監測視網膜病的方法

2023-05-16 09:50:31

專利名稱：監測視網膜病的方法
技術領域：
本發明涉及在活體視網膜內監測視網膜病的方法。
背景技術：
對於對"初級"視網膜病(源於眼睛障礙)和對"次級，，視網膜病(源 於在除了眼晴之外的器官的系統障礙)的活體臨床前期篩查，以及對於候 補治療劑的功效和可能的毒性的監測，在視網膜病的實驗模型的視網膜中 的gliotic反應的無創傷性螢光分子成像受到關注。
各種眼部條件以及在眼睛外部的眾多系統可引起視網膜病，而視網膜 病是導致視場損失或致盲的視網膜非炎性變性疾病。
利用視網膜檢查和/或視神經檢查可診斷多種視網膜障礙。這種障礙的 例子包括高血壓、與外圍細動脈收縮相關聯的系統血壓的慢性增加(Tien Yin Wong， 2004; Hammond S， 2006; Topouzis F， 2006 )、血管病 (Yamakawa K, 2001; McCulley TJ， 2005)、先天性心臟病 (Mansour 等人，2005)、自身免疫性疾病(例如風溼性關節炎，其引起關節和其他身 體部位的慢性炎症)(Giordano N, 19卯；Aristodemou P, 2006 )、多發性 硬化症(其包括對中樞神經系統(CNS )中的神經元髓鞘的破壞)(Lucarelli MJ， 1991; Kenison JB, 1994; Lycke J， 2001 )、神經纖維瘤病(Chan CC, 2002; Karadimas P， 2003; Ruggieri M， 2004 )、萊姆神經疏螺旋體病
5(Burkhard等人，2001 )、唐氏綜合症(Satge D， 2005; Liza-Sharmini AT, 2006 )、孤獨症(Ek等人，1998 )、鐮狀細胞貧血(Sandstrom H， 1997; Chalam KV, 2004; Shakoor A， 2005; Lima C S， 2006 )、傳染病例如HIV( A R Irvine, 1997; Kozak 1， 2005; V T Phaml， 2005 )和細胞巨化病毒(Vogd JU， 2005; Zhang M， 2005a; Zhang M5 2005b )、糖尿病(Antonetti DA， 2006; Takahashi H， 2006; Vujosevic S， 2006 )、甲狀腺障礙症(Bahceci UA， 2005; Mader MM, 2006; Roberts MR5 2006 )、肝臟障礙症(Heidrun Kuhrt, 2004; Coiakogiu Onder, 2005 )、眼部疾病例如視網膜襞裂症(Kirsdi等人，1996 )、 老年性黃斑變性(Guidry等人，2002)和青光眼(Wang L, 2002)、以 及坤申經組織變性疾病(Blanks JC， 1996a; Helmlinger D， 2002 )。
視網膜的活體成像方法通常為反射成像或造影注射螢光血管造影術
(Hawes NL, 1999; Bruce E. Cohan, 2003 )，但這些方法不允許看到分子 級的改變。此外，在注射造影劑時可能導致疤痕、滲漏和發炎反應，影響 所獲得的效果(Ritter等人，2005 )。
因此，存在對這樣的視網膜病模型的需求，該視網膜病模型允許活體、 無創傷性地監測視網膜病的狀態，用於與疾病t艮、預後、以及對潛在的 治療功效和毒性的評估有關的應用。

發明內容
在一個方面，本發明提供一種監測視網膜病的方法，其包括提供活 的轉基因的非人類的動物，該動物具有視網膜病或具有易患視網膜病的體 質，其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編碼的核酸分子被整合 到所述轉基因的非人類的動物的基因組中；以及在所述轉基因的非人類的 動物的視網膜神經膠質中在第一時刻活體檢測所述螢光蛋白質的第一焚光 水平，並且在第二時刻活體檢測所述螢光蛋白質的第二螢光水平。
在另一方面，本發明還提供一種監測視網膜病的方法，其包括提供 活的第一轉基因的非人類的動物，該動物具有視網膜病或具有易患視網膜 病的體質，其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編碼的核酸分子被整合到所述第一轉基因的非人類的動物的基因組中；提供活的第二轉基 因的非人類的動物，該動物不具有視網膜病或不具有易患視網膜病的體質， 其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編碼的核酸分子被整合到所 述第二轉基因的非人類的動物的基因組中；以及在所述第一轉基因的非人
類的動物的視網膜神經膠質中活^測所述螢光蛋白質的第一螢光水平， 並且在所述第二轉基因的非人類的動物的視網膜神經膠質中活體檢測所述 螢光蛋白質的第二螢光水平。
在結合附圖閱覽了對本發明的具體實施例的以下描述之後，對於本領 域普通技術人員而言，本發明的其他方面和特徵將變得明顯。


在通過實例示例本發明的實施例的附圖中
圖1:成年鼠視網膜的視神經盤中的經鹽水處理的和神經毒物KA誘 導的GFP提高的螢光分子成像。GFP螢光在第7天在視神經盤的邊緣附 近達到最大值；
圖2:在單次ip注射之後7天視網膜的神經纖維層(NFL )中的顯示 出KA誘導的神經M增生的整個視網膜的平鋪圖像。在經鹽水處理的受 控鼠的整個視網膜中可看到GFP和GFAP表示的基準水平；尺度條 =200/tnr，
圖3:在單次神經毒物ip注射(箭頭所示)之後7天通過反應星形膠 質細胞的突起和細胞體而被包膜的經KA處理的鼠(右側合併的圖像)的 gliotic視網膜中的視網膜脈管系統。用轉基因GFP標示星形M細胞體和 突起，但GFAP標示通常被限定為突起(箭頭所示)。在經鹽水處理的受 控鼠(左側合併的圖像)的整個視網膜中可看到GFP和GFAP (紅色)表 示的基準水平；尺度條-50/un;
圖4:聚焦在以貫穿整個視網膜的深度等間距設置的經KA處理的鼠 的視神經盤處的一系列共焦圖像表明在神經毒物的單次ip注射之後7天誘 導的神經膠質增生。在從神經纖維層(NFL)和神經節細胞層開始進入內部叢狀層(15-20/on)的約0-15/tm處的星形膠質細胞體和突起中顯示出神 經膠質增生的程度。另外，在20gm處清楚示出的是在浮見神經盤附近區域 中Mtiller細胞的反應性突起的橫斷圖顯著的位置。在經鹽水處理的受控鼠 的整個視網膜中也可看到有關轉基因GFP表示水平的各種深度信息；尺度 條=100/*111;
圖5:在神經毒物的施用之後7天在整個海馬的星形膠質細胞(綠色， 10Am的大小)中的神經毒物KA誘導的嚴重神經膠質增生，如通過轉基 因GFP螢光和GFAP抗體著色(紅色)所揭示的。經鹽水處理的受控鼠 大腦的海馬中可看到GFP和GFAP表示的基準水平；尺度條=200^11。在 合併圖像中以黃色指示由GFP和GFAP雙重標示的細胞；
圖6:在神經毒物的施用之後7天在海馬的CA1區域中的神經毒物 KA誘導的神經膠質增生。在經鹽水處理的受控鼠大腦的CA1區域中可看 到GFP和GFAP表示的基準線水平；尺度條-100/im;
圖7:在神經毒物的施用之後7天在海馬的CA3區域中的神經毒物 KA誘導的神經月交質增生。在經鹽水處理的受控鼠大腦的CA3區域中可看 到GFP和GFAP表示的基準線水平；尺度條=100/*111;
圖8:在神經毒物的施用之後7天在海馬的齒狀腦回區域中的神經毒 物KA誘導的神經膠質增生。在經鹽水處理的受控鼠大腦的齒狀腦回中可 看到GFP和GFAP表示的基準線水平；尺度條400/mi;
圖9:在成年鼠視網膜的視神經盤中的經鹽水處理的和神經毒物 2'-CH3-MPTP誘導的GFP提高的焚光分子成像。GFP焚光在第1天在視 神經盤的邊緣附近達到最大值；
圖10:在神經毒物的施用之後一天黑質的星形膠質細胞(綠色， 10^n 的大小)中的神經毒物2'-CH3-MPTP誘導的神經膠質增生，如通過轉基 因GFP螢光和GFAP抗體著色(紅色)所揭示的。經鹽水處理的受控鼠 大腦的黑質中可看到GFP和GFAP表示的基準水平。箭頭指示由GFP和 GFAP雙重標示的一些細胞；尺度條-50pm;
圖11:在經神經毒物處理的大腦的黑質密部(SNpc)區域中，在神經毒物的施用之後一天，多巴胺神經元中的具有可見的去酪氨酸羥化酶(TH) 的星形膠質細胞(紅色， 20/tm的大小)中的神經毒物2'-CH3-MPTP誘 導的神經膠質增生。經鹽水處理的鼠大腦的SNpc中檢測到GFP和TH表 示的基準線水平；尺度條-50^n;
圖12:在經神經毒物處理的大腦的紋狀體中，與在中腦SNpc中的 2'-CH3-MPTP的神經毒害效果類似地，在轉基因GFP紋狀體星形膠質細 胞中神經毒物的施用之後一天，觀測到急劇的神經膠質增生。由於紋狀體 中的TH的低基準表示水平，伴隨著在GFP標示的星形膠質細胞中的急劇 的神經膠質增生，不能直觀地觀測到TH表示的變化；
圖13:在成年鼠視網膜的視神經盤中的經鹽水處理的和神經毒物 IDPN誘導的GFP提高的螢光分子成像。GFP螢光在第7天在視神經盤的 邊緣附近達到最大值；
圖14:在神經毒物的施用之後7天主要在嗅球(合併圖像中的箭頭所 示)的小球層(GL)的星形膠質細胞(綠色， 10pm的大小)中的神經 毒物IDPN誘導的急劇的神經膠質增生，如通過轉基因GFP螢光和GFAP 抗體著色(紅色)所揭示的。經鹽水處理的鼠大腦的嗅球中可看到GFP和 GFAP表示的基準線控制水平；尺度條-100/im;以及
圖15:在神經毒物的施用之後7天，在嗅球7的GL和粒細胞層(GCL ) 的星形月交質細胞中的神經毒物IDPN誘導的神經膠質增生。經鹽水處理的 受控鼠大腦的嗅球中可看到GFP和GFAP表示的基準水平。在合併圖像 中以黃色指示由GFP和GFAP雙重標示的細胞；尺度條=200#111。
具體實施例方式
本發明涉及允許以無創傷性方式，包括以分子水平，活體監測疾病的 視網膜病的模型。該活體模型提供用以研究疾病進展以及對源於例如神經 組織變性疾病和神經毒性的誘因的疾病和障礙症的治療的方法。在此描述 用於對動物模型中的視網膜神經膠質成像的方法，並且這些方法可提供實 現對初級和次級^L網膜病的診斷的實時效用，並用於評估治療劑混合物的
9功效和神經毒性。這些方法是非治療方法，其被設計為輔助表徵和理解視 網膜病，即使在某些情況下，使用活體非人類的動物模型可測試潛在的治
療或處理，例如，用於估定任何潛在的治療或處理的功效、作用或毒性的 目的。
視網膜由幾個神經元層(包括神經節細胞層(GCL ))和神經膠質(包 括星形膠質細胞和Miiller細胞)。神經節細胞將信號從前面的感光細胞經 由軸突傳送到視神經，然後傳送到大腦。由於視網膜和視神經為大腦的胚 胎贅生物(embryonic outgrowths ),它們常常被用作CNS的簡單模型。 眼睛的清澈的光學介質允許在被標示的疾病突M展時直接可視，使得視 網膜和視神經成為對CNS的活體研究的最容易觸及的部件。由於視網膜與 CNS相連，在神經組織變性疾病(例如阿爾茨海默氏病和帕金森症)中， 其也影響，並且由此代表CNS的狀況。在阿爾茨海默氏病的情況下，已證 明與年齡匹配控制相比在視網膜神經節細胞中存在總體25%的降低
(Blanks JC， 1996b )。
由於視網膜是具有有限數目的不同細胞類型的高度組織化和均勻的組 織，與CNS的其他區域相比，對具有視網膜相關疾病的視網膜的監測便於 識別在特定疾病病理學中所涉及的細胞(Morgan J.， 2005)。因此，對視
幫助判斷預後和監測患者的疾病進展。由於其可及性，視網膜不僅允許系 統影響風險減小的治療載體的局部應用(基因轉移和施藥)，而且便於估 定治療策略和醫藥試驗(Helmlinger D， 2002 )。
本發明的發明人開發了 一種在視網膜病的活體動物模型中使用螢光指 示蛋白質(例如綠色焚光蛋白質(GFP))來監測視網膜病狀況的方法， 其中該螢光指示蛋白質耦合到神經自纖維酸性蛋白(GFAP)助催化劑。 GFAP表示為變性的視網膜病，且由此用作與視網膜病的疾病狀況相關聯 的特定生物標記。本活體方法允許更高的形態細節以及對^L網膜病的發展 病理估定和在疾病的療程內的潛在的治療，且由此可用於估定和表徵不同 的疾病階段，包括發作、發展、退行和恢復。本發明在活的動物中活體執行，且由此可在同一動物中在一時間段內執行，在該時間段內，疾病狀況 可能改變。
GFAP主要在CNS的與通過正調節GFAP而在神經膠質增生期間的 損傷處相對應的正常和反應性神經膠質細胞中。在視網膜中，星形膠質細 胞和Mtiller細胞屬於神經膠質細胞類型(Dyer MA, 2000 )，且通常包含 低水平的GFAP。然而，由於應力或損傷，這些細胞顯示出充分的GFAP 產量增加，導致細胞增殖和形狀改變(Milena Kuzmanovic， 2003 )。先前 的研究表明，GFAP可成像在正常的神經膠質細胞以及在固定的組織或離 體的活組織中退化的細胞上(Brenner M, 1994; Blanks JC， 1996a; Cordeiro等人，2004; Morgan J., 2005 )。這裡，本發明的發明人已論證了 ， 包括在一時間段內，在GFAP助催化劑的控制下表示的螢光標記蛋白質可 被用於在具有視網膜變性或具有視網膜病或具有易患視網膜變性或視網膜 病的體質的活的動物中進行活體視網膜成像，以監測視網膜病的疾病狀況。
為了監測神經變性的狀況或發展，本方法在GFAP助催化劑控制之下 利用表示螢光蛋白質(例如GFP)的活的小動物疾病模型。也就是，通過 例如基因或化學技術而具有視網膜病或者具有易發展視網膜病的體質的
GFAP-GFP轉基因動物提供用於活體視網膜成像的活的動物，用以監測視 網膜病或與視網膜病相關的疾病或障礙症，或者用以估定在視網膜病或與 視網膜病相關的疾病或障礙症中的治療的功效或毒性。
這些方法與組織學方法(Sediger等人，2005 )相比的優點在於，在這 樣的系統中隨著時間流逝實時追蹤病理發展而不需要外原染色的簡單性， 該系統可對應於治療或可顯示出進一步的變性。
由此，提供一種監測視網膜病的方法，其包括檢測視網膜的神經^:
(即，Miiller細胞和星形月M細胞)中的螢光蛋白質的螢光水平，所述焚 光蛋白質包括轉基因的非人類的動物的視神經(無髓鞘的許旺氏細胞)， 該動物具有包括視網膜變性的視網膜病或易患視網膜病的體質，並且該轉 基因動物在GFAP助催化劑的控制之下表示螢光蛋白質。
螢光蛋白質的表示是在轉基因動物中的GFAP助催化劑的"控制之下"，意味著GFAP助催化劑可操作地與螢光蛋白質的編碼序列相關聯且 是導引螢光蛋白質編碼序列的轉錄的助催化劑。由此，相對於沒有任何此 種因子的表示，激活或提高從GFAP助催化劑轉錄的因子會導致轉基因動 物中的螢光蛋白質的表示增加，並且抑制或阻礙從GFAP助催化劑轉錄的 因子會導致轉基因動物中的螢光蛋白質的表示減少。通過檢測在轉基因動 物的視網膜神經M細胞中的螢光蛋白質的表示水平，無創傷性地檢測焚 光蛋白質的表示水平。
為了在希望的時間段內監測視網膜病，可以在同一活的動物中，在第 一時刻檢測螢光蛋白質的第一螢光水平，然後在第二時刻檢測螢光蛋白質 的第二螢光水平。可將第二螢光水平與第一螢光水平比較，以估定疾病狀 況的變化。
同樣地，為了固定疾病狀況，可以與負性控制動物才莫型相比地進行對 視網膜病的監測。由此，在GFAP助催化劑的控制之下表示螢光蛋白質但 不具有視網膜病或不具有易患視網膜病的體質的轉基因的非人類的動物可 用於提供與視網膜病無關的視網膜中的蛋白質螢光標準，由此允許比較具 有視網膜病或具有易患視網膜病的體制的動物與不具有這樣的視網膜病或 不具有易患視網膜病的體制的動物中的疾病狀況。
對視網膜病的監測包括在一時間段內追蹤疾病發作、發展、退行和恢 復或者預後，還包括在一時間段內追蹤對治療的反應以及追蹤治療的副作 用(包括毒性)。
所述視網膜病可以是任何視網膜病，包括初級視網膜病和次級視網膜 病，並且可以是在轉基因動物中的疾病或基因條件的結果，或者可以是通 過用神經毒素或i欠射線治療轉基因動物而被化學或輻射誘導的視網膜病， 如下所述。
由此，對視網膜病的監測可包括對螢光蛋白質的焚光水平進行監測和 定量，以估定在任何與視網膜病相關的疾病或障礙症中的視網膜的疾病狀況。
與視網膜病相關的疾病或障礙症是指任何可引起、導致視網膜變性、視網膜神經膠質增生或視網膜病(包括初級視網膜病和次級視網膜病)或 者與視網膜變性、視網膜神經^/貢增生或梘網膜病相關聯的疾病、障礙症 或條件。
視網膜病理包括作為視網膜病或與視網膜病相關的疾病或障礙症的結
果或者與其相關的^L網膜的變性或疾病，且包括^f見網膜神經膠質的變性。 易患視網膜病的體質是指對發展視網膜病的易受性或傾向(包括基因傾向) 的增加的風險。
對視網膜病的監測包括對視網膜神經M^t增生、視網膜變性、或視網 膜病的監測和定量，所述視網膜神經膠質增生、視網膜變性、或涉及神經 組織變性的視網膜病的疾病包括帕金森病和阿爾茨海默氏病病、源於眼 部的初級^L網膜病(包括^L網膜襞裂症、老年性黃斑變性和青光眼)、以 及源於系統疾病的次級視網膜病，所述系統疾病包括糖尿病視網膜病、肝 髒病^L網膜病、腎臟病視網膜病、高血壓、血管病、先天性心臟病、自身 免疫性障礙症(包括風溼性關節炎)、多發性硬化、神經纖維瘤病、萊姆 神經疏螺旋體病、唐氏綜合症、孤獨症、鐮狀細胞貧血、HIV和巨細胞病 毒屬感染、曱狀腺障礙症或肝臟障礙症。
"疾病狀況"是指在具體的時間點在具體的轉基因的非人類的動物中 視網膜病或視網膜變性的程度。疾病狀況包括疾病的階段(包括發作之前 的階段)以及疾病的程度。通過隨著時間流逝追蹤轉基因動物的視網膜神 經膠質中的螢光水平，且將螢光水平的變化與視網膜病相比較和相關聯， 包括與沒有視網膜病或易患視網膜病的體質的轉基因動物相比較，估定疾 病狀況。如上所述，GFAP表示用作4見網膜病的特定的生物標記，由此，
視網膜病的指示器。
非人類的轉基因動物可以是任何動物，包括哺乳動物，包括齧齒動物， 包括鼠。在特定實施例中，非人類的動物為鼠。非人類的動物可以具有這 樣的條件，其中，由於視網膜神經膠質的反應性改變，GFAP表示被提高。 在特定實施例中，該動物對於M突變是同型的，包括具有FVB/N基因背景的鼠。M突變導致由於對PDE6B酶亞組編碼的基因的突變而引起的視 網膜變性表型。
非人類的動物是具有轉基因的轉基因動物，其包含與對螢光蛋白質編 碼的序列可操作相關聯的GFAP助催化劑。以允許通過檢查視網膜而檢測 視網膜神經自細胞中或活的動物中的螢光蛋白質的方式表示轉基因。視 網膜的神經自細胞也被稱為視網膜神經自，包括Mtiller細胞和星形膠 質細胞，且還包括^見神經的無髓鞘的許旺氏細胞。由此，轉基因動物可具 有在被整合到其基因組中的GFAP助催化劑的控制之下對螢光蛋白質編碼 的核酸分子。
在特定實施例中，轉基因包括與對螢光蛋白質編碼的序列可操作地相 關聯的GFAP助催化劑，該螢光蛋白質與多腺苷酸化信號可操作地相關聯。 將理解，轉基因構造將包括允許在GFAP助催化劑的控制之下表示轉基因 動物中的神經膠質細胞內的螢光蛋白質的必要的調整元素。
當以功能關係設置序列時，第 一核酸序列與第二核酸序列可操作地相 連結。例如，如果助催化劑激活編碼序列的轉錄，則編碼序列可操作地鏈 接到該助催化劑。
GFAP助催化劑是任何導？ 1神經膠質纖維酸蛋白質的表示的助催化 劑。在特定實施例中，GFAP助催化劑包括位於人類GFAP基因的側面的 2.2 kb 5'區，如在Zhuo等人，1997和在Brenner等人，1994的文獻中所述。
萸光蛋白質可以是任何這樣的蛋白質，其發螢光，且當通過檢查表示 該蛋白質的活的動物的視網膜而在視網膜神經M"細胞中表示時可視。例 如，螢光蛋白質包括GFP、 GFP S65T、增強的GFP (EGFP) 、 EBFP、 EBFP2 、 Azurite、 mKalamal、 ECFP、 Cemlean、 CyPet、 YFP、 Citrine、 Venus、 或YPet。在特定實施例中，螢光蛋白質是GFP，包括人化的GFP，包括 GFP的S65T突變。人化的蛋白質是指這樣的蛋白質，其中維持氨基, 列，但該胺基酸序列由這樣的編碼序列表示，在該編碼序列中，已通itA 類核糖體關於密碼子的用法對密碼子進行了最優化。
所述轉基因的非人類的動物還具有視網膜病或具有易患視網膜病的體質。如上所述，視網膜病是指與視網膜病有關的視網膜的疾病或障礙症。 由此，轉基因動物具有容易朝向發展初級或次級視網膜病M的基因體質， 或者具有初級或次級視網膜病，或者具有包括視網膜或神經變性的視網膜 病，其可發展為初級或次級視網膜病。
由此，可通過使在GFAP助催化劑的控制之下表示螢光蛋白質的轉基 因動物與提供用於初級或次級視網膜病的基因或分子模型的動物雜交，產 生所述轉基因的非人類的動物，其中提供用於初級或次級視網膜病的基因 或分子模型的動物包括用作用於以下疾病的模型的動物，這些疾病包括神 經組織變性疾病(包括帕金森病和阿爾茨海默氏病)、視網膜襞裂症、青 光眼(包括鼠模型DBA/2J)、糖尿病、肝炎、可導致視網膜病的腎臟障 礙症、高血壓、血管病、心血管病、肺部障礙症、自身免疫性障礙症(包 括風溼性關節炎)、多發性硬化、神經纖維瘤病或曱狀腺障礙症。
可替代地，所述轉基因動物科具有視網膜病或由暴露於化學試劑(例 如神經毒素)而誘導的視網膜病。公知誘導視網膜病理或視網膜病的幾種 神經毒素，包括l-曱基-4-苯基-l，2，3，6-四氫吡啶(MPTP )、紅藻氨酸(KA ) 以及3，3-亞氨基二丙腈(IDPN)。
已確定可由KA誘導的穀氨酸鹽受體相關的神經毒性(Megumi Honjo， 2000a)。由於已證明KA在鼠中誘導正在進行的抽搐以及海馬(CA )神 經元的變性和在剩餘的CA中的超興奮性，KA已被用於才莫擬癲癇症。當 與抗痙攣藥一起緩慢施用時，KA可用於模擬阿爾茨海默氏病(AD) (Olney, 1990 )。 一項這樣的研究表明在向初生的鼠進行KA的腦室內施 加時，可看到海馬錐形神經元的明顯減少(Dong等人，2003) 。 AD是一 種影響海馬和其他邊緣結構(Khachaturian， 1985 )、腦皮層相關區、視覺 皮質且沿著大腦的中心4見覺路徑(Blanks JC， 1996b )的痴呆障礙症。AD 的組織病理學特徵典型地包括神經元損失、神經原纖維纏結、神經炎斑和 粒狀空泡變性(Khachaturian, 1985)。研究表明，AD患者遭受視覺缺陷， 全部緣於在視網膜和中心視覺路徑(Blanks JC， 1996b )中的神經節細胞變 性和視神經病(Blanks等人，1989)。當注射到眼睛的玻璃體中時，KA被證明誘導導致神經元壞死的穀氨酸鹽受體相關的神經毒性，以及在視網膜
的MtiUer細胞中的GFAP的正向調節(Megumi Honjo, 2000b )。
暴露於MPTP會導致黑質密部(SNpc)中的多巴胺能神經元的變性
(Chen等人，2003 )。由於在二十世紀八十年代發現MPTP具有誘導帕金 森病症狀的能力，該神經毒物已被廣泛用於產生用於帕金森病(PD)的疾 病動物模型。特別地，對PD的鼠模擬已被廣泛用於對多巴胺能神經元壞 死的機理的研究以及對實驗性神經元保護治療的研發(Przedborski等人, 2001; Przedborski和Vila, 2001; Bove等人，2005 )。目前，PD被認為是老 化大腦的笫二位最常見的變性性障礙症，其中阿爾茨海默氏病是最常見的。 PD的特徵在於以下症狀靜止時的顫抖、有意運動的遲緩、僵硬以及姿勢 的不穩定性，並且主要歸因於黑質紋狀體多巴胺能路徑的神經元的損失， 導致大腦多巴胺能水平的不足(Marin等人，2005) 。 PD還與視覺系統的 神經元變性相關聯，如在帕金森患者中所觀察到的。相當多的精神軀體和 電生理學證據表明，PD患者的視覺功能紊亂起因於可能在視網膜中的多巴 胺能不足(Bodis-Wollner， 1990; Peters等人，2000 )。系統施加的MPTP 還被證明會影響視網膜中的神經元和神經膠質細胞。在一項這樣的研究中， 在鼠中全身注射MPTP之後 一周內，在內部外部視網膜中觀測到小神經膠 質激活作用。在注射之後幾天神經膠質細胞的GFAP免疫反應性也提高
(Chen等人，2003 )。
1DPN是一種神經毒物，其在對實驗動物施用之後，誘導人類神經障 礙症6Y〃es & /a 7^ /Wte綜合症的症狀。GY〃m & /fl 綜合症的特徵 在於抖動、無意識的肌肉運動和發聲抽搐。動物模型中的神經毒物的突出 的神經學綜合症是"ECC綜合症"(興奮、舞蹈和轉圏運動)(Wakata 等人，2000) 。 IDPN引起神經纖維軸突病，該病的特徵在於在神經元軸突 的近段中以及在有髓鞘的細胞體的核周體中神經絲的積聚(Seoane等人, 1999)。其已證明會沿著暴露的非吸入路徑在嗅黏膜中引起壞疽(Genter 等人，1996)。除了視網膜和小阜的進行性變性和反應性神經膠質增生，在 動物模型的眼睛中還觀測到角膜的暗晦、脈管變化以及視網膜的分離
16(Seoane等人，1999 )。例外的是，星形膠質細胞和Miiller細胞的反應性 神經膠質增生也是與IDPN神經病相關聯的常見特徵。該報導描述了在 FVB/N背景中，在先前建立的GFAP-GFP轉基因鼠模型(Zhuo等人，1997 ) 中對通過三種神經毒物來例證的神經變性的視網膜gliotic響應的無創傷性 成像的方法，該FVB/N背景具有相對高的對神經變性疾病的易感性
(Mineur YS， 2002 )。神經變性是由注射神經毒物而引起的，這些神經毒 物？ 1起神經損傷和如在諸如阿爾茨海默氏病和帕金森病的疾病中所見的臨 床症狀的相同才莫式(Landrigan PJ, 2005; Bezard E, 2006; Novikova L, 2006)。與先前的方法不同，該模型允許在視神經盤和中央視網膜中的星 形神經膠質的進行性和活體可視化。
類似地，可通過將視網膜暴露於輻射而誘導視網膜病理或視網膜病。 例如，可將雷射用於誘導視網膜病，包括青光眼，如在Grozdanic等人，2003 中所述。
用於構造轉基因、轉基因栽體和轉基因動物的方法和技術在本領域中 公知，食寸^口，i口在Sambrook等人的(2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbour Laboratory Press中所述。例如， 可通過在這樣的條件下將轉基因組織注射到鼠受精卵的前核中而產生轉基 因鼠，所述條件允許將轉基因穩定地整合到鼠基因組中。其中GFAP助催 化劑可操作地連結到GFP的編碼序列的轉基因鼠以及這種鼠的產生方法 在美國專利6,501,003和Zhuo等人，1997中已進行了描述。
該方法包括在活的轉基因動物的視網膜中活體檢測螢光蛋白質的螢光 水平，該動物是在GFAP助催化劑的控制之下表示的螢光蛋白質的轉基因 動物，並且該動物具有易患視網膜病的體質或具有視網膜病。
可以使用公知的在完整的細胞中檢測螢光標記物的方法來執行檢測。 例如，如在Zhuo等人，1997和美國專利6,501,003中所述，可4吏用雷射共 焦顯微鏡方法。可使用掃描雷射檢眼鏡檢查方法，例如，採用使用來自點 光源的雷射束的掃描雷射檢眼鏡，並使用光電倍增管來檢測反射光。先前 已描述了對齧齒動物使用掃描雷射檢眼鏡成像的方法(Hossain等人，1998;Khoobehi和Peyman， 1999; Cordeiro等人,2004; Genevois等人，2004; Jaissle等人，2001; Xu等人，2003; Seeliger等人，2005; Paques等人，2006 )， 下面在實例1中闡述這些方法。
檢測包括對螢光蛋白質的螢光水平進行定量以及估定在轉基因動物的 視網膜神經^t中的螢光蛋白質的表示的質量。例如，使用包括檢眼鏡檢 查方法的螢光顯微鏡技術檢測到的螢光圖像可被計算機捕獲，且使用標準 可用的成j象軟體進行定量。可在存在高背景螢光的條件下用於改善信號質 量的方法在共同待審的國際申請IMAGING AVERAGING中進行了描述， 該國際申請要求在2007年5月2日提交的美國臨時申請60/924,162的優先 權。
為了監測疾病發作、疾病發展或疾病退行，可在特定的動物中間隔地 或在一時間段內執行檢測。如上所述，可將在後時刻檢測到的螢光蛋白質 的螢光水平與在前時刻檢測到的螢光水平相比較。並且，可將螢光水平與 在表示焚光蛋白質但不具有視網膜病或不具有易患視網膜病的體質的轉基 因動物中的螢光水平相比較。這樣的檢測允許建立或限定參數，這些參數 包括與特定的視網膜病相關疾病或障礙症相關聯或者與特定的疾病階段相 關聯的細胞或分子改變或事件，產生這樣的方法，所述方法可應用於關於 與視網膜病相關的疾病或障礙症的診斷或預後的臨床情況中。
可選地，可對轉基因動物進行用於與視網膜病相關的疾病或障礙症的 潛在治療，並且可以通過在潛在治療之前、期間或之後的一段潛在治療療 程內檢測螢光蛋白質的螢光水平來執行檢測。
潛在治療可以為任何這樣的治療，該治療被測試其對視網膜病相關的 疾病或障礙症的效果，並且潛在治療可包括食譜安排、受控的環境條件、 或者潛在的治療劑的施用。
由此，檢測還可以在存在或不存在潛在治療的施用的情況下執行，該 潛在治療包括潛在的治療劑，包括藥物、藥劑或生物製劑，允許監測治療 效果和/或潛在治療的神經毒性。
並且，可以在當前描述的方法中施用用於其他疾病、障礙症或條件的
18治療備選，並且監測可以允許判斷用於治療不相關的障礙症的治療劑的神 經毒性。
技術人員熟悉用於這些方法中的對轉基因非人類的動物施加潛在治療 備選的標準實驗室技術和制度。
可以與其他方法聯合使用所描述的方法，這些其他方法包括對轉基因
動物的蛋白質生物學(proteomic)和代謝組學(metabolomic)仿形，由
此提供螢光蛋白質的表示水平與視網膜病相關疾病和障礙症的階段和類型 之間的分子連結以及對這種疾病和障礙症的潛在治療。
並且，根據上述方法，當前預期的是對用於監測視網膜病的轉基因非 人類動物的應用。
本方法和應用通過以下非限制性實例進一 步進行示例。
實例
實例1
在該研究中，用三種神經毒物治療在神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP) 助催化劑的控制之下表示綠色螢光蛋白質(GFP)的轉基因鼠，以引起視 網膜神經膠質增生，這三種神經毒物為l-曱基-4(2，-曱基苯基)-l，2，3，6-四氫 吡咬(2，-CH3-MPTP )、紅藻氨酸(KA )以及3，3-亞氨基二丙腈(IDPN )。 在2周的時間段內使用共焦掃描雷射檢眼鏡(SLO)對進行性視網膜神經 膠質增生進行無創傷性成像，以使視神經盤和中央視網膜的神經膠質中的 GFP螢光的改變可視化。通過對一見網膜整體安裝件(whole-mount)的內 生GFAP的轉基因GFP和免疫組織化學(IHC)著色，神經毒物誘導的 視網膜神經膠質增生得以核實，並與在大腦的其他部分中的神經膠質增生 相關聯，所述其他部分包括黑質密部(SNpc)、紋狀體、海馬和嗅球，它 們分別是MPTP、 KA和IDPN的優選目標。這些發現表明，這裡描述的 在神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和實時螢光成像助催化劑的控制之下 表示綠色螢光蛋白質(GFP)的轉基因鼠中使用視網膜神經膠質增生的方 法是用於直接監測視網膜神經膠質增生以及用於間接預測在大腦中發生的 神經膠質增生的有用的臨床前期工具。材料和方法
4^差效G7^1P-G^屍戚如先前所述對轉基因GFAP-GFP鼠進行繁殖 和基因分型(genotype ) ( Zhuo等人，1997 )。在^f究中使用在FVB/N 背景中的成年鼠(8-10個周大)。由National University of Singapore animal holding unit提供動物管理。包括本研究的實驗協議得到Institutional Animal Care and Use Committee的批准。
y婢經善參;^W:f^在本研究中，使用作為MPTP的更有效相似體的1-甲基-4(2，-甲基苯基)-l,2，3，6-四氫吡啶(2，-CH3-MPTP )來在成年大腦中誘 導神經膠質增生(Abdel-Wahab, 2005 )。試驗化合物2，-CH3-MPTP (M103)、 KA (K0250)和IDPN (317306)購於Sigma-Alddch (St. Louis, MO， USA)。 治療組中的每隻鼠受到4次腹膜內(ip) 2，-CH3-MPTP注射(鹽水中15 mg/kg， ip,每2小時一次)、 一次KA注射(鹽水中25mg/kg， ip)或3 次IDPN注射(500 mg/kg， ip，每天一次)。對於每個神經毒物治療組(n=3 )， 使用鹽水作為用於控制組(n=3)的士某介物。經過14天的時間內執行視網 膜成像。
動浙的黃y務通過用購於Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)的 Avertin (1.5% 2,2,2-三溴乙醇；T48402 )的0.15ml/10g體重量的ip注射麻 醉鼠，並且用一滴0.5%的Cyclogy頓消毒眼藥溶液(鹽酸環噴託酯，Alcon , Puurs, Belgium )擴張其瞳孔。定製的PMMA硬接觸透鏡(來自Cantor & Nissel ( Northamptonshire, UK))用於校正光學像差且用於避免鼠眼睛脫 水。在掃描雷射檢眼鏡成像之前通過眼科專家的仔細檢查排除任何角膜或 晶狀體的不透明性的存在。
々溜談^檢媒鏡"LO，成謬對於這裡所述的工作，採用為用於鼠 而修改的Heidelberg Retina Angiograph (HRA ll)掃描雷射檢眼鏡 (Heidelberg Engineering, Dossenheim, Germany)的第二版。掃描雷射檢目艮 鏡(SLO)是基於用來自點光源的雷射束對眼底的掃描的眼底成像技術， 同時通過光電倍增管檢測反射光。入射和反射光沿共軸路徑。因此，與常 規眼底相機相比，可使更多的光通過小的眼睛。已經公開了對大鼠(Hossain等人，1998; Khoobehi and Peyman, 1999; Cordeiro等人，2004; Genevois等 人，2004 )和鼠(Jaissle等人，2001; Xu等人，2003 )的SLO成像的幾篇報 導，其中最近的研究是(Seeliger等人，2005 )和(Paques等人，2006 )利 用HRA第一版(或HRA I)評估鼠眼底。HRA II特徵為在短波長範圍內 的兩種Argon雷射(488nm和514nm )以及在長波長範圍內的兩種紅外二 才及管雷射器(795nm和830nm ) 。 488nm和795nm雷射器分別用於螢光 素和艇青綠jk管造影術。合適的分別為500nm和800nm的阻擋過濾器不 改變波長地去除反射光，且允許僅僅由經激勵的染料發射的光通過。在光 學解析度為10/im/像素且伴隨三個視場(標稱值為15°、 20。和30°)時最 高清晰度為768x768像素。使用0.25屈光度的步增量，焦距在+12/-12屈 光度的範圍內可調。可使用顯示採集模式(每個圖像48ms至96ms)。在 所關注的任何區域內，可以自動獲取最高為8mm的最大深度的層析圖像 (z-掃描)的疊層。
減辨應整伴安裝伴和f瘦邀織化夢(7好C人在用IXPBS灌注鼠之後， 之後為4%新鮮的低聚甲醛(lxPBS，pH7.4)，提取大腦，並摘除眼睛。 在4。C下將這些眼睛立即固定在4%的低聚甲醛中並隔夜，之後在中線處解 剖這些眼睛，其中剝離晶狀體和玻璃體。然後在沒有脈絡膜和鞏膜且整體 安裝在玻璃載片的條件下解剖視網膜。利用用於螢光的Vectorshield安裝 介質(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA; H1000 )來安裝整 個視網膜。首先在4。C下將大腦固定在4。/。的低聚甲醛中4個小時，然後隔 夜在4"C浸泡在30%的甜味劑中。將處理後的大腦組織插入OTC冷凍介 質中，以在低溫保持器(Leica Microsystems, Nussloch GmbH; CM-3050S ) 上製作切片。與視網膜整體安裝一起將根據Atlas of Mouse Brain (Franklin 和Paxi畫,2001)的海馬(前自畫1.94mm,耳間1.86mm) 、 SNpc (前囪 -3.16mm，耳間0.64mm)和嗅球(前囪4.28mm,耳間8.08mm)的冠狀 凍切片(10/im )用於利用對抗GFAP的兔子多克隆抗體(在1:200的稀釋 液中)的IHC (Dako, Z0334 )。將SNpc和統狀體(前囪0.62mm,耳間 4.42mm)的切片用於利用對抗絡氨酸羥化酶的兔子多克隆抗體(在1:200
21的稀釋液中)的IHC ( TH; Chemicon, CA, USA; Ab- 152 )。在室溫下在 1:100的稀釋溶液中用共輒到Texas-red (Abeam, Ab7088)的山羊IgG對組 織切片上的束繂主抗體染色，並l吏用共焦顯孩支鏡(LSM 510 META, Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena Germany)使其可視化。 結果
洽/L4謬尋的視河處^經^^增i的為、f成謬圖1中示出了在KA 中且經鹽水處理的成年鼠的視網膜成像的代表性實例。從注射神經毒物之 後第1天直到其在第7天達到最大螢光，經神經毒物處理的鼠的視神經盤 顯示出主要在視神經頭的邊緣處GFP螢光的逐漸提高。分析了來自經KA 處理和鹽水處理的成年鼠的視網膜整體安裝件的平鋪圖像。在施用神經毒 物之後的7天，通過經神經毒物處理的鼠的反應性星形膠質細胞體以及視 神經盤和周邊視網膜中的突起的過度生長和增生狀態，可以看出在神經纖 維層(NFL)中具有過表示的轉基因GFP和內生的GFAP的嚴重的神經 月緩增生(圖2)。如在圖3的合併的轉基因GFP和抗-GFAP圖像中的箭 頭所示，,K應性星形膠質細胞的突起和細胞體包膜的神經毒物處理過的 鼠的視網膜血管揭示出網狀分布以及在NFL中星形M細胞與血管之間 的關聯性，表明星形膠質細胞是脈管神經膠質鞘，且是血液-視網膜阻擋的 一部分。有趣地，遠離視神經頭，GFP信號在細胞體和突起中顯著，而 GFAP標示典型地被限制為僅僅在周邊視網膜中的星形的反應性星形膠質 細胞的突起(圖3中的箭頭所示)。圖4示出聚焦在貫穿整體安裝的視網 膜的深度以5/tm的等間距設置的經KA處理和鹽水處理的鼠的一 系列共焦 圖像，表明在經處理的和控制的鼠之間存在GFAP-GFP轉基因表示的定性 差異。圍繞視神經盤的共焦圖像示例出在從約0-15pm處的NFL和神經節 細胞層開始進入內網織層(15-20/mi)的星形膠質細胞體和突起中的神經 膠質增生的程度，此處可以看到來自Miiller細胞的端腳(細胞突起)的 GFP螢光的大量小焦距。用GFAP抗體(紅色)培養且在同一聚焦平面上 與轉基因GFP報告物(reportcr)—起可視化的冷凍大腦切片的IHC著色表 明，KA引起嚴重的反應性神經M增生(即，GFAP和GFP的正向調節)。當與鹽水控制的相同區域比較時，急劇的神經膠質增生顯示出在整個海馬
區(圖5 )，尤其在CA1 (圖6 ) 、 CA3 (圖7 )和齒狀腦回(圖8 )的局部區域中GFP和GFAP表示的極高水平。
洽2'-C好W^^戶//趟的魂風虔禪經^^l蘭的為、"^戎^:對於第二神經毒物2'-CH3-MPTP的情況，視神經盤的螢光分子視網膜成像清楚地表明在施用神經毒物之後24小時時GFP表示的最大增加(圖9 ) 。 GFP螢光最高的區域主要位於視神經盤的存在軸突纖維束和視網膜脈管系統的聚集處的邊緣區域中。為了識別出大腦子區域和顯示神經膠質增生的細胞類型，從用2'-CH3-MPTP或鹽水處理、與轉基因GFP標記物協同地用GFAP抗體(紅色)或TH抗體(紅色)著色的成年鼠的大腦，製備包含SNpc和紋狀體區域的冷凍切片。2'-CH3-MPTP引起GFP增加，並且，在系統施用神經毒物之後僅僅一天時，在受激的星形膠質細胞中存在較低程度的GFAP增加。與經鹽水處理的鼠大腦相比，在神經毒物處理的鼠大腦的黑質(圖10 )中廣泛發生神經膠質增生，在所述腦中對應地標記在SNpc (圖11)中去TH免疫反應性中腦多巴胺能神經元。然而，與紋狀體中的GFP的大幅增長的同時，TH表示水平沒有可檢測得到的改變(圖12)。
由/Z)/W f/趟的視/^^^經^^增4:的分^戎謬為了獲得對用KA和2'-CH3-MPTP得到的觀察的額外支持，在單獨的實驗中使用神經毒物IDPN。與KA情況相似地，1DPN處理的鼠的視神經盤在施用神經毒物之後第7天這一時刻處顯示出GFP螢光的最大提高，而鹽水處理的鼠在2個周的過程期間僅僅顯示出焚光的中度變化(圖13)。在比較鹽水處理和IDPN處理的鼠的嗅球的對應切片時追蹤反應性神經膠質增生的發作，主要在嗅球的小球層(GL)中存在與GFAP免疫反應性細胞共同局域化的顯著更多的GFP正性的星形神經膠質(圖14)。除了圖15中示出的GL中的聚集之外，還存在在粒細胞層(GCL )中存在的GFAP正性細胞的強烈增加。
討論
在鼠中，可利用活體視網膜成像工具的可用性，以在發展和疾病期間對鼠眼內脈管系統(Ritter等人5 2005 )和視神經盤(Bruce E. Cohan, 2003 ) 成像。摧毀性(knockout)轉基因鼠模型還被用於調查視網膜和神經元變 性(Jaissle等，2001; Helmlinger D， 2002 )。在不同組織中過表示 (over-expressing) GFP的在組織專用的助催化劑的控制之下的轉基因鼠 模型可被併入對特定疾病的研究中。例如，使GFP表示的錐體視蛋白助催 化劑(Fd和Hughes, 2001)與疾病模型交叉可被用於研究由隨著時間的流 逝的退行性疾病引起的錐體的損失。類似地，可用GFP標示脈管目標。在 例如平滑肌tv-肌動蛋白助催化劑的控制之下產生GFP的轉基因允許在不 施加染料的條件下使視網膜脈管可視化(Tsai等人，2002 )。在該研究中表 明，用作與hGFP-S65T報告基因相關聯的神經膠質增生病理標記物的 2.2-kb人類GFAP基因助催化劑允許對星形膠質細胞核Miiller細胞行為 進行實時螢光分子成像，這使得能夠在相當長的時間段內對助催化劑活性 進行監測和量化。使用對經神經毒物處理的鼠眼睛的螢光分子成像，可以 活體觀察鼠—見神經盤中的GFP的表示的變化，揭示出有關神經M^增生處 理的重要特徵。
在視網膜和大腦二者中，以與內生的GFAP基因相同的方式調節GFP 轉基因的表示。對三種經神經毒物處理的鼠的分子視網膜成像表明，視神 經盤的星形膠質細胞中的增加的GFP表示的水平明顯足以容易地進行活 體可視化、監測和量化(圖1)。為了證實活體成4象數據，通過IHC檢查 整體安裝的視網膜的轉基因GFP和內生GFAP水平。發現經KA處理 的鼠的整體安裝的視網膜中觀測到的視網膜神經膠質增生與先前公開的研 究相一致，在所述先前^Hf的研究中，在施用KA之後在Miiller細胞和星 形膠質細胞中檢測到增加的GFAP水平(Sahel等人，1991; Megumi Honjo， 2000b)。此外，在像SNpc、紋狀體和嗅球、CA1、 CA3和海馬的齒狀腦 回區域的大腦各種區域中的急劇的神經膠質增生證實了三種神經毒物 (KA、 2'-CH3-MPTP、 IDPN)的作用引起視網膜神經M增生，表明這 裡所述的實時螢光成像方法是用於直接監測視網膜神經膠質增生以及用於 間接預測在大腦中發生的神經膠質增生的有用的臨床前期工具。
24如在該研究中所說明的，本GFAP/GFP報告物系統提供了使視網膜神
經膠質活體可浮見的方法，並且其對損傷的響應代表了對初級和次級視網膜 病的臨岸、前期篩查以及對藥物化合物的功效和神經毒性的評估的實時效 用。使用安裝有廣角物鏡的SLO來以單細胞解析度獲得對周邊視網膜和 Mtiller細胞的分子視網膜成像是可行的。這樣的改進的SLO配置允許分 析視網膜脈管結構的改變和不同來源的視網膜病的模式。特別地，當用例 如磁共振成像(MRI)和正電子發射斷層顯像(PET)的視網膜電圖描記 術(ERG)和3D成像方式補充時，當前的分子視網膜成像方法不僅可用 於檢測視網膜病，還可以用於獲得對藥物化合物的功效和神經毒性的分子 標識，並且可揭示出對深藏在大腦內的疾病區的更精確的實時信息。此外， 通過整合來自分子視網膜成像和納米級的血清生物標記的系統(蛋白質生 物學和代謝組學)仿形的數據，還可以將具有^L網膜病症狀的系統疾病準 確定位到具體的器官(Hood等人，2004 )。
像每一個單獨的出版物或專利申請被具體地和單獨地指出通過參考而^ 皮並 入。任何出版物的引用都用於其在提交日之前的公開內容，且不應由於現物。
如在該說明書和所附權利要求書中所使用的，除非上下文明確地另有 規定，否則單數形式的"一"、"一個"和"該"包括複數範圍。如在該 說明書和所附權利要求書中所使用的，術語"包括"、"包含，，以及這些 術語的其他形式旨在以非限制性包容的方式包括引用的特定要素或組件， 而不排除任何其他要素或組件。除非另有規定，在此所使用的所有科技術 語具有對於本發明所述領域的普通技術人員而言普遍理解的意義相同的意 義。
根據本發明的教導對於本領域普通技術人員而言很明顯地，在不脫離所附 權利要求的精神或範圍的情況下，可以對本發明進行特定的改變和修改。參考文獻
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3權利要求
1.一種監測視網膜病的方法，包括提供活的轉基因的非人類的動物，該動物具有視網膜病或具有易患視網膜病的體質，其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編碼的核酸分子被整合到所述轉基因的非人類的動物的基因組中；以及在所述轉基因的非人類的動物的視網膜神經膠質中在第一時刻活體檢測所述螢光蛋白質的第一螢光水平，並且在第二時刻活體檢測所述螢光蛋白質的第二螢光水平。
2. 根據權利要求l的方法，其中所述轉基因的非人類的動物為鼠。
3. 根據權利要求1或2的方法，其中在檢測之前，將所述轉基因的非 人類的動物暴露於潛在的治療，並且其中監測包括對視網膜病退行、視網 膜病恢復、或者視網膜病發作的延遲的監測。
4. 一種監測視網膜病的方法，包括提供活的第一轉基因的非人類的動物，該動物具有視網膜病或具有易 患視網膜病的體質，其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編碼的 核酸分子被整合到所述第 一轉基因的非人類的動物的基因組中；提供活的第二轉基因的非人類的動物，該動物不具有視網膜病或不具 有易患視網膜病的體質，其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編 碼的核酸分子被整合到所述第二轉基因的非人類的動物的基因組中；以及在所述第一轉基因的非人類的動物的視網膜神經膠質中活體檢測所述 萸光蛋白質的第一螢光水平，並且在所述第二轉基因的非人類的動物的視 網膜神經膠質中活體檢測所述螢光蛋白質的第二螢光水平。
5. 根據權利要求4的方法，其中所述第一轉基因的非人類的動物和所 述第二轉基因的非人類的動物為鼠。
6. 根據權利要求4或5的方法，其中在檢測之前，將所述第一轉基因 的非人類的動物暴露於潛在的治療，並且其中監測包括對視網膜病退行、 視網膜病恢復、或者視網膜病發作的延遲的監測。
7. 根據權利要求6的方法，其中在檢測之前，將所述第二非人類的動 物暴露於所述潛在的治療。
8. 根據權利要求2或5的方法，其中所述鼠具有FBV/N的基因背景。
9. 根據權利要求1至8中任何一項的方法，其中所述GFAP助催化 劑為側接人類GFAP基因的5， 2.2kbase區域。
10. 根據權利要求1至9中任何一項的方法，其中所述螢光蛋白質包 括GFP、 GFP S65T、 EGFP、 EBFP、 EBFP2、 Azurite、 mKalamal、 ECFP、 Cerulean 、 CyPet、 YFP、 Citrine 、 Venus或Ypet。
11. 根據權利要求10的方法，其中所述螢光蛋白質包括GFPS65T。
12. 根據權利要求1至11中任何一項的方法，其中所述視網膜病包括 初級視網膜病或次級視網膜病。
13. 根據權利要求12的方法，其中所述初級視網膜病包括與視網膜襞 裂症、老年性黃斑變性、或青光眼相關的視網膜病。
14. 根據權利要求12的方法，其中所述次級視網膜病包括以下相關的 視網膜病帕金森病、阿爾茨海默氏病、糖尿病視網膜病、肝臟病視網膜 病、腎臟病視網膜病、高血壓、血管病、先天性心臟病、風溼性關節炎、 多發性硬化、神經纖維瘤病、萊姆神經疏螺旋體病、唐氏綜合症、孤獨症、 鐮狀細胞貧血、HIV感染、巨細胞病毒屬感染、曱狀腺障礙症或肝臟障礙 症。
15. 根據權利要求1至14中任何一項的方法，其中所述視網膜病或易 患視網膜病的體質是遺傳的。
16. 根據權利要求1至14中任何一項的方法，其中所述視網膜病是輻 射誘導的。
17. 根據權利要求1至14中任何一項的方法，其中所述視網膜病是化 學誘導的。
18. 根據權利要求17的方法，其中所述視網膜病是由l-甲基-4-苯基 -l,2，3,6-四氫吡咬、紅藻氨酸或3,3-亞氨基二丙腈誘導的。
19. 根據權利要求1至18中任何一項的方法，其中檢測包括掃描雷射檢眼鏡檢查方法。
20. 根據權利要求1至19中任何一項的方法，其中間隔地或在一時間 段內執行檢測，以監測視網膜病發作、視網膜病發展、視網膜病退行、視 網膜病恢復或視網膜病預後。
21. 根據權利要求1至20中任何一項的方法，其中監測包括對潛在的 治療劑的治療效果的監測。
22. 根據權利要求1至20中任何一項的方法，其中監測包括對潛在的 治療劑的神經毒性的監測。
全文摘要
本發明提供一種在活的轉基因的非人類的動物中監測視網膜病的方法，該方法包括提供活的轉基因的非人類的動物，該動物具有視網膜病或具有易患視網膜病的體質，其中在GFAP助催化劑的控制下對螢光蛋白質編碼的核酸分子被整合到所述轉基因的非人類的動物的基因組中；以及在所述轉基因的非人類的動物的視網膜神經膠質中活體檢測所述螢光蛋白質的螢光水平。
文檔編號G01N33/48GK101688858SQ200880022995
公開日2010年3月31日 申請日期2008年5月2日 優先權日2007年5月2日
發明者G·何, L·卓, S·庫馬爾 申請人:新加坡科技研究局