-2: MIG8, MIG18, MIG19, MIG5以及MIG7以與實施例1中相同的方式乂人正常外子宮頸《且織、宮頸癌《且織、 砵爭移'l"生宮頸'淋巴結l且織以及宮頸癌細月包系CaSki ( ATCC CRL 1550 ) 和CUMC-6中4是耳又總RNA樣品。為了確定MIG8、 MIG18、 MIG19、 MIG5和MIG7基因中每一種的表達水平，將從所述組織和細胞系每一種提取的變性總RNA 樣品每種各20 JU g在1%曱醛瓊脂糖凝月交中電泳，然後將得到的瓊脂灃唐;疑月交4爭移至尼龍月莫(Boehringer-Mannheim, Germany )上。^)尋印 跡與32P標記的並隨才幾預處理的(primed )全長MIG cDNA 4果針雜 交，其中4笨4十是利用Rediprime II隨才幾prime才示i己系統(Amersham, United Kingdom )所製備。該謂A印跡分析重複兩次，因此用密度 計對得到的印跡加以定量並用P -肌動蛋白進行標準化。圖11示出了 RNA印跡結果，以確定MIG8原癌基因是否在正 常外子宮頸組織、宮頸癌組織、轉移性宮頸'淋巴結組織以及宮頸癌 細胞系(CaSki和CUMC-6 )中表達。如圖ll所示，表明在宮頸癌 組織以及宮頸癌細月包系(CaSki和CUMC-6 )中MIG8原癌基因的 表達水平增加，即過表達約4.0kb的優勢MIG8 mRNA轉錄物和約 1.3kb的MIG8 mRNA轉錄物，而且特別在轉移性宮頸'淋巴結組織 中MIG8原癌基因表達最高，但在正常組織中表達極低。圖ll中， 泳道"正常，，表示正常外子宮頸組織，泳道"癌"表示宮頸癌組織， 泳道"轉移"表示轉移性宮頸淋巴結組織，以及泳道"CaSki"和 "CUMC-6"每一種均表示子宮癌細胞系。圖12示出了RNA印跡 結果，通過將相同樣品與P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA 轉錄物。圖25示出了 RNA印跡結果，以確定MIG8原癌基因是否在12 個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、心臟、 橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以及外 周血白細胞組織。圖26示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與 P -肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖25所示， MIG8 mRNA轉錄物(約4.0kb的優勢MIG8 mRNA轉錄物和約 1.3kb的MIG8 mRNA轉錄物)在正常組織例如腦、心臟、衝黃紋月幾、 大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以及外周血白細 胞中微弱表達。
圖39示出了 RNA印跡結果，以確定MIG8原癌基因是否在人 類癌細月包系中表達，例如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 ( Clontech )。圖40示出了 RNA印跡結果， 通過將相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄 物。如圖39所示，表明MIG8 mRNA轉錄物(大約4.0kb的優勢 MIG8 mRNA轉錄物以及約1.3kb的MIG8 mRNA轉錄物)在前髓 細胞白血病細胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓細胞源性白 血病細月包系K-562、成淋巴細胞白血病細刀包系MOLT-4、伯基特淋 巴瘤細月包系Raji、結腸癌細月包系SW480、肺癌細胞系A549以及皮 膚癌細胞系G361中表達極高。但在皮膚癌細胞系G361中不表達 約1.3 kb的MIG8 mRNA轉錄物。圖16示出了 RNA印跡結果，以確定MIG18原癌基因是否在 正常外子宮頸糹且織、宮頸癌糹且織、4t移't"生宮頸淋巴結糹且織以及宮頸 癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中表達。如圖16所示，表明在宮頸 癌組織以及宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中MIG18原癌基因 的表達水平增加，而且特別在轉移性宮頸淋巴結組織中MIG18原 癌基因表達最高，但在正常組織中表達極低。圖16和17中，泳道"正常"表示正常外子宮頸組織，泳道"癌"表示宮頸癌組織，泳 道"轉移"表示轉移性宮頸'淋巴結組織，以及泳道"CaSki"和"CUMC-6"每一種均表示子宮癌細胞系。圖17示出了 RNA印跡 結果，通過將相同樣品與P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA 轉錄物。圖30示出了 RNA印跡結果，以確定MIG18原癌基因是否在 12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、心臟、 橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以及外 周血白細月包組織。圖31示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與 P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖30所示，
MIG18mRNA轉錄物(大約4.0kb )在正常組織例如心臟、月幾肉和 肝臟中孩吏弱表達。
圖44示出了 RNA印跡結果，以確定MIG18原癌基因是否在 人類癌細胞系中表達，例如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549詳口 G361 ( Clontech )。圖45示出了 RNA印跡結果， 通過將相同樣品與P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄 物。如圖44所示，表明MIG18 mRNA轉錄物在HeLa子宮癌細胞 系和慢性髓細胞源性白血病細胞系K-562中表達極高，以及在前髓 細月包白血病細月包系HL-60、成、淋巴細月包白血病細月包系MOLT-4、伯 基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549 以及皮膚癌細胞系G361中以增高的7jc平表達。
圖18示出了 RNA印跡結果，以確定MIG19原癌基因是否在 正常外子宮頸組織、宮頸癌糹且織、壽爭移性宮頸'淋巴結糹且織以及宮頸 癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中表達。如圖18所示，表明在宮頸 癌糹且織以及宮頸癌細月包系(CaSki ,口 CUMC-6 )中MIG19原癌基因 的表達水平增加，即過表達約4.7kb的優勢MIG19 mRNA轉錄物， 而且特別在轉移性宮頸'淋巴結組織中MIG19原癌基因表達最高， 〃f旦在正常組織中表達才及低。圖18和19中，泳道"正常"表示正常 外子宮頸組織，泳道"癌"表示宮頸癌組織，泳道"轉移"表示轉 移性宮頸'淋巴結組織，泳道"CaSki"和"CUMC-6"每一種均表示 子宮癌細胞系。圖19示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與(3 -肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。
圖32示出了 RNA印跡結果，以確定MIG19原癌基因是否在 12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、心臟、 橫糹丈肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以及外 周血白細胞組織。圖33示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與 (3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖32所示，
MIG19 mRNA轉錄物(大約4.7kb的優勢mRNA轉錄物)在正常 組織例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小 腸、胎盤、肺以及外周血白細胞中表達微弱或未檢測到。
圖46示出了 RNA印跡結果，以確定MIG19原癌基因是否在 人類癌細月包系中表達，例如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 ( Clontech )。圖47示出了 RNA印跡結果， 通過將相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄 物。如圖46所示，表明MIG19 mRNA轉錄物(大約4.7kb的優勢 MIG19 mRNA轉錄物)在前髓細月包白血病細月包系HL-60、 HeLa子 宮癌細胞系、慢性髓細胞源性白血病細胞系K-562、成淋巴細胞白 血病細月包系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細月包系Raji、結腸癌細胞系 SW480、月申癌細月包系A549以及皮膚癌細月包系G361中以才及度增高 的水平表達。但在皮膚癌細胞系G361中不表達約1.3kb的MIG8 mRNA轉錄物。
圖20示出了 RNA印跡結果，以確定MIG5原癌基因是否在正 常外子宮頸組織、宮頸癌組織、轉移性宮頸淋巴結糹且織以及宮頸癌 細月包系(CaSki和CUMC-6 )中表達。
如圖20所示，表明在宮頸癌組織以及宮頸癌細月包系(CaSki 和CUMC-6)中MIG5原癌基因的表達水平增加，即過表達約5.5 kb 的優勢MIG5 mRNA轉錄物，而且特別在轉移性宮頸淋巴結組織中 MIG5原癌基因表達最高，yf旦在正常組織中不表達。圖20和21中， 泳道"正常"表示正常外子宮頸組織，泳道"癌"表示宮頸癌組織， 泳道"轉移，，表示轉移性宮頸'淋巴結組織，以及泳道"CaSki"和 "CUMC-6"每一種均表示子宮癌細胞系。圖21示出了 RNA印跡 結果，通過將相同樣品與(3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA 轉錄物。
圖34示出了 RNA印跡結果，以確定MIG5原癌基因是否在12 個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、心臟、 橫鄉丈肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以及外 周血白細胞組織。圖35示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與 P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖34所示， MIG5 mRNA轉錄物(大約5.5kb的優勢mRNA轉錄物)在正常 組織例如腦、心臟、橫紋力幾、大腸、胸&泉、脾臟、腎臟、肝臟、小 腸、胎盤、肺以及外周血白細胞中不表達。
圖48示出了 RNA印跡結果，以確定MIG5原癌基因是否在人 類癌細月包系中表達，例力。HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 ( Clontech )。圖49示出了 RNA印跡結果， 通過將相同樣品與P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄 物。如圖48所示，表明MIG5 mRNA轉錄物(大約5.5 kb的優勢 mRNA轉錄物)在前髓細胞白血病細胞系HL-60、 HeLa子宮癌細 胞系、慢性髓細胞源性白血病細胞系K-562、成淋巴細月包白血病細 月包系MOLT-4、伯基鬥爭'淋巴瘤細月包系Raji 、結腸癌細月包系SW480、 肺癌細胞系A549以及皮膚癌細胞系G361中以極度增高的水平表 達。但在皮趺癌細胞系G361中不表達約1.3kb的MIG8 mRNA轉 錄物。
圖22示出了 RNA印跡結果，以確定MIG19原癌基因是否在 正常夕卜子宮頸糹且織、宮頸癌糹且織、4t移'l"生宮頸'淋巴結糹且織以及宮頸 癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中表達。如圖22所示，表明在宮頸 癌組織以及宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中MIG7原癌基因 的表達水平增加，即過表達約10 kb的優勢MIG7 mRNA轉錄物， 而且特別在轉移性宮頸淋巴結組織中MIG7原癌基因表達最高，但 在正常組織中表達才及4氐。圖22和23中，泳道"正常，，表示正常夕卜 子宮頸組織，泳道"癌"表示宮頸癌組織，泳道"轉移"表示轉移 性宮頸淋巴結組織，以及泳道"CaSki"和"CUMC-6"每一種均表
示子宮癌細胞系。圖23示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與 P -肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。
圖36示出了 RNA印跡結果，以確定MIG19原癌基因是否在 12個泳道的多種人類正常組織(Clontech)中表達，例如腦、心臟、 橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺以及外 周血白細胞組織。圖37示出了 RNA印跡結果，通過將相同樣品與 (3-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄物。如圖36所示， MIG7 mRNA轉錄物(大約10kb的優勢mRNA轉錄物)在正常組 織例如腦、心臟、橫糹丈肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、 胎盤、肺以及外周血白細胞中表達微弱或檢測不到。
圖50示出了 RNA印跡結果，以確定MIG7原癌基因是否在人 類癌細月包系中表達，侈'H口HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 ( Clontech )。圖51示出了 RNA印跡結果， 通過將相同樣品與P-肌動蛋白探針雜交而表明存在mRNA轉錄 物。如圖50所示，表明MIG7 mRNA轉錄物(大約lOkb的優勢 mRNA轉錄物)在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓細胞源性白血病細 月包系K-562、成、淋巴細月包白血病細月包系MOLT-4、伯基特'淋巴瘤細 胞系Raji、結腸癌細胞系SW480以及肺癌細胞系A549中以才及度增 高的水平表達。
實施例8:確定用原癌基因轉化大腸桿菌後所表達蛋白的大小
將全長MIG原癌基因的每一種例如SEQ ID NO: 1的MIG3、 SEQ ID NO: 5的MIG8、 SEQ ID NO: 9的MIGIO、 SEQ ID NO: 13 的MIG13、 SEQIDNO: 17的MIG14 、 SEQ ID NO: 21的MIG18、 SEQ ID NO: 25的MIG 19、 SEQ ID NO: 29的MIG 5、以及SEQ ID NO: 33的MIG 7均4#入pBAD/thio-Topo載體(Invitrogen, U.S.)的 多克隆位點，然後用得到的每一種pBAD/thio-Topo/MIG載體轉化
大腸桿菌ToplO (Invitrogen， U.S.)。將表達蛋白HT-硫氧還蛋白插 入pBAD/thio-Topo載體多克隆位點的上遊區域。將每一種轉化的大 腸桿菌抹在LB液體培養基中振蕩孵育，然後將每一種得到的培養 物以1/100的比例稀釋，脬育3小時，並力口入0.5 mM L-阿拉伯4唐 (Sigma),以促進蛋白生成。L-阿拉伯糖誘導(induction)前/後，對培養物中的大腸桿菌細 胞進行超聲處理，然後對超聲處理的勻漿進行12%十二烷基硫酸鈉 -聚丙埽醯胺凝月交電泳(SDS-PAGE)。圖52示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG3 載體轉化的大腸桿菌ToplO抹的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地 見察到大約38kDa分子量的融合蛋白條帶。該 38kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約23kDa分子量的MIG3蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG3載體中。圖53示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG8 載體轉化的大腸桿菌Topl0抹的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地〗現察到大約72kDa分子量的融合蛋白條帶。該 72kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約57kDa分子量的MIG8蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG8載體中。圖54示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG10 載體轉化的大腸桿菌Topl0抹的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約60kDa分子量的融合蛋白條帶。該 60kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-碌u氧還蛋白以及 具有大約45kDa分子量的MIG10蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG10載體中。
圖55示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG13 載體轉化的大腸桿菌ToplO林的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約46kDa分子量的融合蛋白條帶。該 46kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約31kDa分子量的MIG13蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG13載體中。
圖56示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG14 載體轉化的大腸桿菌ToplO林的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約54kDa分子量的融合蛋白條帶。該 54kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約39kDa分子量的MIG14蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio畫Topo/MIG14載體中。
圖57示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG18 載體轉化的大腸桿菌ToplO林的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約88kDa分子量的融合蛋白條帶。該 88kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約73kDa分子量的MIG18蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG18載體中。
圖58示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG19 載體轉化的大腸桿菌ToplO林的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約122kDa分子量的融合蛋白條帶。 該122kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-石克氧還蛋白 以及具有大約107kDa分子量的MIG19蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG19載體中。
圖59示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG5 載體轉化的大腸桿菌ToplO抹的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約36kDa分子量的融合蛋白條帶。該 36kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約21kDa分子量的MIG5蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG5載體中。圖60示出了 SDS-PAGE結果，以確定用pBAD/thio-Topo/MIG7 載體轉化的大腸桿菌Topl0抹的蛋白表達模式，其中在L-阿拉伯糖 誘導後，可以清楚地觀察到大約24kDa分子量的融合蛋白條帶。該 24kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白以及 具有大約9kDa分子量的MIG7蛋白，每種蛋白均插入 pBAD/thio-Topo/MIG7載體中。工業應用如上所述，本發明的原癌基因是參與人類致癌作用同時具有誘 導癌症4爭移能力的新基因，可有歲丈用於"^斷癌症，包4舌月申癌、白血 病、子宮癌、'淋巴瘤、結腸癌、皮"夫癌等，還用於產生轉化的動物 等。
權利要求
1.一種人類原癌蛋白，具有的胺基酸序列選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ ID NO22、SEQ ID NO26、SEQ ID NO3Q和SEQID NO34組成的組。
2. —種人類原癌基因，具有的DNA序列選自由對應於SEQ ID NO: 1的核苷@吏序列4立置89-709的DNA序列、只十應於SEQ ID NO: 5的核苦酸序列位置113-1627的DNA序列、對應於SEQ ID NO: 9的核苷酸序列位置23-1276的DNA序列、對應於SEQ ID NO: 13的核苷酸序列位置11-844的DNA序歹'J、對應於SEQ ID NO: 17的核苦S交序列位置67-1125的DNA序列、對應於 SEQ ID NO: 21的核苷酸序列位置215-2212的DNA序列、對 應於SEQ ID NO: 25的核苦S臾序列65-2965的DNA序列、對 應於SEQ ID NO: 29的核苷酸序列J立置159-737的DNA序列、 以及對應於SEQ ID NO: 33的核苷酸序列4立置1435-1685的 DNA序列組成的組，其中所述DNA序列中每一種均編碼如 權利要求1中所定義的原癌蛋白。
3. 根據權利要求2所述的人類原癌基因，其中所述原癌基因具有 選自由SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 29和SEQ ID NO: 33組成的組的DNA序列。
4. 一種包括如權利要求2或3中定義的每一種原癌基因的載體。
5. —種用於診斷癌症及癌症轉移的試劑盒，包括如權利要求1 中定義的每一種原癌蛋白。
6. —種用於i貪斷癌症和癌症專爭移的i式劑盒，包^^口片又利要求2 或3中定義的每一種原癌基因。
全文摘要
本發明披露了一種新型原癌基因及其編碼的蛋白。本發明的原癌基因，是參與人類致癌作用同時具有誘導癌症轉移能力的新型基因，可有效用於診斷癌症，包括肺癌、白血病、子宮癌、淋巴瘤、結腸癌、皮膚癌等，還用於產生轉化的動物等。
文檔編號C07K14/435GK101133081SQ200580048763
公開日2008年2月27日 申請日期2005年12月28日 優先權日2004年12月28日
發明者金弦起, 金振宇 申請人:金弦起