細胞培養系統的製作方法

2023-05-11 20:15:31

專利名稱：細胞培養系統的製作方法
技術領域：
本發明涉及細胞培養領域。它由一般用於生長細胞和特別是植物細胞的液體培養系統組成。此培養系統基於提供波攪拌的原理，所述提供波攪拌對一次性塑膠袋中含有的細胞培養物提供方便的混合和通氣。此種大規模、有效和一次性的培養系統可以大大降低生長成本。
背景技術：
常規的培養系統一般由具有用於通氣和混合培養內容物的工具(空氣分布器、葉輪)的堅硬容器(玻璃或不鏽鋼)組成。此類系統是複雜的，因為大規模的生產基於不鏽鋼容器、原位滅菌，所以通常的設備和與防腐生物工藝相關的支持設施極端昂貴。60％以上的生產成本是由於固定成本發酵裝置的高資本成本、折舊、利息和資本消耗。由於產量低和每次培養周期後需要清洗和滅菌生物反應器，所以運行成本也高。
在植物細胞培養的特定工業應用中，已使用了不同的公知的培養系統諸如攪動槽或氣升式反應器。儘管對商業化植物代謝物做了許多努力，但是很少達到了商業成功。一個原因是雖然可能獲得高於整個植物中所希望的化合物(迷迭香酸、紫草寧等)的含量(達乾重的20％)，但是生產力低。導致生產力低的主要限制為與細菌相比，植物細胞的低生長率(低於每天0.7，min 20h加倍時間)。在工業發酵罐中分批培養表示在極高成本設施中用植物細胞培養每年運行不超過10-20次。這表示工業生產的瓶頸是經濟瓶頸而不是生物瓶頸。
為了克服此類問題和降低生產成本，最近出現了基於使用多種一次性塑膠袋代替不鏽鋼發酵罐的新技術。用預先滅菌的一次性塑膠袋的此類新系統是有前景的，原因是由於塑料是低成本材料，而且它們不需要費時和費成本的清洗、滅菌、設備的驗證和維修，所以它們降低了資本投資。由於提供的塑膠袋是預先滅菌的，所以它允許通過不需要長時間培訓/學習過程和/或經驗的非本領域技術人員操作，因此在該過程中它具有更大的靈活性。此外，使用非侵入性攪拌工具允許降低機械複雜性和汙染的可能性。此類系統中的通氣用通常的進氣和起泡進行通氣/攪拌和大批混合。反應器可以由槽中具有氣體噴霧器塑膠袋墊圈和有接種和除去培養基樣品能力的磁頭板組成。Osmotec生產的一次性圓錐形塑膠袋用於小規模使用(幾升)，通過進氣口用氣泡通氣。美國專利號6,432,698也描述了培養微生物或細胞的一次性生物反應器，所述一次性生物反應器除了在這裡用塑料材料製備外，接近氣升式生物反應器，包含用於混合和提供氣體氣泡的的空氣起泡器。在此類發明中，小氣泡對敏感細胞可以是有害的，增加了泡沫形成和細胞與壁的粘附，和/或從培養基中剝奪了一些有用的氣體(例如用於植物細胞的乙烯)。
為將細胞損傷降到最小和改善細胞生長和生產力，提出了在此類一次性裝置中的不同的無氣泡的通氣/混合系統。例如，另一建議是用機械系統攪拌或根本不攪拌的可通過氣體的塑膠袋在美國專利號5,057,429中，將氣體可透過的塑膠袋旋轉或振動使氧氣和營養物擴散到動物細胞。美國專利號5,225,346中也描述了靜止的氣體可透過的袋子。至今對此類培養系統沒有進行工業研發，一方面是因為擴大外部攪拌裝置是困難的，另一方面是由於在含有幾升培養基的靜止袋子中向細胞供應的氧氣不充足的問題。在WO 00/66706中，通過圍繞反應器框架的振動軸振動進行攪拌。在《demande de brevet d』invention FR-A-2519020》中，也是圍繞允許攪拌的振動軸振動。此軸可以置於設備的中央或置於一端。Wave Biotech(SinghV，美國專利號6,190,913)也研發了用置於搖動機械裝置上的膨脹袋子系統，所述機械裝置移動袋子使其中含有的液體進行波樣運動。因為此種機械攪拌需要複雜的設備以達到大體積的培養，搖動機械裝置限制了槽的大小；實際上波誘導機械裝置支持了全部的培養腔。在FR-A-2519020中，培養體積僅僅在實驗室規模(2.5升)，在WO 00/66706中限制在200升。在US 6,190,913中，要求保護從100ml至500L的使用體積。在所有此三個專利中，整個培養腔周期性的從一側向另一側搖動，產生對每側的非常高的壓力，這對大規模培養是不適合的。
本發明的目的是通過一次性裝置提供有效和低成本的細胞培養系統，所述一次性培養裝置比已經描述的大部分一次性培養系統更易於放大。
發明概述本發明涉及包含柔性培養腔和波誘導機械裝置的細胞培養裝置，其中波誘導機械裝置舉起培養腔長度的5到50％。
本發明也涉及此種裝置培養植物細胞、動物細胞或微生物的用途。
附圖簡述

圖1為裝置的透視圖。
圖2為裝置的側視圖。
圖3為通過上下移動波誘導機械裝置的波形成的圖示。
圖4顯示細胞培養系統、錐形瓶和攪拌槽反應器中培養的大豆細胞的生長動力學，表示為每升g鮮重。
圖5顯示細胞培養系統、錐形瓶和攪拌槽反應器中培養的大豆細胞的生長動力學，表示為每升g乾重。
發明詳述本裝置提供了用於培養活細胞的簡單系統。它由兩種組分組成一次性培養腔和波誘導機械裝置。此波誘導機械裝置舉起培養腔長度的5到50％。
便宜的、柔韌的和一次性膨脹塑膠袋優選組成培養腔。此塑膠袋部分填充液體培養基和細胞，由于波運動，對所述液體培養基和細胞進行混合和充氧。這樣，培養基的表面連續更新，發生對細胞無害的無氣泡通氣。用簡單的機械裝置上下運動塑膠袋的至少一端引起誘導波運動。此波誘導的機械裝置由用與定時器連接的發動機或者活塞周期性升高的小板組成。此種簡單的波誘導機械裝置允許容易地放大。
因為本發明是一次性的和在大規模上是有效的，所以它是在工業應用中降低生產成本的好的備選系統。此外，因為不需要像傳統不鏽鋼設備中的清洗、維修或驗證，所以此種一次性系統允許方法的靈活性和降低了失效時間。此培養細胞可以用於植物細胞、動物細胞培養或微生物培養，由于波誘導機械裝置非常簡單，從小袋到大袋的放大是非常容易的。此方法允許通過分批培養、補料分批培養或連續培養允許重頭產生代謝物、生物轉化、重組蛋白質或繁殖胚胎發生的植物細胞系以及對技術人員顯然的任意其它用途。
本發明的基本設計在圖1(透視圖)和圖2(側面圖)中顯示。生物反應器由不同部分組成，其包含由諸如，例如沿著邊緣(2)密封的柔韌生物相容塑料布的材料製成的至少一個培養腔(1)，以產生內部。由於本發明基於提供波的攪拌原理，所以第二個基本部分是波誘導機械裝置(7)，所述波誘導機械裝置可以由例如，在培養腔至少一端以下放置的板或如拉起培養腔一端的系統的任意其它適當工具組成。波誘導機械裝置也可以由在培養腔的中央部分或任意其它部分上下運動的板組成。
在本發明優選的實施方案中，培養腔由具有可密封和可高壓滅菌性質的柔韌聚丙烯製成的袋子，因此它可以用小實驗室高壓滅菌器或通過本領域公知的其它方法滅菌。然而其它類型的塑料材料諸如聚乙烯也是合適的，可以使用其它類型的滅菌技術。
在本發明優選的實施方案中，柔韌生物相容的防水材料沿著它們的邊緣(2)例如，用熱脈衝密封器熱密封。然而根據本領域公知的方法，也可以使用其它的密封技術，包括但不限於超聲或無線電波焊接。可以不同的方式例如模注射製備不需要密封的其它類型的塑料。
袋子優選枕頭形狀但可以用其它形狀，尺寸可以變化以適合使用者的需要。在本發明中，形成培養腔的袋子可以具有正方形、長方形、橢圓形、圓形或梯形表面。然而長方形優選地用於改進本發明的方法和裝置的效率。袋子的特別優選的尺寸對於100升培養物為長3.20m，寬0.9m或對於25升培養物為長3m和寬0.3m。然而，長度可達10m和10m以上，本發明允許從1升至幾百升，諸如100、300、500、1000L或更多培養基。
在優選的實施方案中，連接到培養腔的上側的至少兩個管子可以保證氧氣更新；第一個(3)提供了進氣(根據培養需要的壓縮空氣或其它氣體)，第二個(4)排洩廢氣。在最優選的實施方案中，此兩個管子裝備了過濾器例如，0.22μm過濾器以防止空氣傳播的汙染。提供氧氣供應和排除通過培養產生的氣體的另一方法是至少在袋子的上表面部分提供氣體通透膜。此膜必須具有氣體通透性和足可保證培養的良好充氧的表面。此膜可以例如密封或焊接在袋子上。此膜必須優選不通透液體、水蒸氣和汙染物。
此外，在圖1顯示的基本設計中，至少兩個其它管子可以連接在培養腔上。一個(5)連接在袋子的上部以用懸浮在新鮮無菌培養基中的接種物填充生物反應器。另一個(6)與袋子的下側連接以收取樣品或收穫培養物。這些管子優選(但不限於)由可高壓滅菌的矽酮製備，內徑/外徑的比率為8/12mm，但此比率當然可以改變以適合操作人員的需要。
培養系統的第二個基本部分為波誘導機械裝置(7)。如圖2顯示地，此裝置在由小板製成，其優選正好置於培養腔的至少一端，但所述板可以置於培養腔的中間點，或置於所述培養腔的任意其它部分。在優選的實施方案中，板的寬度與培養腔的寬度相等並且板的長度為培養腔長度的5到50％，更優選8到20％。通過上下運動1°至90°，優選1至45°，最優選1°至25°角，小板在液體培養物(9)中誘導波(8)，其提供培養物的混合和充氧。由於袋子是膨脹的，它允許波在培養腔(10)中擴散。在優選的實施方案中，培養基的高度為膨脹的培養腔高度的10至30％。令人驚奇地是當波到達相反端(11)時，它在起始點(12)返回而不受破壞。然後，機械裝置再次產生脈衝(13)。為改善波地返回，輕微舉起相反端也是可能的。
用機動化臂或用活塞但也可以選擇其它類型裝置可以將波誘導機械裝置的小板周期性升高。此裝置優選與定時器連接，以選擇波誘導的更合適的頻率。
當非常長的培養腔用於大體積，例如幾百升以上的培養時，也可以將波誘導機械裝置置於培養腔的每一端。在此種情況下波誘導機械裝置交替舉起培養腔長度的5到50％或更優選7到20％。
本發明基于波誘導提供液體培養物混合和無氣泡通氣的事實。通過從頂部空間空氣擴散到液體培養物進行氧轉移和提供無剪切力的生長。
由於培養腔和攪動方法簡單，因此此種培養系統易於操作。由于波誘導機械裝置不支持整個培養腔但僅僅需要舉起培養腔的至少一端，因此容易實現從小體積到幾百升的放大。
優選地，培養腔以20至80％，最優選20至40％的填充率填充細胞和培養基。
實施例以下實施例為在本發明範圍內一些產品和製備所述產品的方法的示例。不將該實施例認為是以任意方式限制本發明。可以對本發明進行改變和修改。即，技術人員將認識到這些實施例的許多變化以覆蓋寬範圍的配方、成分、加工和混合物以對多種應用合理地調節本發明的化合物的天然存在的水平。
實施例與大豆細胞培養物生長的比較本發明生長大豆細胞的能力用分批培養得到證實。甚至在較大規模時，這比得上或好於錐形瓶或攪動槽生物反應器。
Glycine max(L.)Merr.的組織培養株最初來自用Gamborg等人的培養基(1968)培養的不同品種，所述培養基添加20g.L-1蔗糖、7g.L-1瓊脂(bacto-agar Difco)和1mg.L-12，4-二氯苯氧乙酸。將pH調整到5.8，然後高壓滅菌(115℃，30分鐘)。將一株(13406，cv.Maple arrow)轉移到液體培養基中(與無瓊脂和30g.L-1蔗糖的組織培養物相同的培養基)，在組織培養中心相同的條件下，每兩周在250mL錐形瓶(100mL培養基具有3g.L-1鮮重)中傳代培養。將錐形瓶置於100轉/分鐘(振動直徑20mm)的定軌搖床上。
用與以上談及的相同的培養基和溫度和pH條件，使用具有六個平葉片葉輪的14L攪動槽生物反應器(New Brunswick Scientific)。將含有9L新鮮培養基的生物反應器在115℃高壓滅菌40分鐘。將十四日齡大豆細胞從兩個1L錐形瓶(500ml培養基)中過濾。將300g鮮重的大豆細胞放到無菌槽的1L新鮮培養基中，所述無菌槽具有與生物反應器無菌連接用於接種的特定輸出裝置。將攪拌器速度調整到100轉/分鐘。用裝備可滅菌氧探針(金)和質量流速計的生物傳感器，通過升高或降低空氣流速將溶解氧維持在30％。
細胞培養系統(如以前描述地)填充新鮮培養基中的10L大豆細胞(30g/L鮮重)。將室溫調節到25℃，每4秒產生波(通過編程如以上談及的波誘導機械裝置)。
生長測定在特定生長期從燒瓶、攪動槽生物反應器和細胞培養系統取培養批的樣品並測定樣品體積。然後通過過濾將細胞從液體培養物中除去並稱重(鮮重)。將此生物量的等分試樣置於100℃的乾燥室24小時，然後精確稱重(乾重)。
此實施例顯示10L規模的細胞培養系統似乎對細胞提供了溫和的環境，比得上燒瓶並且好於攪動槽反應器。細胞損傷是有限的，在操作條件下質量和氣體轉移是有效的。
如以上已經談及地，本發明提供了許多優點，所述優點又是經濟利益的關鍵它提供了生長植物細胞的溫和環境容易放大它是一次性的它易於操作
權利要求
1.細胞培養裝置，其包含-柔性培養腔，和-波誘導機械裝置，其中所述波誘導機械裝置舉起培養腔長度的5到50％。
2.根據權利要求1的細胞培養裝置，其中所述波誘導系統移動培養腔下面部分表面面積的8至20％。
3.根據權利要求1或權利要求2的細胞培養裝置，其中所述波誘導機械裝置將培養腔的下面部分移動1至90°，優選1至25°的角度。
4.根據任一前述權利要求的細胞培養裝置，其中所述細胞培養腔包含循環空氣的裝置，諸如管或空氣可透過的膜。
5.根據任一前述權利要求的細胞培養裝置，其中所述波誘導機械裝置交替舉起培養腔長度的5到50％。
6.根據任一前述權利要求的細胞培養裝置，其中所述培養腔為柔性塑膠袋。
7.根據任一前述權利要求的細胞培養裝置，其中所述培養腔填充率為10至80％，優選20-40％。
8.根據任一前述權利要求的細胞培養裝置的用途，用於培養植物細胞、動物細胞或微生物。
9.根據任一前述權利要求的細胞培養裝置的用途，其中所述細胞產生生物量細胞、胚胎發生的植物細胞、代謝物、次生植物代謝物和/或重組分子。
全文摘要
本發明提供了生長細胞或微生物的新的裝置，其中所述培養腔部分填充液體培養基和細胞。波誘導機械裝置舉起培養腔長度的5到50％。通過誘導從生物反應器的一端到另一端的間歇波實現混合和通氣。由於本發明的設計非常簡單，因此可以用柔性塑料材料製造它和用此裝置作為一次性系統。此外，此種混合/通氣原理將通常由於剪切力和小氣泡引起的細胞損傷降到最小。由于波誘導機械裝置非常簡單，所以允許容易且有效地從小規模到較大規模的放大。此種大規模、有效且一次性的培養系統可以很大地降低生產成本。
文檔編號C12M1/04GK1882681SQ200480033857
公開日2006年12月20日 申請日期2004年11月18日 優先權日2003年11月18日
發明者D·庫爾圖瓦, A·R·G·居維葉, N·埃諾 申請人:雀巢技術公司