一種納米粒子組合物及其應用的製作方法

2023-05-12 07:53:01 2

專利名稱：一種納米粒子組合物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於預防或治療癌症的納米粒子組合物，特別是涉及表達人類白 細胞介素-2細胞因子或者表達人類幹擾素α細胞因子的質粒和納米聚陽離子載體(Hl) 的納米粒子組合物及其應用。
背景技術：
隨著生物醫學技術的發展，利用生物製劑治療腫瘤的生物治療方案正在興起。與 化療相比較，對於晚期腫瘤患者來說，生物治療是一種更具生理性、可耐受性和有效性。目 前，應用最廣泛的腫瘤生物治療製劑是重組的細胞因子。細胞因子是一組低分子量的調節 蛋白，具有多效性、受體特異性和短暫性的功能特點，是免疫系統的信號調節網絡。臨床和 實驗資料已經證實，多種細胞因子能刺激機體抗腫瘤免疫反應，打破腫瘤引起的免疫耐受， 從而產生抗腫瘤效果。白細胞介素-2 (interleukin-2) IL-2是一個15000-kDa的α螺旋細胞因子，人類 IL-2基因定位於4號染色體4q^_q27，其蛋白編碼系列是由462個鹼基組成mRNA。自1976 年，IL-2首次被發現以來，其生物學功能已經被廣泛的研究。內源性IL-2主要是由激活的 輔助T淋巴細胞和細胞毒性T淋巴細胞產生。它和T細胞表面的特異性受體相結合，快速 而又短暫的激活T淋巴細胞，刺激其增殖和成熟，對T細胞調節的免疫反應具有關鍵性作 用。1980年後，隨著體外重組的IL-2細胞因子的大規模生產和應用，它的抗腫瘤機制被進 一步的闡明。這些包括刺激T細胞的增值、激活細胞殺傷T細胞，刺激自然殺傷細胞(NK) 細胞的增值和細胞殺傷活性，顯著增強B細胞、巨噬細胞的免疫功能，能誘導殺傷細胞LAK 細胞和激活腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)等等。這些使IL-2成為一個極有價值的抗腫瘤候 選藥物。1990年後，多種細胞因子，包括幹擾素α (interferon-α)、IL-2、粒細胞-巨噬 細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、IL-6、IL-12、IL-18等，被用於惡性黑色素瘤、腎癌患者 的臨床測試。其中，高劑量的IL-2和IFNa顯示了最好的抗腫瘤效果。據此，1998年美國 食物和藥物管理部批准了高劑量的IL-2細胞因子和IFNa作為中、晚期惡性黑色素瘤或腎 癌患者的治療藥物。2004年隨訪的資料確認，部分IL-2治療的惡性黑色素瘤患者產生持 續了臨床反應(Atkins MB. Cytokine-based therapy and biochemotherapy foradvanced melanoma. Clin Cancer Res 2006 Apr 1 ；12(7Pt2) :2353s_2358s)。然而，不幸的是，由於細胞因子在體內的半衰期很短，要達到治療效果需要大劑量 的重複注射IL-2細胞因子。例如，美國食物和藥物管理部批准的使用IL-2細胞因子治療 晚期惡性黑色素瘤的標準治療方案是治療前5天和治療開始後的15到19天，每位患者每 8小時接受一次靜脈推注60000到72000U/Kg的IL-2細胞因子。這種高劑量的IL-2治療 方案在病人身上產生了嚴重的毒副作用，比如低血壓、毛細血管滲漏綜合症，心肌炎，短暫 性腎功能不全和導管相關性敗血症等。為了克服這些直接注射細胞因子引起的毒副反應，通過基因治療方法，傳遞編碼 IL-2細胞因子的基因到患者體內，利用患者自身的細胞來持續、高效地合成、分泌IL-2細胞因子。既能減少反覆高劑量注射引起的嚴重毒副反應，同時又能達到抗腫瘤的目的。實 現這一設想主要包括兩方面的內容。一是克隆治療基因的系列；二是高效、安全地傳遞治療 基因。1983年，Taniguchi等已經克隆了編碼人類IL-2的基因序列並且表達了具有生物活 性的IL-2細胞因子。因此，實現這一治療方案的關鍵在於研發一種靶向、安全、有效地傳遞 技術。目前傳遞治療基因的載體主要包括病毒和非病毒兩類。一般來說，病毒類載體在 表達強度和時空性方面比非病毒類載體更優越。以腺病毒(Adv)為載體轉導IL-2基因的 治療方案，已經在多個實驗動物模型上顯示了良好的抗腫瘤效果。最近，Dummer等報導了 他們經腫瘤內注射表達IL-2基因的腺病毒治療多種晚期癌症的I/II臨床測試結果。他們 發現，重複瘤內注射腺病毒介導的IL-2顯示了 17%的目標反應(Dummer R, Rochlitz C， Velu T, Acres B, Limacher JM, Bleuzen P, et al. Intralesional adenovirus—mediated interleukin-2 gene transferfor advanced solid cancers and melanoma. Mol Ther 008 ；16 :985-94)。然而，由病毒載體表面蛋白引發的非期待的宿主免疫反應和潛在的生物 安全性問題一直限制著病毒載體的臨床應用。這促使很多基因治療學家將目光轉移到非病 毒載體。化學合成的非病毒載體主要包括正電子脂質體和聚合物。他們具有非免疫原性、 相對安全、容易修飾、製作價格低、方法簡便等優點。Galanis等報導，I/II期臨床測試中， 正電子脂質體攜帶表達IL-2的質粒通過瘤內注射能治療惡性黑色素瘤。然而，目前所用的 非病毒載體的基因傳遞效率仍然低於腺病毒載體。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，提供一種納米粒子組合物，採用聚陽離子載體，具有 低的毒性和高的轉染效率。本發明還提出上述納米粒子組合物在製備抗腫瘤藥物中的應 用，尤其是在製備治療皮膚癌藥物中的應用。在本申請文件中，本發明所用術語基因的「同源序列」指與該基因具有至少75%的 核苷酸序列一致性，而且基本上不影響所編碼蛋白的功能。基因的同源序列也可以是該基 因的片段，只要其編碼的蛋白功能基本沒有改變。本發明所用術語「預防或治療癌症」指所用組合物可以預防癌症的轉移或復發，減 輕、緩解、控制、改善或治癒原發性癌症或轉移性癌症或其相關的症狀；也可以延長癌症患 者的壽命或活存時間，降低死亡率。本發明所述術語「氮/磷比」中的「氮」是指多聚陽離子中含有的氨基分子數。「磷」 是指質粒脫氧核糖核酸(DAN)中的磷酸根分子含量，常規來說，Iug的質粒DNA含有3nmol 的磷酸根。本發明所述術語pfu (plaque formation unit)為病毒感染滴度，是有感染性的 「活」的腺病毒的總量，即腺病毒的活性單位。測定方法是將腺病毒樣品經過一系列梯度稀 釋後，感染293細胞並培養，通過計算細胞病變空斑數得到腺病毒樣品中PFU/ml值。發明人合成一種以環糊精為交聯骨架，連接低分子量的聚乙烯亞胺(PEI)，偶合具 有腫瘤靶向特異性的小分子藥物葉酸的聚陽離子載體(命名為HI)。Hl已經被證明在液體 環境中能包裹、濃縮表達目的基因的質粒成一種在100納米左右的納米顆粒。在多種腫瘤 細胞系，這種納米顆粒顯示了低毒、高效和靶向特異性的基因傳遞能力。尤其在小鼠黑色素瘤細胞系B16-F10上，這種納米粒子顯示了高的轉染效率和低的毒性。在B16-F10細胞嫁接 的小鼠模型上，通過腫瘤內注射，這種納米粒子顯示了比得上腺病毒載體的基因表達效率。 而且經多次瘤內注射，並沒有發現明顯的毒性反應。因此本發明的內容包括一種納米粒子組合物，包括質粒和載體；所述質粒為表達人類細胞因子的質粒，所 述載體為環糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽離子載體，其結構式為
權利要求
1. 一種納米粒子組合物，其特徵在於包括質粒和載體；所述質粒為表達人類細胞因 子的質粒，所述載體為環糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽離子載體，其結構式為
2.如權利要求1所述的納米粒子組合物，其特徵在於所述表達人類細胞因子質粒為 表達人類白細胞介素-2細胞因子的質粒。
3.如權利要求1所述的納米粒子組合物，其特徵在於所述表達人類細胞因子質粒為 表達人類幹擾素α細胞因子的質粒。
4.如權利要求1所述的納米粒子組合物的製備方法，包括以下步驟(1)構建表達人類細胞生長因子的質粒；(2)構建環糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽離子載體；(3)將步驟(1)、(2)中得到的質粒和載體分別溶解到2.5-5%的葡萄糖溶液中，再按照 5-40 1的氮/磷比將所得溶液混合，形成直徑在100納米左右的納米粒子組合物。
5.如權利要求4所述的納米粒子組合物的製備方法，其特徵在於所述表達人類細胞 因子質粒為表達人類白細胞介素-2細胞因子的質粒或者為表達人類幹擾素α細胞因子的 質粒。
6.如權利要求1所述的納米粒子組合物在製備預防或治療癌症的藥物中的應用。
7.如權利要求1所述的納米粒子組合物在製備預防或治療原發性癌症或轉移性癌症 的藥物中的應用。
8.如權利要求2或3所述的納米粒子組合物在製備預防或治療黑色素瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種多聚陽離子(H1)載體和表達人類白細胞介素-2質粒自組裝成的納米粒子(H1/phIL2)及其在製備治療、控制或預防癌症的藥物中的應用，所述多聚陽離子(H1)載體為環糊精-聚乙烯亞胺-葉酸三元組裝式聚陽離子載體。
文檔編號A61K9/14GK102038958SQ20091011063
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月19日 優先權日2009年10月19日
發明者姚宏, 林李家宓 申請人:姚宏