一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法

2023-05-12 05:47:31 1

專利名稱：一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種規模化生產人α I"抗胰蛋白酶的方法。
背景技術：
人α 1-抗胰蛋白酶是一種大約分子量為52000-55000道爾頓(Da)的糖蛋白。此蛋白是由幾個寡核苷酸共價連接的單鏈蛋白，它是一種內源性蛋白酶抑制劑，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰彈性蛋白酶、血管緊張肽原酶、皮膚膠原蛋白酶、脲激酶和分葉核淋巴細胞蛋白酶。與α 1-抗胰蛋白酶缺乏直接相關的疾病主要是肺和肝臟疾病，慢性阻塞性肺病 (COPD)是一種常見的慢性呼吸系統疾病，患病人數多，病死率高。其主要特徵是慢性氣流阻塞，並呈進行性發展，嚴重影響患者的勞動能力及生活質量。近來開始應用人α 1-抗胰蛋白酶治療由於α 1_抗胰蛋白酶缺陷引起的遺傳性疾病和後天獲得性α -抗胰蛋白酶缺陷性疾病，獲得了較好的治療效果。給予α -抗胰蛋白酶能有效地抑制肺中淋巴細胞彈性蛋白酶。淋巴細胞彈性蛋白酶能破壞肺的外源蛋白。 當α 1-抗胰蛋白酶缺失時，不能很好地調節彈性蛋白酶的活性，使彈性蛋白酶就破壞肺組織導致肺組織損傷引起肺氣腫，α 1-抗胰蛋白酶能成功的用於治療肺氣腫、慢性氣管炎和氣管炎等。由於用於治療的α 1-抗胰蛋白酶基本上是來源人血漿，原料來源有限，為了滿足臨床病人的需求，應最大可能地提高血漿來源的α 1-抗胰蛋白酶收穫率，同時也要嚴格控制其純度。現已公開的人α -抗胰蛋白酶的生產方法，均提出收率高，但未公開其每噸血漿的回收率，因此無法獲知規模化生產後製品的產量，而且實施例顯示均為實驗室規模生產，無法驗證其能否實施規模化生產。我公司經過研究發明了一種規模化生產人α 1-抗胰蛋白酶的方法，該方法以血液製品生產中的廢料組分IV-I沉澱為原料，用酒精和PEG先沉澱大部分雜蛋白，使α 1-抗胰蛋白酶的純度達到60% 70%，再採用兩步層析工藝，生產出高純度的α 1-抗胰蛋白酶，該生產工藝操作相對簡單，生產成本較低，製品的回收率高， 純度高，比活也比較高，適合工業化規模化生產。而且製品的病毒滅活採用S/D滅活和巴氏滅活，對脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有效，保證了產品的病毒安全性。

發明內容
本發明的目的是提供一種規模化生產人α 1-抗胰蛋白酶的方法，產品的回收率高、純度高、比活高，可以工業化、規模化生產。本發明所提供的生產α 1-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟血漿加入生理鹽水進行稀釋，調整溶液的ρΗ值為7. 0 7. 4，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%，維持溫度-3 -1°C，離子強度0. 12 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉澱 I ；上清I調整ρΗ值為6. 5 6. 9，加入乙醇至乙醇濃度為20% 25%，維持溫度為-5 -3V，離子強度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III和沉澱II+III ；上清II+III調整pH值為5.0 5. 4，調整乙醇濃度為16 % 19%，維持溫度為-5 -3°C，離子強度0. 07 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉澱IV-1 ；沉澱IV-I用5 8倍緩衝液溶解，溫度-3 -l°c，加入冷乙醇至乙醇濃度為 8%~ 12%,pH5. 2 5. 6，攪拌，離心，離心液用0. 45 μ m的濾器過濾，取上清A ；上清A按10 1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐溫-80溶液(磷酸三丁酯的濃度為3. 3%和吐溫-80的濃度為11% )，使磷酸三丁酯的最終濃度為0. 3% (g/ml)，吐溫-80 的最終濃度為(g/ml)，在M 條件下，孵育6小時；然後加入PEG4000至其濃度為10% 15% (g/ml)，調整溶液的pH值為5. 0 5. 5，溫度為-1 1°C，離心，取上清B ；上清B用0. 45 μ m的濾器過濾，過濾液用DEAE Sepharose fast flow弱陰離子交換層析，層析柱先用pH為6. 8 7. 2的磷酸鹽緩衝液平衡，上樣，收集流出蛋白峰；層析柱再生用0. 5M的NaCl溶液衝洗。收集的蛋白液再經DEAE Sepharose CL 6B層析，先用0.01M ρΗ6· 2 6. 8磷酸鹽緩衝液平衡層析柱，用0. OlM 0. 03Μ ρΗ6. 2 6. 8磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. 04Μ 0. 06ΜρΗ6. 2 6. 8磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液用截留分子量為IOKD的超濾器超濾，透析，加入3% 5% (g/ml)甘氨酸和3% 5% (g/ml)葡萄糖做保護劑，巴氏滅活，除菌過濾，分裝，凍幹，得到人α 1-抗胰蛋白酶粉末。本發明一種規模化生產人α 1-抗胰蛋白酶的方法，其中所述緩衝液是PH值為 8. 0 8. 6的Tris緩衝液。本發明一種規模化生產人α 1-抗胰蛋白酶的方法，每1000L血漿可回收人 α 1-抗胰蛋白酶300 400克，製品的純度達到96 % 99 %，製品的比活達到0. 7 1.0PEU/mg 蛋白。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明的工藝流程方框示意圖。
具體實施例方式實施例1、血漿1000L，加入1倍生理鹽水進行稀釋，用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整 PH7. 2，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為8%，維持溫度為_1°C，離子強度0. 14，持續攪拌 2小時，離心，得到上清I和沉澱I ；上清I用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH6. 7，攪拌條件下加入乙醇至乙醇濃度為25%維持溫度為-5°C，離子強度0. 09，持續攪拌2小時，離心，得到上清II+III和沉澱 II+III ；上清II+III用pH4. 0的醋酸-醋酸鈉緩衝液調整pH5. 2，攪拌條件下加入生理鹽水調整乙醇濃度為18%，維持溫度為_4°C，離子強度0. 09，持續攪拌2小時，離心，得到上清 IV-I和沉澱IV-I ；沉澱IV-I用6倍pH值為8. 0的Tris緩衝液溶解，溫度-2V，調節溶液的pH值為5. 4，加入冷乙醇至乙醇濃度為12%，離心，離心液用0. 45 μ m的濾器過濾，取上清A ；上清A按10 1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐溫-80溶液(磷酸三丁酯的濃度為3. 3%和吐溫-80的濃度為11% )，使磷酸三丁酯的最終濃度為0. 3% (g/ml)，吐溫-80 的最終濃度為(g/ml)，在M 條件下，孵育6小時；然後加入PEG4000至其濃度為12% (g/ml)，調整溶液的pH值為5. 1，溫度為0°C，離心，取上清B;上清B用0. 45 μ m的濾器過濾，過濾液用DEAE Sepharose Fast Flow弱陰離子交換層析，收集流出蛋白峰。收集的蛋白液再經DEAE Sepharose CL 6B層析，用0. 02M pH值為6. 4的磷酸鹽緩衝液洗滌，再用0. 05M pH值為6. 4的磷酸鹽緩衝液洗脫，洗脫液用截留分子量為IOKD的超濾器超濾，透析，加入4% (g/ml)甘氨酸和4% (g/ml)葡萄糖做保護劑，進行巴氏滅活， 滅活後除菌過濾，分裝，凍幹，得到人α -抗胰蛋白酶粉末。檢測結果見表1.表1:結果分析
權利要求
1.一種規模化生產人α ι-抗胰蛋白酶的方法，包括如下步驟(a)採用低溫乙醇法製得血漿沉澱IV-I；(b)沉澱IV-I用緩衝液溶解；(c)加入冷乙醇沉澱，攪拌，離心，離心液用濾器過濾，取上清A；(d)上清A溶液進行S/D病毒滅活，然後用PEG沉澱，取上清B；(e)上清B用濾器過濾，過濾液用DEAESepharose Fast Flow弱陰離子交換層析；(f)收集的蛋白液再經DEAESepharose CL 6B離子交換層析；(g)收集洗脫液，超濾，透析，巴氏滅活，除菌過濾，分裝，凍幹，得到α -抗胰蛋白酶粉末。
2.根據權利要求1所述的一種規模化生產人α -抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟(a)中，所述的沉澱IV-I是通過以下步驟得來的血漿加入生理鹽水進行稀釋，調整 pH 7. O 7. 4，加入乙醇至乙醇濃度為8% 10%，維持溫度-3 -11，離子強度0. 12 0. 14，攪拌，離心，得到上清I和沉澱I ；上清I調整pH6. 5 6. 9，加入乙醇至乙醇濃度為 20% 25%，維持溫度為-5 _3°C，離子強度0. 08 0. 10，攪拌，離心，得到上清II+III 和沉澱II+III ；上清II+III調整pH5.0 5. 4，調整乙醇濃度為16% 19%，維持溫度為-5 -3V，離子強度0. 07 0. 09，攪拌，離心，得到上清IV-I和沉澱IV-I。
3.根據權利要求1或2所述的一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟(b)中所述的緩衝液是pH值為8. 0 8. 6的Tris緩衝液。
4.根據權利要求3所述的一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於所述的濾器，其孔徑大小為0. 45 μ m。
5.根據權利要求1或2所述的一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟(c)中所述的冷乙醇沉澱是在溶液中加入冷乙醇至乙醇濃度為8% 12%，ρΗ5. 2 5. 6ο
6.根據權利要求5所述的一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟 (d)中所述的PEG分子量為4000，濃度為10% 15% (g/ml)。
7.根據權利要求5所述的一種規模化生產人α -抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟⑷中所述的PEG沉澱是在溶液中加入PEG濃度至10% 15% (g/ml)，溶液的pH值為 5. 0 5. 5，溫度為-1 1°C進行沉澱。
8.根據權利要求6或7所述的一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟(d)中所述的S/D病毒滅活是在上清A中按10 1的比例加入配好的磷酸三丁酯和吐溫-80溶液，使磷酸三丁酯的最終濃度為0.3% (g/ml)，吐溫-80的最終濃度為(g/ ml)，在M 條件下，孵育6小時。
9.根據權利要求6或7所述的一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟(g)中所述的超濾器其截留分子量為10KD。
10.根據權利要求9所述的一種規模化生產人α -抗胰蛋白酶的方法，其特徵在於步驟(g)中所述的巴氏滅活時，在洗脫液中加入3% 5%甘氨酸和3% 5%葡萄糖做保護劑。
全文摘要
本發明公開了一種規模化生產人α1-抗胰蛋白酶的方法，具體涉及從人血漿分離的組分IV-1中純化α1-抗胰蛋白酶。本發明包括以下步驟採用低溫乙醇法製得血漿沉澱IV-1；將沉澱IV-1溶解於緩衝液中，加入冷乙醇沉澱，過濾，取上清A；上清A進行S/D病毒滅活；然後加入PEG沉澱，得到上清B，過濾，分別進行DEAE Sepharose fast flow離子交換層析，DEAE Sepharose CL 6B層析，洗滌，洗脫，收集洗脫液，超濾透析，巴氏滅活，除菌過濾，分裝，凍幹，得到α1-抗胰蛋白酶粉末。本發明所生產的人α1-抗胰蛋白酶不僅產率高、純度高，製品的比活也比較高，而且還可以進行工業化、規模化生產。
文檔編號C07K1/18GK102180966SQ20111003079
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月28日 優先權日2011年1月28日
發明者于洋, 孫曉東, 李常祿, 楊金平, 郭晶, 陳鳳珠, 魏舒 申請人:哈爾濱派斯菲科生物製藥股份有限公司