重組改良安卡拉痘苗病毒及其應用的製作方法

2023-05-11 21:47:11 2

專利名稱：重組改良安卡拉痘苗病毒及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及從改良安卡拉痘苗病毒(MVA)衍生的重組痘苗病毒及其包含且能夠表達插入到MVA染色體上天然缺失位點上的外源基因；涉及使用這類重組MVA病毒產生多肽，例如抗原或治療劑，或產生用於基因治療的病毒載體，以及使用這類編碼抗原的重組MVA病毒作為疫苗。
本發明的目的之一是提供一種重組MVA病毒，它可作為有效且特別安全的表達載體。
本發明的另一種目的是提供一種簡單、有效、安全的方法產生多肽，例如抗原或治療劑，產生重組病毒用作疫苗以及產生病毒載體用於基因治療。
本發明的再一種目的是提供一種基於表達T7RNA聚合酶的重組MVA病毒的表達系統，以及基於此表達系統產生多肽，例如抗原或治療藥劑，或產生病毒載體用於基因治療或用作疫苗。
背景技術：
痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒屬的一員，曾用作活疫苗免疫人天花病。世界範圍用痘苗病毒成功的接種最終導致天花病因-天花病毒的絕跡[天花的全球絕跡。全球天花絕跡鑑定委員會的最後報告。公共衛生歷史，第4號(History of Public Health，No.4)，日內瓦世界衛生組織，1980]。因而世界衛生組織(WHO)宣告，除了有高度危險痘病毒感染的人群(例如實驗室人員)外，已全世界性地停止接種。
最近，痘苗病毒也已用於設計病毒載體，以進行重組基因表達和可能用作重組活疫苗[Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.[1982美國國家科學院院報(P.N.A.S.USA)79，7415-7419；Smith，G.L.，Mackett，M.和Moss，B. 生物技術和遺傳工程評論2(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews2)，383-407]。這必然伴有在DNA重組技術幫助下把編碼外源抗原的DNA序列(基因)引入痘苗病毒基因組。如果基因整合到病毒DNA中對病毒生活周期非必需的位點，可能新產生的重組痘苗病毒是感染性的，即能夠感染外源細胞並從而表達整合的DNA序列[歐洲專利申請83,286號和110,385號(EP Patent Applications No.83,286 and No.110,385)]。用這種方法製備的重組痘苗病毒一方面可用作活疫苗預防傳染性疾病，另一方面可用於在真核細胞中製備異源蛋白質。
表達噬菌體T7 RNA聚合酶基因的重組痘苗病毒可以建立廣泛應用的表達系統以用於在哺乳動物細胞中合成重組蛋白(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，Mizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R. 自然(Nature)348，91-92.)。在所有方案中，重組基因表達依賴於真核細胞細胞質中T7 RNA聚合酶的合成。最普遍的一種方案是用於瞬時表達(Fuerst，T.R.，Niles，E.G.，Studier，F.W.和Moss，B. 美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.)Sci.USA 83，8122-8126和美國專利申請(US patent application)7.648.971)。首先，一種感興趣的外源基因插入質粒並在T7 RNA聚合聚啟動子控制之下。隨後，質粒引入到細胞的原生質體中，該細胞通過標準轉染方法由產生T7 RNA聚合酶的重組痘苗病毒預先感染。
此轉染方案非常簡單因為不需構建新的重組病毒並且特別有效，有超過80％的細胞表達感興趣的基因[Elroy-Stein，O.和Moss，B. 美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87，6743-6747]。痘苗病毒/T7RNA聚合酶雜合系統比其它瞬時表達系統的優勢很可能在於它不依賴於質粒到細胞核的轉運。在過去，該系統在病毒學和細胞生物學中對檢測目的是極其有用的(Bunocore，L.和Rose，J.K. 自然(Nature)345，625-628，Pattnaik，A.K.和Wertz，GW. 美國國家科學院院報(Proc Natl.Acad.Sci.USA)88，1379-1383，Karschin，A.，Aiyar，J.，Gouin，A.，Davidson，N.和Lester，H.A. 歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Lett.)278，229-233，Ho，B.Y.，Karschin，A.，Raymond，J.，Branchek，T.，Lester，H.A.和Davidson，N. 歐洲生化學會聯合會快報(FEBS Lett.)301，303-306，Buchholz，C.J.，Retzler C.，Homann，H.E.，和Neubert，W.J. 病毒學(Virology)204，770-776)。然而，痘苗病毒/T7 RNA聚合聚雜合系統的重要前景應用，例如產生重組蛋白或重組病毒顆粒用於人體的新的治療或預防方法，可能由於重組痘苗載體的大量複製而受到阻礙。
痘苗病毒對人是感染性的並且在根除天花運動中的接種時偶而會觀察到嚴重的併發症。關於併發症發病率的最好綜述由一項美國國家調查提供，該調查檢測了大約一千二百萬接種疫苗的人，接種疫苗基於紐約城市衛生委員會痘苗病毒菌株(Lane，J.，Ruben，F.，Neff，J.和Millar，J. 新英格蘭醫學雜誌(New Engl.J.Med.)281，1201-1208)。因而安全性考慮和規範影響了使用痘苗病毒作為載體發展重組活疫苗的最令人鼓舞的可能性。此外，文獻中描述的大多數重組痘苗病毒基於西方保藏的痘苗病毒菌株(WesternReserve strain of vaccinia virus)。另一方面，眾所周知此菌株有較高的神經毒性因而不適用於人類和動物(Morita等，疫苗(Vaccine)5，65-70 )。對於載體應用，通過使用高度減毒的痘苗病毒菌株可以減小健康危險。特別發展了許多這類痘苗病毒以避免天花接種中的不希望的副作用。因而，通過痘苗病毒安卡拉菌株(CVA)在雞胚成纖維細胞中長期的連續傳代產生了改良安卡拉痘苗病毒(MVA)(綜述參看Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V和Stickl，H. 感染(Infection)3，6-14；瑞士專利號(Swiss Patent No.)568,392)。MVA病毒按照布達佩斯條約(Budapest Treaty)於1987年11月15日保藏於CNCM(巴斯德研究所，微生物菌種國家收藏館(Institut Pasteur，CollectionNationale de Cultures de Microorganisms，)25，rue du Docteur Roux，75724 ParisCedex 15)，保藏號1-721。MVA的特點是強減毒性，也就是說通過減少的毒性或感染性同時保持良好的免疫原性。檢測了MVA病毒以確定它相對於野生型CVA菌株基因組的變化。檢測到六個主要的共31,000鹼基對的基因組DNA缺失(缺失I，II，III，IV，V和VI)(Meyer，H.，Sutter，G.和Mayr A. 普通病毒學雜誌(J.Gen.Virol.)72，1031-1038)。產生的MVA病毒其宿主細胞嚴格限於禽源細胞。另外，MVA具有高度減毒的特徵。在多種動物模型中的檢驗證明MVA甚至在免疫抑制的動物中都是無毒性的。更重要的是，MVA菌株的優秀特性已在廣泛的臨床試驗中得到證實(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.l，Abt.Org.B 167，375-390 ，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392 )。在這些超過120,000人的研究中，包括高危病人，沒發現有與MVA疫苗相關的副作用。
已發現MVA在人細胞中的複製在感染後期受到阻礙，防止了成熟感染性病毒粒子的組裝。儘管如此，MVA甚至在非允許細胞中也能高水平表達病毒的和重組的基因，並建議作為有效的和特別安全的基因表達載體(Sutter，G.和Moss，B. 美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851)。最近，在MVA基礎上構建了新的痘病毒載體系統，外源DNA序列插入MVA基因組的缺失III或TK基因(Sutter，G.和Moss，B. 發育生物學標準(Dev.Biol.Stand.)Basel，Karger 84，195-200和美國專利(USpatent)5,185,146)。
為了進一步開發MVA的應用，發現了一種通過DNA重組把外源基因引入痘苗病毒MVA菌株的新的可能方法。由於發明不是要改變MVA病毒的基因組，因此必需使用符合此需要的方法。依據本發明，一種外源DNA序列準確地在MVA基因組自然發生發生缺失位點重組到病毒DNA。

發明內容
本發明從而特別地包括單獨的下述內容或它們的組合一種重組MVA病毒，包含並能夠表達至少一種插入MVA基因組天然缺失位點的外源基因；上述重組MVA病毒，包含並能夠表達至少一種插入MVA基因組缺失II位點的外源基因；上述重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一種標記，一種治療基因或一種抗原決定簇；上述重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一種來自於病原性病毒、細菌、或其它微生物，或來自於寄生蟲，或腫瘤細胞的抗原決定簇；上述重組MVA病毒，其中的外源基因編碼一種來自於惡性瘧蟲(Plasmodium Falciparum)，分枝桿菌(Mycobacteria)，皰疹病毒，流感病毒(influenza virus)，肝炎或人免疫缺陷病毒的抗原決定簇；上述重組MVA病毒，其中的抗原決定簇是人免疫缺陷病毒(HIV)的nef或人酪氨酸酶；上述重組MVA病毒，其為MVA-LAI nef或MVA-hTYR；上述重組MVA病毒，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶；上述重組MVA病毒，其為MVA-T7 pol；上述重組MVA病毒，其中的外源基因處於痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的轉錄控制之下；上述重組MVA病毒，基本上不含能夠在人細胞中複製的病毒；上述重組MVA病毒的應用，用於在T7 RNA聚合酶啟動子轉錄控制之下轉錄DNA序列；由上述任一重組MVA病毒感染的真核細胞；由上述重組MVA病毒感染的細胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶；由上述重組MVA病毒感染的細胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶，此外還包含載有一種或幾種處於T7 RNA聚合酶啟動子轉錄控制之下的外源基因的一種或幾種表達載體；上述細胞的應用，用於產生由上述外源基因編碼的多肽，包括a)在適宜條件下培養上述的細胞，以及b)分離由上述的外源基因編碼的多肽。
由上述重組MVA病毒感染的細胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶，此外還包含表達載體，該表達載體載有處於T7 RNA聚合酶啟動子控制之下的病毒基因和/或編碼一病毒載體基因組的一種病毒載體構建體；上述細胞的應用，用於產生病毒顆粒，包括a)在適宜條件下培養上述的細胞，以及b)分離病毒顆粒；由上述MVA病毒感染的細胞，其中的外源基因編碼T7 RNA聚合酶，此外還含有a)載有一種逆轉錄病毒載體構建體的表達載體，它能夠感染和指導由上述逆轉錄病毒載體構建體攜帶的一種或幾種外源基因在靶細胞中的表達，以及b)一種或幾種表達載體，其載有的基因處於T7 RNA聚合酶啟動子轉錄控制之下並編碼上述逆轉錄病毒載體構建體的基因組包裝所必需的多肽；上述細胞的應用，用於產生逆轉錄病毒粒子，包括a)在適宜條件下培養上述細胞，以及b)分離逆轉錄病毒顆粒；含有上述重組MVA病毒的疫苗，其中的外源基因在生理可接受載體中編碼一抗原決定簇；上述重組MVA病毒的應用，其中的外源基因編碼一種疫苗製劑中的抗原決定簇；上述疫苗的應用，用於免疫活的動物體，包括人；
上述含有MVA-LAInef的疫苗的應用，用於預防或治療人免疫缺陷病毒(HIV)感染或愛滋病(AIDS)；上述含有MVA-hTYR的疫苗的應用，用於預防或治療黑素瘤；一種疫苗，其第一種組分包括一種上述重組MVA病毒，其中包括的外源基因在生理可接受載體中編碼T7 RNA聚合酶；第二種組分包括一種載有在生理可接受載體中處於T7 RNA聚合酶啟動子轉錄控制之下的抗原決定簇的DNA序列，兩種組分可同時包含或分別包含；上述疫苗的應用，用於免疫活的動物體，包括人，包含用疫苗的第一種和第二種組分對上述活的動物體，包括人，進行同時接種或在同一接種部位延時接種；以及術語「基因」表示編碼一種蛋白或肽的任何DNA序列。
術語「外源基因」表示插入一DNA序列的基因，該序列中通常未發現該基因。
外源基因可以是例如標記基因、治療基因、編碼抗原決定簇的基因或病毒基因。這類基因在本技術領域眾所周知。
本發明更具體地涉及1.重組MVA病毒，它含有並能表達HIVnef抗原或抗原決定簇。
2.項1的重組MVA病毒，其中的HIVnef基因受痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制。
3.項1或2的重組MVA病毒，基本上不含有能在人的細胞中進行複製的病毒。
4.一種真核細胞，被項1-3之一的重組MVA病毒感染。
5.一種疫苗，在生理可接受的載體中含有項1-3之一所述重組MVA病毒。
6.項1-3之一的重組MVA病毒在疫苗製備中的用途。
7.用於免疫活動物體(包括人)的項1-3之一所述重組MVA病毒和/或項5所述疫苗。
8.用於預防或治療HIV感染或AIDS的項7所述重組MVA病毒和/或疫苗。
9.項1-3之一的重組MVA病毒在製備重組HIVnef蛋白中的用途。
本發明還涉及
1.重組MVA病毒，含有並能表達人酪氨酸酶(hTyr)抗原或抗原決定簇。
2.項1的重組MVA病毒，其中的hTyr基因受痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制。
3.項1或2的重組MVA病毒，基本上不含有能在人的細胞中進行複製的病毒。
4.一種真核細胞，被項1-3之一的重組MVA病毒感染。
5.項1-3之一的重組MVA病毒在製備重組hTyr蛋白中的用途。
6.一種疫苗，在生理可接受的載體中含有項1-3之一的重組MVA病毒和/或項5的重組hTyr蛋白。
7.項1-3之一的重組MVA病毒和/或項5的重組hTyr蛋白在疫苗製備中的用途。
8.用於免疫活動物體(包括人)的項1-3之一所述重組MVA病毒和/或項5所述重組hTyr蛋白和/或項6所述疫苗。
9.用於預防或治療黑色素瘤的項8所述重組MVA病毒，重組hTyr蛋白和/或疫苗。
10.項1-3之一的重組MVA病毒在回體(ex vivo)基因治療中的用途。
本發明的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)是一種宿主範圍局限的和高度減毒的痘苗病毒菌株，它在測試的人和大多數其它哺乳動物細胞系中不能增殖。但由於在非允許細胞中病毒基因表達未受損傷，依據本發明的重組MVA病毒可能用作特別安全和有效的表達載體。
編碼抗原決定簇的重組MVA病毒在一種實施方案中，本發明涉及重組痘苗病毒，其含有編碼外源抗原，優選地屬於致病病原體的基因，以及以生理可接受形式包含此類病毒的疫苗。本發明也涉及製備此類重組MVA痘苗病毒或疫苗的方法；涉及應用這些疫苗預防那些致病病原體引起的感染。
在本發明的一種優選實施方案中，插入MVA病毒的外源基因是一種編碼HIVnef的基因。
我們已構建了重組MVA病毒，允許HIV-Inef基因在痘苗病毒早/晚期啟動子P7.5的控制下進行表達。靈長類慢病毒的調節性Nef蛋白合成於病毒複製周期的早期並已表明對高滴度病毒複製和體內疾病誘導起重要作用。這提示HIVNef可能在愛滋病病理中有關鍵作用。Nef促進病毒感染性增加和HIV致病性的分子機制需要進一步闡明。但是，Nef是免疫原性的並且Nef特異抗原可用作疫苗防治HIV感染和愛滋病。
在本文中，表達HIVnef基因的重組MVA病毒可用於人體免疫，一方面作為預防疫苗防止人HIV病毒，另一方面用於HIV感染或愛滋病人的免疫治療。另外，表達HIVnef基因的MVA病毒也可用於重組HIV Nef蛋白的產生。
本發明的另一種優選實施方案中，插入MVA病毒的外源基因是一編碼人酪氨酸酶的基因。
我們已構建了重組MVA病毒，允許人酪氨酸酶基因在痘苗病毒早/晚期啟動子P7.5的控制下進行表達。近來。人酪氨酸酶被鑑定為黑素瘤特異性腫瘤抗原，它可造成抗腫瘤的溶細胞T-淋巴細胞的產生(Brichard，V.等 實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)178，489-495)。由於正常細胞中看來只有黑素細胞表達酪氨酸酶基因，因而酪氨酸酶成為黑素瘤免疫治療的有效目標抗原。所以，表達人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可用於黑素瘤病人以誘導激發腫瘤排斥或防止轉移的免疫反應。表達人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可直接用作抗黑素瘤疫苗，或用病毒製備抗黑素瘤疫苗。在一種例子中，表達人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒可用於產生重組酪氨酸酶蛋白，它作為抗原用於疫苗製劑。在另一種例子中，用表達人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒作為表達載體，來自腫瘤病人的細胞體外修飾以表達酪氨酸酶並繼而轉移回病人來誘導抗腫瘤免疫反應。基於表達人酪氨酸酶基因的重組MVA病毒的製備疫苗可用於腸胃外或腫瘤部位。可以防止腫瘤轉移或腫瘤的諸如大小、形狀、稠度、血管形成或其它表型變化。以表達人酪氨酸酶基因的重組MVA為基礎製備的疫苗可用於手術切除腫瘤前、期間或切除後。
為了製備疫苗，依據本發明的MVA痘苗病毒要轉換成生理可接受形式。這可基於製備MVA疫苗以免疫天花的經驗進行(如Stickl，H.等 Dtsch.Med.Wschr.99，2386-2392所述)。典型地，大約106-108重組MVA顆粒在含2％腖和1％人白蛋白的100毫升磷酸鹽緩衝液(PBS)中凍幹並置於一種安瓿管中，優選地是一玻璃安瓿管。凍幹品可含有補充劑(例如甘露糖醇、葡聚糖、蔗糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮)或其它助劑(例如抗氧化劑，穩定劑等，以適用於腸胃外給藥。玻璃安瓿管繼而密封並可優選地在-20℃以下貯存幾個月。
用於接種或治療的凍幹品可溶於0.1到0.5毫升水溶液，優選地是生理鹽水中，並經腸胃外給藥例如肌肉內接種或局部給藥例如接種到腫瘤或在腫瘤部位局部給藥。根據本發明的疫苗或治療優選地採用肌肉內注射(Mayr，A.等 Zbl，Bakt.Hyg.，I.Abt.Orig.B 167，375-390)。給藥方式，劑量和給藥次數可由本領域熟練技術人員對所知方式進行優化。合適的話，在長時間內接種多次以獲得對外源抗原合適的免疫反應是適宜的。
重組MVA病毒用於產生異源多肽的用途依據本發明的重組MVA痘苗病毒也可用於在真核細胞中製備異源多肽。這導致產生被重組痘苗病毒感染的細胞。編碼異源多肽的基因在細胞中表達，並分離所表達的異源多肽。產生此類異源多肽的方法通常為本領域熟練技術人員熟知(EP-A-206和EP-A-205,939)。由於MVA病毒的特殊屬性，在重組MVA病毒幫助下產生的多肽非常適於用作人和動物藥物。
編碼T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒及其用於在T7 RNA聚合酶啟動子轉錄控制下表達DNA序列的用途在本發明的進一種實施方案中，我們構建了重組MVA病毒，允許在痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制下表達噬菌體T7 RNA聚合酶。MVA-T7pol重組病毒作為表達系統的用途已經過誘導處於T7 RNA聚合酶啟動子控制之下的重組基因表達的瞬間轉染分析得到證實。使用大腸桿菌(E.coli)氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因作為報告基因，我們發現MVA-T7聚合酶誘導的CAT基因表達就象衍生於痘苗病毒複製型WR菌株的痘苗病毒/T7pol重組體一樣有效。
依據本發明的MVA/T7聚合酶雜合系統從而可用作簡單、有效和安全的哺乳動物表達系統，以在缺乏大量痘苗病毒複製的情況下產生多肽。
此表達系統也可用於在T7 RNA聚合酶啟動子轉錄控制下產生重組病毒粒子以用於免疫接種或基因治療，上述病毒粒子通過被表達T7 RNA聚合酶的重組MVA或包含所有或部分基因的DNA構建體以及為產生諸如MVA粒子或逆轉錄病毒粒子等的病毒粒子所必需的基因組或重組基因組感染的細胞系的轉化來產生。
逆轉錄病毒載體系統由兩種組分組成1)逆轉錄病毒載體本身是一種修飾的逆轉錄病毒(載體質粒)，其中編碼病毒蛋白的基因被將要傳遞給靶細胞的治療基因和標記基因代替。由於編碼病毒蛋白的基因替代損壞了病毒，必須在系統中存在第二種組分提供給修飾逆轉錄病毒丟失的病毒蛋白以拯救該病毒。
第二種組分是2)產生大量病毒蛋白但又缺乏產生可複製型病毒能力的細胞系。此細胞系稱為包裝細胞系並含有被一種或多個攜帶能夠包裝修飾的逆轉錄病毒載體的基因(編碼gag，pol和env多肽的基因)的質粒所轉染的一細胞系。
為了產生包裝的載體，載體質粒轉染入包裝細胞系。在這種情況下，含有插入的治療和標記基因的改良逆轉錄病毒基因組從載體質粒轉錄並包裝入改良逆轉錄病毒粒子(重組病毒粒子)。然後用此重組病毒感染靶細胞，其載體基因組和任何攜帶的標記或治療基因整合到靶細胞DNA。受此重組病毒粒子感染的細胞不能產生新的載體病毒，因為這些細胞中沒有病毒蛋白質。但攜帶治療和標記基因的載體DNA整合到了細胞DNA並能在感染細胞中表達。
依據本發明表達T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒可用於產生包裝逆轉錄病毒載體所需的蛋白。為此目標，把一種逆轉錄病毒(例如鼠白血病病毒(MLV))的gag，pol和env基因置於一種或多個表達載體(例如質粒)中T7RNA聚合酶啟動子轉錄控制之下。表達載體隨後引入用重組MVA病毒感染的表達T7 RNA聚合酶的細胞中，同時轉入載有逆轉錄病毒載體構建體的一種表達載體，通常處於T7 RNA聚合酶啟動子的轉錄控制之下。
WO94/29437，WO89/11539和WO96/07748描述了不同類型的逆轉錄病毒載體構建體，它們可用上述包裝系統進行包裝。
表達T7 RNA聚合酶的重組MVA病毒的再一種應用是產生重組蛋白，非感染性病毒粒子，或感染性突變病毒粒子，以用於生產疫苗或治療劑(Buchholz等，病毒學(Virology)，204，770-776(1994)和EP-B1-356695)。為此目的，把病毒基因(例如HIV-1的gag-pol和env基因)置於一種表達載體(例如質粒或其它重組MVA病毒)中T7啟動子的轉錄控制之下。此構建體隨後引入用重組MVA病毒感染的表達T7 RNA聚合酶的細胞中。重組病毒基因高效轉錄，重組蛋白大量製造並可純化。此外，表達的重組病毒蛋白(例如HIV-1的env，gag)可能組裝成假病毒粒子從細胞出芽並可從組織培養物中分離。在另一種實施方案中，由MVA-T7pol系統表達的病毒蛋白(來源於例如人免疫缺陷病毒(HIV)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，麻疹病毒(Measles virus))通過克服病毒增殖中吸附和感染，脫殼，核酸複製，病毒基因表達，裝配，出芽或其它步驟中的缺陷來拯救引入的突變病毒，從而可產生並純化所述的突變病毒。
MVA-T7pol也可與攜帶感興趣抗原基因(例如，HIV的nef，tat，gag，pol或env或其它基因)的DNA序列同時使用進行免疫。首先，給定抗原(例如人免疫缺陷病毒(HIV)，C型肝炎病毒(HCV)，人乳頭瘤病毒(HPV)，單純皰疹病毒(HSV)，麻疹病毒，流感病毒或其它)的編碼序列克隆到處於T7 RNA聚合酶啟動子控制之下優選地是質粒的載體中並使用常規實驗室方法擴增和純化產生的DNA構建體。其次，載體DNA同時或在適當時間延遲後與MVA-T7pol一起免疫接種。在接種部位，感興趣的重組基因在含有載體DNA和MVA-T7pol的細胞中瞬時表達並且相應抗原存在於宿主免疫系統刺激了抗原特異性免疫反應。這種使用非複製痘苗載體MVA-T7pol的方案代表了一種提供給定抗原有效瞬時表達而又避免了組成型基因表達潛在危險的核酸免疫接種的有前途的新方法。
重組MVA痘苗病毒可按下文陳述進行製備。
一種包含側翼為MVA基因組中鄰近自然發生缺失例如缺失II的MVADNA序列的編碼一種外源多肽DNA序列的DNA構建體，引入到用MVA感染的細胞中，以發生同源重組。一旦把DNA構建體引入真核細胞並且外源DNA與病毒DNA重組，就可能通過對所需重組痘苗病毒用已知的方式，優選地在標記幫助下，分離到所需重組痘苗病毒(對比Nakano等，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)79，1593-1596 ，Franke等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)1918-1924 ，Chakrabarti等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)3403-3409 ，Fathi等，病毒學(Virology)97-105 )。要插入的DNA-構建體可以是線狀的或環狀的。環狀DNA是優選的，特別是質粒。DNA-構建體包含位於MVA基因組自然發生缺失例如缺失II左方和右方側翼的序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger J.(1989)病毒學集刊(Arch.Virol.)105，15-27)。外源DNA序列插入位於自然發生缺失側翼的序列之間。外源DNA序列可以是編碼治療多肽，例如組織血纖維溶酶原激活劑(t-PA)或幹擾素，或來自致病病原體的抗原決定簇的基因。致病病原體可以是導致疾病的病毒、細菌和寄生蟲，也可能是在有機體中無限制增殖從而可能導致病理生長的腫瘤細胞。這些致病病原體的例子由Davis，B.D.等做過描述(微生物學(Microbiology)第三版，Harper International Edition)。優選的致病病原體抗原來自人免疫缺陷病毒(例如HIV-1和HIV-2)，導致肺結核的分枝桿菌，寄生蟲惡性瘧蟲，以及黑素瘤細胞。
為了表達一種DNA序列或基因，DNA中必須存在基因轉錄必需的調節序列。這些調節序列(稱為啟動子)為本技術領域技術人員所熟知並包含例如EP-A-198,328中所述的痘苗病毒11kDa基因和那些7.5kDa基因(EP-A-110,385)。DNA構建體可通過轉染，例如通過磷酸鈣沉澱方法(Graham等，病毒學(Virol.)52，456-467 ；Wigler等，細胞(Cell)777-785 )通過電穿孔方法(Neumann等，歐洲分子生物學組織雜誌(EMBO J.I，)841-845 )，通過微注射方法(Graessmann等，酶學方法(Meth.Enzymology)101，482-492(1983))，通過脂質體方法(Straubinger等，酶學方法(Methods in Enzymology 101，512-527(1983)，通過原生質球方法(Schaffner，美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77，2163-2167(1980))或其它本技術領域熟知的方法引入到MVA感染的細胞。通過磷酸鈣沉澱進行轉染是優選的方法。
下面的詳細實施例是為了有助於對本發明的更好理解。但不是說本發明僅局限於實施例內容。


圖1圖示MVA基因組圖譜和用於通過同源重組插入外源DNA的質粒圖譜MVA基因組中的HindIII限制性位點標在上面。顯示了重疊MVA基因組中缺失II接界的900bp HindIII-HindIII N片段。鄰近缺失II的MVADNA序列通過PCR(聚合酶鏈式反應)擴增並用於構建插入質粒pUCIILZ。
圖2pUCIILZP7.5用於插入缺失II的MVA載體質粒，包含P11-Lac Z表達盒和痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5以表達可克隆到質粒SmaI位點的感興趣基因。
圖3pUCIILZdel P7.5用於在MVA基因組缺失II位點插入外源基因的MVA載體質粒，含有自缺失P11-Lac Z表達盒和痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5以表達可克隆到質粒SmaI/NotI克隆位點的感興趣基因。圖4重組病毒MVA-T7pol的構建圖示MVA基因組(HindIII限制性內切核酸酶位點)圖譜以及使T7 RNA聚合酶基因插入MVA基因組HingIIIN片段中缺失II位點的載體質粒pUCIILZT7pol的圖譜。
圖5MVA-T7pol病毒DNA的Sourthern印跡檢測圖6用[35S]甲硫氨酸對蛋白進行代謝標記。SDS聚丙烯醯胺(PAGE)凝膠電泳檢測。泳道1MVAT7pol，泳道2MVA，泳道3CV-1細胞。
圖7氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)檢測用含有處於T7 RNA聚合酶啟動子控制下的CAT基因的質粒轉染的以及用MVA-T/pol或WR-T7pol感染的CV-1細胞。裂解物用於檢測CAT活性。C是指氯黴素，1-AcC和3-AcC是指單和三乙醯化形式的氯黴素。Cat活性用60分鐘內形成的乙醯化產物百分數表示。
圖8MVA-LAInef的構建圖示MVA基因組(HindIII限制性內切核酸酶位點)圖譜以及使HIV-1LAI的nef基因插入MVA基因組HindIIIN片段中缺失II位點上的載體質粒pUCIILZdel P7.5-LAInef的圖譜。圖9MVA-hTYR的構建圖示MVA基因組(HindIII限制性內切核酸酶位點)圖譜以及使人酪氨酸酶基因插入MVA基因組HindIIIN片段中缺失II位點上的載體質粒pUCIILZdel P7.5-TYR的圖譜。
實施例1.病毒的生長和純化1.1MVA病毒的生長MVA病毒是一種高度減毒的痘苗病毒，它由安卡拉痘苗病毒(CVA)通過在原代雞胚成纖維細胞(CEF)培養物中長期連續傳代衍生而來。關於產物的歷史、特性及MVA菌株的應用的概括性綜述參考Mayr等在感染(Infection)3，6-14 中發表的總結。由於在CEF中的減毒，MVA病毒在這種禽宿主細胞中複製到很高的滴度。然而在哺乳動物細胞中MVA是嚴格生長局限的，並且檢測不到病毒引起的典型噬斑形成。所以，MVA病毒要生長於CEF細胞。為了製備CEF細胞，從孵化11天的雞蛋中分離胚，去除末端，並把胚絞碎後在含有0.25％胰蛋白酶的溶液中37℃解離20分鐘。過濾產生的細胞懸液並用SorvaURC-3B離心機在室溫下2000rpm離心5分鐘沉澱細胞，重懸於10體積培養基A(Eagle基礎培養基(MEM Eagle)，例如可獲取於Life Technologies GmbH，Eggenstein，Germany)，並再用SorvallRC-3B離心機在室溫下2000rpm離心5分鐘進行沉澱。細胞沉澱重懸於含10％胎牛血清(FCS)，青黴素(100單位/毫升)，鏈黴素(100毫克/毫升)和2mM穀氨醯氨的培養基A中以獲得含500000細胞/毫升的細胞懸液。用這種方法獲得的CEF細胞鋪於細胞培養皿中。把它們放到培養基A中，按照所需細胞濃度在二氧化碳培養箱中37℃生長1-2天，並直接或再進行一次細胞傳代後用於感染。製備原代培養物的詳細描述可在R.I.Freshney，「動物細胞培養」(「Culture of animal cell」)，Alan R.Liss Verlag，New York 一書中第11章99頁及其下列等等中找到。
MVA病毒按下面方法用於感染。CEF細胞培養在175釐米2細胞培養瓶。在90％-100％鋪滿時，去除培養基並且細胞在培養基A中與MVA病毒懸液(每個細胞0.01感染單位(IU)，0.02毫升/釐米2)共培養1小時。然後添加更多的培養基A(0.2毫升/釐米2)並且把培養瓶在37℃培養2-3天(直到大約90％的細胞表現細胞病變效應)。通過刮細胞單層到培養基並在Sorvall RC-3B離心機中4℃ 3000rpm離心5分鐘沉澱細胞物質製備粗病毒貯存物。粗病毒製劑在進一步處理(例如病毒純化)前貯存於-20℃。
1.2病毒的純化為獲得儘可能純的並且不含對宿主細胞特異組分的病毒所採用的純化步驟類似於Joklik所述(病毒學(Virology)18，9-18 )。融解貯存於-20℃的粗病毒保存物並在PBS中懸浮一次(10-20倍沉澱體積)，懸浮液如上述方式離心。新沉澱懸浮於10倍體積Tris緩衝液1(10mM Tris-HCl pH9.0)，懸浮液用超聲波簡短處理(Labsonic L，B.Braun Biotech International，Melsungen Germany；2×10秒，60瓦，室溫)以進一步離解細胞碎片並從細胞物質中釋放病毒粒子。細胞核和較大細胞碎片繼而通過懸浮液的簡短離心去除(獲取於杜邦公司(Du Pont Co.)的Sorvall GSA轉頭，D-6353 BadNauheim，FRG；3000rpm 10℃離心3分鐘)。沉澱再一次懸浮於Tris緩衝液1，用超聲波處理並離心，如上所述。收集的含游離病毒粒子的上清液聯合併鋪層於10mM Tris-HCl，pH9.0的10毫升36％蔗糖墊層上，在Beckman SW27/SW 28離心機轉頭中4℃13,500rpm離心80分鐘。去掉上清液，含有病毒粒子的沉澱溶解於10毫升pH9.0的1mM Tris-HCl，用超聲波簡短處理(室溫下2×10秒，儀器如上所述)均勻，加樣到20％-40％蔗糖梯度(蔗糖溶於1mM Tris-HCl，pH9.0)以進一步純化。梯度液在Beckmann SW 41離心機轉頭中4℃13,000rpm離心50分鐘。離心後，含有病毒粒子的分離帶在抽吸去帶上面體積後用移液管收集。獲得的蔗糖溶液用三倍體積PBS稀釋然後病毒粒子再通過離心沉澱(Beckmann SW 27/28，60分鐘，13,500rpm，4℃)。現在，沉澱絕大部分由純病毒粒子構成，它重懸於PBS並平衡至病毒濃度平均相當於1-5×109IU/ml。純化的病毒貯存液貯存於-80℃並直接或用PBS稀釋後用於隨後的實驗。
1.3MVA病毒的克隆為了產生均勻貯存病毒製劑，獲取於Anton Mayr教授的MVA病毒通過在96孔組織培養板上CEF培養物中連續三次傳代過程中的有限稀釋進行克隆化。篩選到MVA克隆F6並在CEF中擴增以獲得病毒的工作貯存物，作為產生本發明申請中描述的重組MVA病毒以及用於產生以前描述的重組MVA病毒的起始材料(Sutter，G.and Moss，B. 美國國家科學院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，10847-10851；Sutter，G.，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B. 疫苗(Vaccine)12，1032-1040；Hirsch，V.，Fuerst，T.，Sutter，G.，Carroll，M.，Yang，L.，Goldstein，S.，Piatak，M.，Elkins，W.，Alvord，G.，Montefiori，D.，Moss，B.and Lifson，J. 病毒學雜誌(J.Virol.)70，3741-3752)。
2.重組MVA病毒的構建及其特徵2.1.載體質粒構建為了實現重組MVA病毒的產生，構建了新的載體質粒。插入到MVA基因組的外源基因準確定位於MVA基因組自然發生缺失II位點。位於MVA基因組HindIIIN片段中2500bp缺失位點側翼的MVA DNA序列(Altenburger，W.，Suter，C.P.和Altenburger，J. ，病毒學集刊(J.Arch.Virol.)105，15-27)用PCR法擴增並克隆到質粒pUC18的多克隆位點。用於左方600bp DNA側翼的引物是5′-CAGCAGGGTACCCTCATCGTACAGGACGTTCTC-3′和5′-CAGCAGCCCGGGTATTCGATGATTATTTTTAACAAAATAACA-3′(限制性酶KpnI和SmaI位點下面劃線)。用於右方550bp DNA側翼的引物是5′-CAGCAGCTGCAGGAATCATCCATTCCACTGAATAGC-3′和5′CAGCAGGCATGCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGA-3′(限制性酶PstI和SphI位點下面劃線)。在插入到pUC18的MVADNA這兩段側翼之間，利用BamHI位點插入處於痘苗病毒晚期啟動子P11控制之下的大腸桿菌(Escherichia coli)Lac Z基因(通過pIIILZ限制性消化製備，Sutter，G.和Moss，B. 美國國家科學院院報(PNAS USA)89，10847-10851)，從而產生MVA插入載體pUCIILZ[圖1]。接下來一段含有痘苗病毒早期一晚期啟動子P7.5以及用於克隆的SmaI位點的289bp片段(通過EcoRI和XbaI限制性消化質粒載體pSCII製備[Chakra barti等，1985，分子和細胞生物學(Molecularand Cellular Biology)5，3403-3409])插入到pUCIILZ的SmaI位點產生了MVA載體pUCIILZ P7.5[圖2]。為了構建一種載體質粒以通過報告酶β-半乳糖苷酶的瞬時合成實現重組MVA病毒的分離，一種來自大腸桿菌(E.coli)Lac Z開放閱讀框3′末端的330bp DNA片段用PCR擴增(引物是5′-CAGCAGGTCGACCCCGACCGCCTTACTGCCGCC-3′和5′-GGGGGGCTGCAGATGGTAGCGACCGGCGCTCAG-3′)並克隆到pUCIILZP7.5的SalI和PstI位點，獲得MVA載體pUCIILZdel P7.5[圖3]。利用SmaI位點，此載體質粒可用於把處於痘苗病毒啟動子P7.5轉錄控制之下的編碼外源基因的DNA序列插入到MVA染色體。在通過篩選β-半乳糖苷酶活性分離到所需重組病毒後，重組病毒的進一步增殖導致通過同源重組產生再改造P11-LacZ表達盒的自缺失。
2.2.重組病毒MVA T7pol的構建和特徵一種含有處於痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5控制之下的噬菌體T7RNA聚合酶完整基因的3.1Kbp DNA片段用EcoR1從質粒pTFF3上切下(Fuerst，T.R.，Niles，E.G.，Studier，F.W.和Moss，B.，1986，美國國家科學院院報(P.N.A.S.USA)83，8122-8126)，與Klenow DNA聚和酶一起溫育修飾產生平頭末端，並克隆到pUCIILZ的單獨SmaI限制性位點。產生質粒轉移載體pUCIILZ T7pol[圖4]。選擇痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5作為T7 RNA聚合酶基因表達的轉錄調節子。與較強的痘苗病毒晚期啟動子(例如P11)相反，此啟動子系統使重組基因在靶細胞感染後立即表達。指導外源基因插入MVA基因組缺失II位點的質粒pUCIILZ T7pol用於產生重組病毒MVAT7pol。
用MVA在每細胞感染複數為0.05 TCID50情況下感染的CEF細胞，按照前面所述使用質粒pUCIILZ T7pol DNA進行轉染(Sutter，G.，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B.(1994)疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。表達T7RNA聚合酶並共表達β-D-半乳糖苷酶的重組MVA病毒(MVA P7.5-T7pol)通過在CEF細胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)進行連續五輪噬斑純化選擇出來。隨後，通過感染CEF單層擴增重組病毒，並用PCR檢測DNA以證實病毒貯存物的遺傳均一性。MVA-T7pol病毒DNA的Southern印跡檢測證明了重組基因在MVA基因組中缺失II位點的穩定整合[圖5]。
為檢測重組MVA T7pol的T7 RNA聚合酶表達，測定了來自病毒感染的組織培養物中的[35S]甲硫氨酸標記多肽。生長於12孔板上的單層猴腎細胞系CV-1用病毒以每細胞感染複數20TCID50進行感染。感染3到5小時後，去除培養基，並用1毫升無甲硫氨酸培養基衝洗培養物一次。每孔加入補充有50微居裡(μCi)[35S]甲硫氨酸的0.2毫升無甲硫氨酸培養基並在37℃溫育30分鐘。感染細胞的胞質抽提物通過每孔在0.2毫升0.5％Nonidet P-40裂解緩衝液中37℃溫育10分鐘製備，樣品用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測。CV-1細胞與MVA T7pol的代謝標記顯示了兩種額外多肽的合成(i)一種大約116,000道爾頓的蛋白代表共表達的大腸桿菌β-半乳糖苷酶以篩選重組病毒以及(ii)一種98,000道爾頓的蛋白，同噬菌體T7 RNA聚合酶預期大小一致[圖6]。由MVAT7pol產生的大量β-半乳糖苷酶是令人注目的。體內實驗的結果表明，當插入到MVA基因組缺失II位點時有P11-Lac Z基因構建體的強表達，揭示MVA載體病毒中的重組基因當插入到MVA基因組的該位置時可能會更有效地表達。
MVA-T7pol重組病毒作為表達系統的用途與WR-T7pol重組病毒vTF 7-3(Fuerst等1986)的比較通過一種質粒載體DNA的共轉染進行了測定，該質粒載體衍生於pTM1(Moss，B.，Elroy-Stein，O.，Mizukami，T.，Alexander，W.A.，和Fuerst T.R.(1990)自然(Nature)348，91-92)並含有(克隆到pTM1多克隆位點的NcoI和BamHI位點)處於T7 RNA聚合酶啟動子(PT7)控制之下的大腸桿菌氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因。轉染和感染的CV-1細胞懸浮於0.2毫升0.25M Tris-HCl(pH7.5)。三輪凍融循環後，通過離心澄清裂解液，測定了上清液中蛋白含量，並且含0.5，0.25，0.1微克總蛋白的樣品按Mackett，M.，Smith，G.L.和Moss，B.(1984)病毒學雜誌(J.Virol.)49，857-864所述檢測了酶活性。放射自顯影后，用Fuji成像檢測系統定量標記斑點。結果表明通過使用高減毒痘苗載體MVA，可能利用痘苗病毒-T7RNA聚合酶系統時就象使用完全的可複製型痘苗病毒重組體一樣有效[圖7]。
2.3.重組病毒MVA-LAInef的構建及鑑定一種含有HIV-1 LAI完整nef基因的648bp DNA片段通過PCR從質粒DNA製備(pTG 1166由M.-P.Kieny，Transgene S.A.，Strasbourg惠贈；PCR引物為5′-CAGCAGGGATCCATGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAGTAGT-3′和5′-CAGCAGGGATCCATGTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCCGG-3′)，用限制性內切核酸酶BamHI消化，與Klenow DNA聚合酶一起溫育修飾以產生平頭末端，並克隆到pUCIIL Zdel P7.5的SmaI位點以產生載體pUCIILZdel P7.5-LAInef[圖8]。此質粒可用於改造MVA重組病毒以在痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5控制下表達HIV-1 LAI的nef基因。
用MVA在每細胞感染複數0.05 TCID50感染的CEF細胞再按前述方法用質粒pUCIIL Zdel P7.5-LAInef的DNA進行轉染(Sutter，G.，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B. 疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。含有nef基因和瞬時共表達大腸桿菌Lac Z標記基因的重組MVA通過在CEF細胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D半乳糖苷(300μg/ml)染色的連續幾輪噬斑純化選擇出來。此後含有nef基因和缺失Lac Z標記基因的重組MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通過三輪附加的連續噬斑純化篩選以尋找CEF細胞中的非染色病毒病灶而得以分離。隨後，重組病毒感染CEF單層進行擴增，並且用PCR檢測MVA-LAInef病毒DNA以證實病毒貯存物的遺傳均一性。病毒DNA的Southern印跡檢測證實了MVA-LAInef的遺傳穩定性並精確表明nef基因和大腸桿菌Lac Z標記基因缺失整合到了病毒基因組缺失II位點。
重組Nef蛋白的有效表達通過對來自MVA-LAInef感染的CEF細胞的蛋白裂解液使用引導抗HIV-1 Nef的鼠單克隆抗體(由K.Krohn惠贈並按照Ovod，V.，Lagerstedt，A.，Ranki，A.，Gombert，F.，Spohn，R.，Tahtinen，M.，Jung，G.，和Krohn，K. 愛滋病(AIDS)6，25-34所述使用)進行Western印跡檢測得以證實。
2.4.重組病毒MVA-hTYR的構建及鑑定一種含有編碼人酪氨酸酶完整基因的1.9kb DNA片段[酪氨酸酶C-DNA克隆123，B2分離自病人SK 29(AV)的黑素細胞系SK 29-MEL，GenBank Acc.no.UO 1873；Brichard，V.，Van Pel，A.，Wolfel，T.，Wolfel，C.，DePlaen，E.，Lethe，B.，Coulie，P.和Boon，B.(1993)實驗醫學雜誌(J.Exp.Med.)178，489-495]通過EcoR1消化從質粒pc DNAI/Amp-Tyr[Wolfel，T.，Van Pel，A.，Brichard，V.，Schneider，J.，Seliger，B.，Meyer zum Buschenfelde，K.和Boon，T.(1994)歐洲免疫學雜誌(Eur.J.Immunol)24，759-764]製備，與Klenow DNA聚合酶一起溫育修飾產生平頭末端，並克隆到pUCIIL ZdelP7.5的SmaI位點以產生載體pUCIIL Zdel P7.5-TYR[圖9]。此質粒可用於改造MVA重組病毒以在痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5控制下表達人酪氨酸酶基因。
MVA以每細胞感染複數0.05 TCI D50感染的CEF細胞用前述的質粒pUCIIL Zdel P7.5-TYR的DNR轉染(Sutter，G，Wyatt，L.，Foley，P.，Bennink，J.和Moss，B.(1994)疫苗(Vaccine)12，1032-1040)。穩定表達人酪氨酸酶基因並瞬時共表達大腸桿菌Lac Z基因的重組MVA病毒通過在CEF細胞中用5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)染色的連續幾輪噬斑純化選擇出來。此後，表達編碼人酪氨酸酶基因並有缺失的Lac Z標記基因的重組MVA病毒在5-溴-4-氯-3-吲哚β-D-半乳糖苷(300μg/ml)存在下通過三輪附加的連續噬斑純化以篩選CEF細胞中的非染色病毒病灶而得以分離。隨後，重組病毒感染CEF單層進行擴增，並且用PCR檢測MVA-hTYR病毒DNA以證實病毒貯存物的遺傳均一性。病毒DNA的Southern印跡檢測證實了MVA-hTYR的遺傳穩定性並精確表明重組酪氨酸酶基因和大腸桿菌Lac Z標記基因缺失整合到了病毒基因組中缺失II位點重組人酪氨酸酶的有效表達通過對來自MVA-hTYR感染的CEF細胞的蛋白裂解液使用兔多克隆抗體(由V.Hearing惠贈並按照Jimenez，M.，Kameyama，K.，Maloy，L.，Tomita，Y.和Hearing，V. 美國國家科學院院報(P.N.A.S.USA)85，3830-3834所述使用)或引導抗酪氨酸酶的鼠單克隆抗體(由L.Old惠贈並按照Chen，Y.，Stockert，E.，Tsang，S.，Coplan，K.和Old，L. 美國國家科學院院報(P.N.A.S.USA)92，8125-8129所述使用)進行Western印跡檢測得以證實。
序列表(1)一般資料(i)申請人(A)名稱GSF-Forschungszentrumfuer Umwelt und GesundheitGmbH(B)街道Ingolstaedter Landstr.1，Neuherberg(C)城市Oberschleissheim(E)國家德國(F)郵編(ZIP)85764(ii)發明名稱重組MVA病毒及其應用(iii)系列數目8(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM兼容PC(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，#1.30版本(EPO)(vi)在先申請資料(A)申請號DK 0782/95(B)申請日1995，7，4(2)序列資料1(i)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列1CAGCAGGGTA CCCTCATCGT ACAGGACGTT CTC 33(2)序列資料2(i)序列特徵
(A)長度42鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列2CAGCAGCCCG GGTATTCGAT GATTATTTTT AACAAAATAA CA42(2)序列資料3(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列3CAGCAGCTGC AGGAATCATC CATTCCACTG AATAGC 36(2)序列資料4(i)序列特徵(A)長度36鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列4CAGCAGGCAT GCCGACGAAC AAGGAACTGT AGCAGA 36(2)序列資料5(i)序列特徵(A)長度33鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列5CAGCAGGTCG ACCCCGACCG CCTTACTGCC GCC 33(2)序列資料6(i)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列6GGGGGGCTGC AGATGGTAGC GACCGGCGCT CAG 33(2)序列資料7(i)序列特徵(A)長度39鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列7CAGCAGGGAT CCATGGGTGG CAAGTGGTCA AAAAGTAGT39(2)序列資料8(i)序列特徵(A)長度39鹼基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝「DNA-引物」(xi)序列描述序列8CAGCAGGGAT CCATGTCAGC AGTTCTTGAA GTACTCCGG39
權利要求
1.重組MVA病毒，它含有並能表達HIV nef抗原或抗原決定簇，或者它含有並能表達人酪氨酸酶(hTyr)抗原或抗原決定簇。
2.權利要求1的重組MVA病毒，其中的HIV nef基因或hTyr基因受痘苗病毒早期/晚期啟動子P7.5的控制。
3.權利要求1或2的重組MVA病毒，基本上不含有能在人的細胞中進行複製的病毒。
4.一種真核細胞，被權利要求1-3之一的重組MVA病毒感染。
5.一種疫苗，在生理可接受的載體中含有權利要求1-3之一的重組MVA病毒。
6.權利要求1-3之一的重組MVA病毒在疫苗製備中的用途。
7.用於免疫活動物體，包括人，的權利要求1-3之一的重組MVA病毒和/或權利要求5的疫苗。
8.用於預防或治療HIV感染或AIDS，或者用於預防或治療黑色素瘤的權利要求5所述重組MVA病毒和/或疫苗。
9.權利要求1-3之一的重組MVA病毒在製備重組HIV nef蛋白或重組hTyr蛋白中的用途。
10.權利要求1-3之一的重組MVA病毒在回體(ex vivo)基因治療中的用途。
全文摘要
包含並能表達插入改良安卡拉痘苗病毒(MVA)基因組天然缺失位點的外源基因的重組MVA病毒，以及應用這類重組MVA病毒生產多肽，例如抗原或治療劑，和重組病毒以用作疫苗或產生病毒載體用於基因治療。
文檔編號C12N15/54GK1554764SQ20041003671
公開日2004年12月15日 申請日期1996年7月3日 優先權日1995年7月4日
發明者格爾德·薩特, 馬裡恩·奧爾曼, 沃爾克·厄夫勒, 厄夫勒, 奧爾曼, 格爾德 薩特 申請人:Gsf環境與健康研究中心有限公司