用於檢測乳腺癌易感基因snp的引物、螢光探針及應用的製作方法
2023-05-12 00:18:56 1
用於檢測乳腺癌易感基因snp的引物、螢光探針及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於檢測乳腺癌易感基因SNP的引物、螢光探針及應用。所提供引物及對應的螢光探針組，分別針對rs1219648、rs13281615、rs2046210、rs3803662、rs8051542、rs3817198和rs889312進行快速基因分型，應用本發明獲得的檢測結果精確可靠，且成本較低，具有較好的實用性，特別適用於中國地區乳腺癌高危人群的大規模篩查。
【專利說明】用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物、螢光探針及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體地指一種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物、 螢光探針及應用。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是全世界女性最常見的癌症之一，在中國女性癌症中發病率更是高居首 位。根據衛生部發布的數據來看，我國乳腺癌的發病率仍有上升趨勢。而在美國等發達國 家，乳腺癌的發病率和死亡率卻在不斷下降，這不僅是因為診斷和治療水平的提高，更重要 的是採取了早期篩查。乳腺癌的常見篩查包括自我檢查、B超檢查、X射線檢查等。這些檢 查方法都是建立在乳腺癌已經發生的基礎上，如果能在乳腺癌還沒發生之前進行篩查，找 出乳腺癌高危人群，可以極大程度的減少乳腺癌的發生和死亡，例如腫瘤標誌物檢測和乳 腺癌易感基因檢測。
[0003] 大量科學研究表明，某些基因的基因狀態與乳腺癌的發生密切相關，這些基因叫 做易感基因，例如BRCA基因，該基因變異的人群患乳腺癌的概率為87%，而正常人群患乳 腺癌的概率為12%。BRCA基因的變異能顯著增加乳腺癌的患病概率，因此通過檢測BRCA 基因的基因狀態能夠找出乳腺癌的高危人群，然後針對性的進行預防。好萊塢明星安吉麗 娜?朱莉檢測到自己BRCA基因變異後，通過切除乳腺的方法將乳腺癌的患病概率由87%降 到5%。
[0004] BRCA基因在白人特別是猶太人中變異較多，而在中國人群中變異非常少，不適合 於在中國人群中進行乳腺癌高危人群的篩查。上海瑞金醫院鄭偉教授發現 ESR1基因以及 其他基因與中國女性乳腺癌患病概率顯著相關，而且在中國人群中變異頻率較高，更適合 在中國人群中做乳腺癌高危人群的篩查。
[0005] 檢測易感基因的常見方法有限制性酶切法、多重PCR、測序、晶片檢測和螢光定量 PCR。目前最簡單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過應用特異性限制性內切酶消化PCR 擴增產物,並根據消化位點是否消失來判斷其變異存在與否。但該方法操作複雜，樣本量多 時易造成PCR產物的交叉汙染且容易出現酶切不充分或酶切過度而出現假陰性或假陽性 結果，可靠性低。多重PCR方法儘管特異性有所提高，但是這種方法的原理仍然是基於普通 PCR的原理，低引物特異性以及低保真Taq酶等這些因素均可造成對結果的影響。DNA測序 法雖然是目前進行基因診斷的金標準，但步驟繁瑣，過程複雜，試劑價格昂貴，容易出現樣 本間的交叉汙染而導致測序失敗；另外測序儀的裝備也超出了一般臨床檢驗實驗室的承受 範圍。晶片檢測更適合高通量基因檢測，不適合幾個基因的檢測。而螢光定量PCR中的高 解析度熔解曲線法是一種快速，簡便，經濟，實用的分型方法，但基因分型依賴於儀器溫度 控制的精密性，假陽性高。螢光定量PCR中的Taqman探針的方法採用特異性的螢光標記的 探針，特異性強，靈敏度高且操作方便，快速。該方法同樣被認為是SNP分型的金標準，在臨 床應用的前景值得期待。其基本原理是：應用一對雙螢光標記的Taqman探針，分別針對雙 等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探針擴增出各自的基因型；用兩種螢光染料FAM， HEX (VIC)分別標記這兩種探針，就可以在一次PCR反應中完成對單個SNP位點的基因型判 定。所以該方法中引物長度，探針長度，引物特異性，探針特異性對檢測結果的特異性和敏 感性非常重要。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在於提供一種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物、螢光探針及應 用。
[0007] 為實現上述目的，本發明提供的第一組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以 下簡稱第一組引物），所述引物為如下引物對：
[0008] (1)正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0009] 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0010] (2)由正向引物F-01或反向引物R-01的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0011] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含 rsl219648SNP 位點。
[0012] 本發明還提供了一組與第一組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第一組探 針），所述螢光探針包括如下兩條：
[0013] 1-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示；
[0014] 1-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0015] 所述卜A探針及1-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 1-A探針的5'端報告基團與1-G探針的5'端報告基團不同。
[0016] 其中，5' 端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R〇X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的突光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限於上述基團。
[0017] 優選地，5'端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0018] 本發明還提供上述第一組引物和/或第一組探針在製備rsl219648SNP位點多態 性的檢測試劑盒中的應用。
[0019] 本發明提供的第二組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下簡稱第二組引 物），所述引物為如下引物對：
[0020] (1)正向引物F-02,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示；
[0021] 反向引物R-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0022] (2)由正向引物F-02或反向引物R-02的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0023] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含rsl32 81615 位點。
[0024] 本發明還提供了一組與第二組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第二組探 針），所述突光探針包括如下兩條：
[0025] 2-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示；
[0026] 2-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；
[0027] 所述2-A探針及2-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 2~A探針的5'端報告基團與2-G探針的5'端報告基團不冋。
[0028] 其中，5' 端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限於上述基團。
[0029] 優選地，5'端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0030] 本發明還提供上述第二組引物和/或第二組探針在製備rsl3281615SNP位點多態 性的檢測試劑盒中的應用。
[0031] 本發明提供的第三組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下簡稱第三組引 物），所述引物為如下引物對： >
[0032] (1)正向引物F-03,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示；
[0033] 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示；
[0034] (2)由正向引物F-03或反向引物R_〇3的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0035] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含 rs2046210SNP 位點。
[0036] 本發明還提供了一組與第三組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第三組探 針），所述螢光探針包括如下兩條：
[0037] 3-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 11所示；
[0038] 3-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO· 12所示；
[0039] 所述3-A探針及3-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 3-A探針的5'端報告基團與3-G探針的5'端報告基團不同。
[0040] 其中，5,端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R〇X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限於上述基團。
[0041] 優選地，5'端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0042] 本發明還提供上述第三組引物和/或第三組探針在製備rs2046210SNP位點多態 性的檢測試劑盒中的應用。
[0043] 本發明提供的第四組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下簡稱第四組引 物），所述引物為如下引物對：
[0044] (1)正向引物F-04,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 13所示；
[0045] 反向引物R-04,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 14所示；
[0046] (2)由正向引物F-04或反向引物R-〇4的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0047] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含 rs3803662SNP 位點。
[0048] 本發明還提供了一組與第四組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第四組探 針），所述螢光探針包括如下兩條：
[0049] 4-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0· 15所示；
[0050] 4-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；
[0051] 所述4-A探針及4-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 4- A探針的5,端報告基團與4-G探針的5'端報告基團不同。
[0052] 其中，5,端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限於上述基團。
[0053] 優選地,5'端標記的報告基團為FAM或VIC, 3'端標記的災光淬滅基團為MGB。
[0054] 本發明還提供上述第四組引物和/或第四組探針在製備rs3803662SNP位點多態 性的檢測試劑盒中的應用。
[0055] 本發明提供的第五組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下簡稱第五組引 物），所述引物為如下引物對： _
[0056] (1)正向引物F-05,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 17所示；
[0057] 反向引物R-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；
[0058] (2)由正向引物F-05或反向引物R-05的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0059] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含 rs8051542SNP 位點。
[0060] 本發明還提供了一組與第五組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第五組探 針），所述螢光探針包括如下兩條：
[0061] 5-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 19所示；
[0062] 5-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示；
[0063] 所述5-A探針及5-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有焚光泮滅基團，且 5- A探針的5'端報告基團與5-G探針的5'端報告基團不同。
[0064] 其中，5,端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限於上述基團。
[0065] 優選地，5'端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0066] 本發明還提供上述第五組引物和/或第五組探針在製備rs8051542SNP位點多態 性的檢測試劑盒中的應用。
[0067] 本發明提供的第六組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下簡稱第六組引 物），所述引物為如下引物對：
[0068] (1)正向引物F-06,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 21所示；
[0069] 反向引物R-06,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 22所示；
[0070] (2)由正向引物F-06或反向引物R_〇6的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0071] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含 rs3817198SNP 位點。
[0072] 本發明還提供了一組與第六組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第六組探 針），所述螢光探針包括如下兩條：
[0073] 6-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν〇· 23所不；
[0074] 6-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示；
[0075] 所述6-A探針及6-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 6- a探針的5,端報告基團與6-G探針的5'端報告基團不同。
[0076]其中，5,端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、J 〇E、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限於上述基團。
[0077] 優選地，5,端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0078] 本發明還提供上述第六組引物和/或第六組探針在製備rs3817198SNP位點多態 性的檢測試劑盒中的應用。
[0079] 本發明提供的第七組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下簡稱第七組引 物），所述引物為如下引物對： _
[0080] (1)正向引物F-07,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 25所示；
[0081] 反向引物R-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示；
[0082] (2)由正向引物F-07或反向引物R-〇7的核苷酸序列經增力P、缺失或替換單個核苷 酸得到的引物；
[0083] 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含 rs889312SNP 位點。
[0084] 本發明還提供了一組與第七組引物配合使用的螢光探針（以下簡稱第七組探 針），所述螢光探針包括如下兩條：
[0085] 7-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 27所示；
[0086] 7-C探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 28所示；
[0087] 所述7-A探針及7-C探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有勞光萍滅基團，且 7- A探針的5'端報告基團與7-C探針的5'端報告基團不同。
[0088] 其中，5' 端標記的報告基團可選自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R〇X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限於上述基團。
[0089] 優選地，5'端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0090] 本發明還提供上述第七組引物和/或第七組探針在製備rs889312SNP位點多態性 的檢測試劑盒中的應用。
[0091] 本發明提供的第八組用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物組（以下簡稱第八組引 物），所述引物組包括上述第一至第七組引物：
[0092] 1)正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0093] 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0094] 2)正向引物F-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
[0095] 反向引物R-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0096] 3)正向引物F-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
[0097] 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 10所示；
[0098] 4)正向引物F-04,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 13所示；
[0099] 反向引物R-04,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示；
[0100] 5)正向引物F-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO· 17所示；
[0101] 反向引物R-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；
[0102] 6)正向引物F-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO· 21所示；
[0103] 反向引物R-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示；
[0104] 7)正向引物F-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO· 25所示；
[0105] 反向引物R-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
[0106] 本發明還提供了一組與上述第八組引物配合使用的螢光探針組（以下簡稱第八 組螢光探針），所述螢光探針組包括如下探針： _
[0107] 1) 1-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示；
[0108] 1-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 4所示；
[0109] 2)2-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 7所示；
[0110] 2-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 8所示匕
[0111] 3) 3-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 11 f示；
[0112] 3-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 12所示上
[0113] 4)4-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· I5 示；
[0114] 4-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 16所示上
[0115] 5) 5-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 19 f示；
[0116] 5-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 20所示上
[0117] 6) 6-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν〇· 23所示；
[0118] 6-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID N0.24所示上
[0119] 7) 7-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν〇· 27所示；
[0120] 7-C探針，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0. 28所示； 一
[0121] 所述1-Α探針及1-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 1- A探針的5,端報告基團與1-G探針的5'端報告基團不同；一
[0122] 所述2-A探針及2-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 2- A探針的5,端報告基團與2-G探針的5'端報告基團不同；
[0123] 所述3-A探針及3-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有突光泮滅基團，且 3- A探針的5,端報告基團與3-G探針的5'端報告基團不同；
[0124] 所述4-A探針及4-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有勞光泮滅基團，且 4- A探針的5,端報告基團與4-G探針的5'端報告基團不同；
[0125] 所述5-A探針及5-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標i己有·勞光泮滅基團，且 5- A探針的5,端報告基團與5-G探針的5'端報告基團不同；一
[0126] 所述6-A探針及6-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且 6- A探針的5,端報告基團與6-G探針的5'端報告基團不同；
[0127] 所述7-A探針及7-C探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有勞光泮滅基團，且 7- A撕的5,端報告細與74探雜5'端報告基團不同。 「01281苴中，5,端標記的報告基團可選自： ^ ^ p，且不限於上述基團；3'端標記的螢光淬滅基團可選自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限於上述基團。
[0129] 優選地，5'端標記的報告基團為FAM或VIC，3'端標記的螢光淬滅基團為MGB。
[0130] 本發明還提供了一種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的螢光定量PCR試劑盒，包括 Taq酶、dNTPs、Mgcl2、10XPCR buffer、R0X參比螢光、超純水及及第八組引物、第八組螢光 探針。需要說明的是，關於上述各個試劑、引物、螢光探針的用量，以及PCR的時間、溫度參 數設置均為常用技術手段，是本領域技術人員可以根據實際情況來調整的，不用以限制本 發明。PCR buffer為市售產品。
[0131] 此外，本發明雖然只提供了包括第一組至第七組引物及對應螢光探針聯用的組 合，但是第一組至第七組引物中任意幾種的組合及應用，或與對應螢光探針的聯用也應該 視為本發明的保護範圍。
[0132] 本發明還提供了一種檢測乳腺癌易感基因 SNP多態性的方法，該方法是利用第八 組引物、第八組螢光探針，針對人基因組DNA進行螢光定量PCR反應，根據反應過程產生的 螢光信號區分相應SNP位點的多態性。
[0133] 上述引物、螢光探針可以應用於華法林個體化用藥的相關檢測中。
[0134] 本發明能快速精確進行乳腺癌易感基因 SNP位點基因分型，通過提取人的唾 液或外周血白細胞基因組DNA，採用Taqman探針的方法，可在一次檢測中測定受試者的 rsl219648、rsl3281615、rs2046210、rs3803662、rs8051542、rs3817198 和 rs889312 七個 SNP位點的基因型。TaqMan探針技術的原理主要是，在TaqMan探針法的PCR反應體系中， 包括一對PCR引物和一對探針。探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。 探針的5'端標記有報告基因，3'端標記有螢光淬滅基團，當探針完整的時候，報告基因所發 射的螢光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號，隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程 中遇到與模板結合的探針，其3'_5'外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基 團，其能量不能被吸收，即產生螢光信號。用兩種不同螢光染料（如FAM，HEX、VIC)分別標 記這一對探針，針對雙等位SNP的不同基因型，就可以在一次PCR反應中完成對單個SNP位 點的基因型判定。在該方法中引物長度，探針長度，引物特異性，探針特異性對檢測結果的 特異性和敏感性非常重要，所以需要合理的設計引物及多次科學驗證才能得到較好的引物 及探針。
[0135] 本發明的有益效果：提供了一種快捷的乳腺癌易感基因 SNP的分型試劑及應用， 本發明設計了特異性引物和探針，並優化了反應體系和反應組分濃度，能夠準確地對目的 基因進行基因分型。應用本發明獲得的檢測結果精確可靠，且成本較低，具有較好的實用 性。特別適用於中國地區乳腺癌高危人群的大規模篩查。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0136] 圖1為本發明實施例中SNP分型結果rsl219648AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0137] 圖2為本發明實施例中SNP分型結果rsl219648AG基因型的PCR螢光分析圖；
[0138] 圖3為本發明實施例中SNP分型結果rsl219648GG基因型的PCR螢光分析圖；
[0139] 圖4為本發明實施例中SNP分型結果rsl3281615AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0140] 圖5為本發明實施例中SNP分型結果rsl3281615AG基因型的PCR螢光分析圖；
[0141] 圖6為本發明實施例中SNP分型結果rsl3281615GG基因型的PCR螢光分析圖；
[0142] 圖7為本發明實施例中SNP分型結果rs2〇46210AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0143] 圖8為本發明實施例中SNP分型結果rs2〇46210AG基因型的PCR螢光分析圖；
[0144] 圖9為本發明實施例中SNP分型結果rs2〇46210GG基因型的PCR螢光分析圖；
[0145] 圖10為本發明實施例中SNP分型結果rs38〇3662AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0146] 圖11為本發明實施例中SNP分型結果rs38〇3662AG基因型的PCR螢光分析圖；
[0147] 圖12為本發明實施例中SNP分型結果rs38〇3662GG基因型的PCR螢光分析圖；
[0148] 圖13為本發明實施例中SNP分型結果rs8〇5l 542AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0149] 圖14為本發明實施例中SNP分型結果rs8〇5l 542AG基因型的PCR螢光分析圖；
[0150] 圖15為本發明實施例中SNP分型結果rs8〇5l 542GG基因型的PCR螢光分析圖；
[0151] 圖16為本發明實施例中SNP分型結果rs38m98AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0152] 圖17為本發明實施例中SNP分型結果rs38m98AG基因型的PCR螢光分析圖；
[0153] 圖18為本發明實施例中SNP分型結果rs8893l2AA基因型的PCR螢光分析圖；
[0154] 圖19為本發明實施例中SNP分型結果rs8893l2AC基因型的PCR螢光分析圖；
[0155] 圖20為本發明實施例中SNP分型結果rs8893l2CC基因型的PCR螢光分析圖；
[0156] 圖21為本發明實施例中測序結果的類型圖。
【具體實施方式】
[0157] 以下結合附圖和具體實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0158] 實施例
[0159] 1、準備如下分別針對 rsl219648、rsl328l6l5、rs 2〇46210、rs3803662、rs8051542、 rs3817198和rs889312 SNP位點的引物和螢光探針：
[0160] 引物組：
[0161] 1)正向引物 F-01 :5 ' -GGAGTMATTACACATTCAG-3 '
[0162] 反向引物 R-01 :5 ' -TGTGGTAGCTGACTTCTATT-3 '
[0163] 2)正向引物 F-02 :5 ' -TGGMCTAAGTAGTCACAA-3，
[0164] 反向引物 R-02 :5 ' -TATMCATCAGCAGCATTC-3 '
[0165] 3)正向引物 F-03 :5 ' -CACCTCCACCTCCTAAAG-3 '
[0166] 反向引物 R-03 :5 ' -GGCMCAGMCMGACTC-3 '
[0167] 4)正向引物 F-04 :5 ' -TGTCATCCAAAGCACCMCTAT-3 '
[0168] 反向引物 R-04 :5 ' -CAGCAGGAGGGGCCCCTGGTGT-3，
[0169] 5)正向引物 F-05 :5 ' -MCATTGTCATTCCCAGT-3 '
[0170] 反向引物 R-05 :5 ' -CCTMTCGTGCTCTCATT-3 '
[0171] 6)正向引物 F-06 :5 ' -MGGGTCGCTGGCTACAAAG-3 '
[0172] 反向引物 R-06 :5 ' -CATGGCAGTGTTTCACAGGGT-3 '
[0173] 7)正向引物 F-07 :5 ' -TTATAAGAACACCAGTCATG-3 '
[0174] 反向引物 R-07 :5 ' -TTCCTAACACTCAGTACC-3 '
[0175] 探針組：
[0176] 1) 1-A 探針：FAM-ACTTGACACACACTCTTCAAGGA-MGB
[0177] 1-G 探針：VIC-ACTTGACACACeCTCTTCAAGGA-MGB
[0178] 2) 2-A 探針：FAM-TTCTGCCTMGGMTTCACTTCTG-MGB
[0179] 2-G 探針：VIC-TTCTGCCTAAGGQATTCACTTCTG-MGB
[0180] 3) 3-A 探針：FAM-ACAGGCGTGAACCACTGC-MGB
[0181] 3-G 探針：VIC-ACAGGCGTGAeCCACTGC-MGB
[0182] 4) 4-A 探針：FAM-TATAGCTGTCACTTAGCGAAGAA-MGB
[0183] 4-G 探針：VIC-TATAGCTGTC￡CTTAGCGAAGAA-MGB
[0184] 5) 5-A 探針：FAM-GTTATTAGAGGAAGCAGCACTAT-MGB
[0185] 5-G 探針：VIC-GTTATTAGAGGA￡GCAGCACTAT-MGB
[0186] 6) 6-A 探針：FAM-TCAAACTCTCAGCTCATTTCACT-MGB
[0187] 6-G 探針：VIC-TCAAACTCTCgGCTCATTTCACT-MGB
[0188] 7) 7-A 探針：FAM-TGACCTCATTTTACCTTAATTACCT-MGB
[0189] 7-C 探針：VIC-TGACCTCATTTTSCCTTAATTACCT-MGB
[0190] 將上述7組引物分別與對應的探針製備成混合液，混合液中引物濃度為18 μ mol/ L，螢光探針濃度為5μηιο?Α。
[0191] 2、準備PCR擴增體系：
[0192] 預備100個受檢查人的DNA樣本，並對每個DNA分別加入7組引物和探針的混合 液做7個PCR反應，來分別對每個SNP進行分型，所需試劑包括Taqman Genotyping Master Mix 5ul、ddH20 3. 5μ1、螢光探針和引物混合液0. 5μ1，其餘為20ng/ul的受檢查人DNA 樣本1 μ 1,總體積10 μ 1。
[0193] 3、PCR擴增程序：
[0194] PCR 反應第一步：60°C、30s ;
[0195] PCR 反應第二步：95°C、10min ;
[0196] PCR 反應第三步：92°C、15s ;
[0197] PCR 反應第四步：60°C、90s ;
[0198] PCR反應第五步：循環第三步、第四步50次，然後60°C、30s。採用ABI St印one熒 光定量PCR儀（Applied Biosystems，美國應用生物技術有限公司）。
[0199] 4、實驗結果：
[0200] PCR反應結束後，應用 Stepone software V2. 1 (Applied Biosystems，美國應用生 物技術有限公司）進行分析，將得到的100例結果進行分類，其結果類型如圖1?20所示， 依據本發明的探針共分辨出20種基因型：SNP rsl219648三種基因型；SNP rsl3281615三 種基因型；SNP rs2〇46210三種基因型；SNP rs38〇3662三種基因型；SNP rs8051542三種基 因型；SNP rs38m98二種基因型（由於SNP rs38l7l98 C/C基因型佔0.80%,出現機率很 低，未檢測到樣本）；SNP rs889312三種基因型。
[0201] 5、試劑盒的準確性分析
[0202]為驗證試劑盒檢測的準確性，對100例樣本進行測序驗證。
[0203] SNP rsl219648 A/A基因型有38例，A/G基因型有47例，G/G基因型為15例； [0204] SNP rsl328l615 G/G基因型為32例，A/G基因型有49例，A/A基因型有19例； [0205] SNP rs2046210 G/G基因型42例，A/G基因型46例，A/A基因型12例；
[0206] SNP rs3803662 A/A基因型為47例，A/G基因型有43例，G/G基因型有10例；
[0207] SNP rs8051542 A/A基因型有67例，A/G基因型有30例，G/G基因型3例；
[0208] SNP rs3817198 A/A 基因型 83 例，A/G 基因型 17 例；
[0209] SNP rs889312 C/C基因型25例，A/C基因型50例，A/A基因型25例。試劑盒檢 測的準確性達到了 100%。測序結果的類型如圖21所示。
【權利要求】
1. 一種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物、螢光探針及應用乳腺癌易感基因 SNP的 引物，所述引物為如下引物對： (1) 正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； (2) 由正向引物F-01或反向引物R-01的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷酸得 到的引物； 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含rsl219648SNP 位點。
2. -種與權利要求1所述用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物配合使用的螢光探針， 所述螢光探針包括如下兩條： 1-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； 1-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示； 所述1-A探針及1-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且1-A 探針的5'端報告基團與1-G探針的5'端報告基團不同。
3. 權利要求1所述引物和/或權利要求2所述螢光探針在製備rsl219648SNP位點多 態性的檢測試劑盒中的應用。
4. 一種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物，所述引物為如下引物對： ⑴正向引物F-03，其核苷酸序列如SEQIDN0.9所示； 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示； (2)由正向引物F-03或反向引物R-03的核苷酸序列經增加、缺失或替換單個核苷酸得 到的引物； 上述引物以人基因組DNA或DNA片段為模板擴增所得DNA片段均包含rs2046210SNP 位點。
5. -種與權利要求4所述用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物配合使用的螢光探針， 所述螢光探針包括如下兩條： 3-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示； 3-G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示； 所述3-A探針及3-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且3-A 探針的5'端報告基團與3-G探針的5'端報告基團不同。
6. 權利要求4所述引物和/或權利要求5所述螢光探針在製備rs2046210SNP位點多 態性的檢測試劑盒中的應用。
7. -種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物組，所述引物組包括如下引物對： 1) 正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； 2) 正向引物F-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示； 反向引物R-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示； 3) 正向引物F-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示； 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示； 4) 正向引物F-04,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示； 反向引物R-04,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示； 5) 正向引物F-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示； 反向引物R-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示； 6) 正向引物F-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示； 反向引物R-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示； 7) 正向引物F-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 25所示； 反向引物R-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
8. -種與權利要求7所述用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的引物配合使用的螢光探針 組，所述突光探針組包括如下探針： 1) 1-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； 1- G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示； 2) 2-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示； 2- G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示； 3) 3-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示； 3- G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示； 4) 4-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示； 4- G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示； 5) 5-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示； 5- G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示； 6) 6-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 23所示； 6- G探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示； 7) 7-A探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 27所示； 7- C探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 28所示； 所述1-A探針及1-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且1-A 探針的5'端報告基團與1-G探針的5'端報告基團不同； 所述2-A探針及2-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且2-A 探針的5'端報告基團與2-G探針的5'端報告基團不同； 所述3-A探針及3-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且3-A 探針的5'端報告基團與3-G探針的5'端報告基團不同； 所述4-A探針及4-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且4-A 探針的5'端報告基團與4-G探針的5'端報告基團不同； 所述5-A探針及5-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且5-A 探針的5'端報告基團與5-G探針的5'端報告基團不同； 所述6-A探針及6-G探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且6-A 探針的5'端報告基團與6-G探針的5'端報告基團不同； 所述7-A探針及7-C探針的5'端標記有報告基團，3'端標記有螢光淬滅基團，且7-A 探針的5'端報告基團與7-C探針的5'端報告基團不同。
9. 一種用於檢測乳腺癌易感基因 SNP的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於：包括Taq 酶、dNTPs、Mgcl2、10XPCR buffer、ROX參比螢光、超純水及權利要求7所述的引物組、權利 要求8所述的螢光探針組。
10. -種檢測乳腺癌易感基因 SNP多態性的方法，其特徵在於：該方法包括利用權利要 求7所述的引物組、權利要求8所述的螢光探針組針對人基因組DNA進行螢光定量PCR反 應，根據反應過程產生的螢光信號區分相應SNP位點的多態性。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232774SQ201410478348
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】徐謀勝, 黃淑君, 袁雅燕, 餘亞軍, 曹暘 申請人:湖北維達健基因技術有限公司