用蛋白質a和離子交換層析來純化抗體的製作方法

2023-05-11 21:30:21 1

專利名稱：用蛋白質a和離子交換層析來純化抗體的製作方法
蛋白質A層析本發明涉及生物技術產業的抗體純化領域。本發明的一個目的是提供一種抗體純化的新方法。
蛋白質A層析法已廣泛用於抗體的產業化製備，因為該法可一步從細胞培養上清液中幾乎完全純化抗體，通常是IgG抗體。但蛋白質A親和層析柱反覆運作時不可避免地會發生某種程度的配體脫落。這可能部分是由於蛋白酶水解將蛋白質A從柱上剪切下來，而藥學應用的產業化抗體製備，因規則原因混合物中不能加入蛋白質酶抑制劑。不幸的是，這種蛋白質A或其片段的汙染物仍保留了對IgG的親和力，由於形成複合物而難以從純化的抗體中去除。但去除是必須的，因為蛋白質A是細菌蛋白質會引起不良免疫應答反應；據報導將蛋白質A加單體IgG形成的模擬複合物在體內可激活攜帶Fc的白細胞和補體系統，產生氧化和過敏作用(Balint等，Cancer Res，44；734，1984)。
美國專利6,399,750中介紹了商品化重組蛋白質A的種類，通過硫脂鍵將重組蛋白質A結合於層析柱基質可使蛋白質A柱具有較高容量，但與通過CNBr交聯獲得的許多傳統多點結合的天然蛋白質A基質相比，其伴隨的缺點是這種重組蛋白質A基質的脫落率顯著增加。因此，應去除蛋白質A汙染物，而不要同時去除了複合物中的IgG。
Balint等(同上)顯示可通過凝膠滲濾將這種IgG-蛋白質複合物與未複合的IgG相分離。但產量低和抗體損失大是此法的缺點。
美國專利4,983,722說，可通過將混合物吸附於陰離子交換材料，然後在遞增離子強度條件下，順次洗脫抗體和蛋白質A使這二種組分分開，可從蛋白A純化的抗體製品中選擇性分離去除汙染的蛋白質A。此分離法高度依賴於抗體的等電點(pI)，而pI對給定的抗體是特異性的和高度不同的。而且達到分離所需的鹽梯度過於急劇限制了此法的實施。
本發明的一個目的是提供使蛋白質A或其片段與抗體，優選IgG抗體相分離的另一種方法，該方法避免了當前技術的缺點。按照本發明的獨立權利要求1-9解決了此問題。
本發明設計的純化抗體方法包括步驟如下首先，用蛋白質A親和層析純化抗體，其中所述蛋白質A是天然蛋白質A或其功能性衍生物。其次，將純化的抗體加到離子交換材料上，所用的條件能使蛋白質A或其功能性衍生物與基質結合；第三步收集該離子交換介質流穿液中的抗體，宜收集加載到該離子交換材料中抗體量的至少70％，更優選收集至少80％，最優選收集至少90％，而同時汙染的蛋白質A或其衍生物仍結合在該離子交換材料上。
蛋白質A是發現於金黃色葡萄球菌的細胞表面蛋白質，它具有結合哺乳動物抗體，特別是IgG類抗體Fc區的特性。在該給定類型的抗體中，對於動物種類來源和抗體亞類或同種異型的不同，其親和力也略有不同(綜述見Surolia.A等，1982，蛋白質A天然的通用性抗體，TIBS 7，74-76；Langone等，1982，金黃色葡萄球菌蛋白質A和其相關的免疫球蛋白受體，Advances in Immunology，32157-252)。可直接從分泌蛋白質A的金黃色葡萄球培養物中分離得到蛋白質A，或更方便地在大腸桿菌中重組表達(Lofdahl等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80697-701)。其在抗體，特別是單克隆抗體IgG純化中的用途現有技術已有描述(如Langone等，同上；Hjelm等1972；FEBS Lett.，2873-76)。對於採用蛋白質A親和層析，應將蛋白質A偶聯於固相基質，例如不帶電荷的交聯瓊脂糖(Sepharose，沒有天然瓊脂糖的帶電荷組分)trisacryl交聯的的葡聚糖或二氧化矽為基礎的材料。方法是本領域公知的，例如通過蛋白質的伯氨功能基團與CNBr活化的基質偶聯。蛋白質A與IgG的Fc部分結合是高親和力和高特異性的，即通過IgG的Cγ2-Cy3界面(見Langone等所述，同上)，具體說，它與人的同種異型或亞類IgG1、IgG2、IgG4和小鼠同種異型或亞類IgG2a、IgG2b、IgG3結合力強。蛋白質A對VH基因家族，VHIII編碼的免疫球蛋白Fab區也顯示有親和力(Sasso等，1991，J Immunol.，613026-3031；Hilson等，JExp.Med.，178331-336，1993)。編碼蛋白質A的基因序列顯示有兩個功能不同的區域(Uhlen等，J Biol Chem.，2591695-1702，1984；Lofdahl等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，80697-701，1983)。其氨基末端區含有5個高度同源性IgG結合功能域(稱為E、D、A、B和C)，其羧基末端區將該蛋白錨定在細胞壁和細胞膜上。蛋白質A的所有5個IgG結合功能域都能通過Fc區IgG，涉及例如人IgG-Fc殘基252-254、433-435和311，其晶體結構圖見Diesenhofer等(1981，Biochemi stry.202361-1370)和Sauer-Eriksson等(1995，Structure.3265-278)的蛋白質A的B-功能域。在Fc部分中發現的兩個基本上毗連的主要結合位點已得到Gouda等的NMR分辯研究(1998，Biochemistry，37129-136)證實。原則上，蛋白質A的IgG結合功能域A-E之每一個都足夠與IgG的Fc部分結合。
此外，發現人的某些VH3家族等位基因能任選地介導人Ig與蛋白質A的結合(Ibrahim等，1993，J Immunol.，1513597-3603；V-區介導人Ig與蛋白質A的結合)。在本申請書內容中，本發明的另一不同目的，所述的可應用於抗體Fc區與蛋白質A結合的任何事情，都同樣可應用於通過這類VH3家族蛋白質A結合等位基因(這類抗體的Fc區本身不能高親和力對結合蛋白質A)結合抗體。這可認為是本發明以Fc為基礎方法原理的等同性實施方式，將在後續章節中作進一步敘述。
本發明的任何IgG抗體可理解為能以高親和力結合蛋白質A的任何這類同種異型抗體。另外，與抗體的結合蛋白質A相關的Fc部分不同，這類抗體不一定對應於天然產生的抗體。具體說其可變鏈的區域部分，可經工程改造成嵌合性或CDR-移植抗體，如該領域常規設計的那樣。簡言之，本發明的任何IgG抗體應認為是IgG類型抗體。
本發明的蛋白質A的功能性衍生物特徵是對小鼠IgG2a或人IgG1的結合常數至少為K＝10-8M，優選K＝10-9M。依從此結合常數值的相互反應在本文中稱為「高親和力結合」。蛋白質A的功能性衍生物宜含有野生型蛋白質A的至少功能性IgG結合結構域部分，此結構域選自天然結構域E、D、A、B、C或其經工程改造後的保留了IgG結合功能的突變蛋白。例子是蛋白質A的B結構域功能性59胺基酸『Z』片段，B結構域可用於抗體純化，見美國專利6013763。然而，優選本發明的抗體結合片段至少含有本節所述的兩個完整的Fc結合結構域。一個例子是Repligen公司的歐洲專利EP-282308和EP-284368中公開的重組蛋白質A的序列。
如以上章節所定義的蛋白質A或其功能性片段或衍生物可單獨或聯合，更優選工程改造的能單點結合的蛋白質A片段。單點結合意為蛋白質部分通過一個共價鍵結合於蛋白A親和層析的層析載體物質。這種單點結合可通過適當的反應性殘基而結合，這種反應性殘基理想地位於暴露的胺基酸位置，如靠近N-或C-末端的環圈中，或蛋白質摺疊的外周部分。適合的反應性基團有例如巰基或氨基。更優選這種重組蛋白質A或其功能性片段在其胺基酸序列中含有半胱氨酸。最優選所述半胱氨酸包含在該重組蛋白質A或其功能性片段胺基酸序列的C-末端至少30個胺基酸組成的區段中。這種類型的另一優選實施方式中，該重組蛋白質A或其功能性片段通過硫醚鍵至少50％結合於蛋白A親和層析介質的層析載體或基質材料上。此類實施方式的例子見Pharmacia的美國專利6399750中的描述，可從市場上依據所用載體基質的性質，以Amersham-Biosciences的品牌名StreamlineTMMabSelectTM購買到，在本文中，按通常的化學語言，硫醚狹義理解為-S-鍵，而不論其化學成分；例如，可以說本發明的-S-『硫醚鍵』是較大功能基團的一部分，例如本申請書中的硫醚或混合乙酸來自化學家採用的以反應性為基礎的通常語言。硫醚鍵優選其普通的化學上狹義的硫醚鍵。對於這種鍵連接，可通過使蛋白質A半胱氨酸殘基的巰基與活化層析載體物質上的環氧基團反應而產生硫醚基團。帶有末端半胱氨酸殘基時，可在只適合蛋白質暴露的獨特巰基偶聯的條件下進行這種反應，結果只產生該蛋白質的單點結合。
在一具體優選實施方式中，本發明的蛋白質A或其功能性衍生物是美國專利6399750所公開的重組蛋白質A，其含有並置在末端的工程改造的半胱氨酸殘基，通過所述半胱氨酸殘基的硫原子作為唯一的結合點，宜至少50％，更優選至少70％偶聯於層析載體物質。更優選，這種偶聯可通過環氧介導的活化實現，還要優選通過瓊脂糖基質，例如Sepharose Fast Flow(用表氯醇交聯的瓊脂糖珠，AmershamBiosciences，UK)的1，4-雙-(2，3-環氧丙氧基)丁烷活化，或通過瓊脂糖基質如Sepharose FF的表氯醇活化而實現這種偶聯。還優選與本章節上述優選實施方式聯合的是，首先的離子交換劑是陰離子交換劑，具體說是季銨為基礎的離子交換劑，如Sepharose QTMFF(Amersham-Biosciences/Pharmacia)，最優選具有能偶聯於基質載體的功能性交換劑基團Q的陰離子交換劑，基團Q是N，N，N-三甲基氨基甲基，最優選的陰離子交換劑是Pharmacia/Amersham Biosciences的Sepharose QTMFF。季銨基團是強交換劑，對加載/洗滌時pH的變化不敏感。快流速交換材料是45-165μm的高度交聯的瓊脂糖珠，物理穩定性較高；另外Sepharose沒有天然瓊脂糖的帶電荷硫酸化分子組分，不會使抗體非特異性吸附於基質，即使在抗體高負荷條件下。可在實驗章節中找到這類實施方式的例子。
本發明的蛋白質A汙染，是從蛋白質A親和層析柱上洗脫結合的抗體時獲得的上述蛋白質A或其功能性衍物的任何功能類型的IgG結合產物。這類蛋白質A汙染可導致例如肽鍵水解，這特別在產業化製備中由於酶的作用非常可能發生。蛋白質A層析應用於下遊加工粗純時的早期步驟，此時新鮮的產物液仍含有相當量的酶活性。在先前的離心或滲濾步驟中細胞培養基中的死亡細胞和破壞的細胞可能釋放出遊離蛋白酶。在下遊加工前或加工中，通常不能象生化研究實驗那樣為調控目的在細胞培養基中加入蛋白質酶抑制劑。例子是酚-甲基-磺醯氯(PMSF)或ε-已酸。這些化學試劑作為生物醫藥產品中的添加劑是不理想的。也有可能重組的蛋白質A功能性衍生物或其片段對蛋白酶的抗性比野生型差，這取決於蛋白質摺疊時的三級結構。連接各IgG結合功能域的胺基酸區段一旦暴露，結合功能域的總數即可能減少。各功能域之間的接觸對結構域摺疊的穩定性可能有貢獻。也可能蛋白質A或其所述功能性衍生物與抗體的結合由於結合時產生的構象變化，影響到或促進了其易受蛋白酶的作用。還有，野生型或全長蛋白質A或其功能性改造的片段可能有不同的行為表現。本發明的汙染性蛋白質A宜仍是有功能的IgG結合蛋白，因而在加入到本發明後續離子交換分離介質時能與蛋白質A純化的抗體結合。汙染的蛋白質A與純化抗體的高親和力結合，是為什麼難以分離汙染的蛋白質A與純化抗體的原因。
依據本發明，待純化的抗體在用蛋白質A親和層析純化前，宜收集自細胞培養物。所述細胞培養物宜為哺乳動物細胞培養物。哺乳動物細胞具有大的稱為溶酶體的腔室，其中含有細胞死亡時破裂或釋放出的降解酶。具體說，所述細胞培養物可以是骨髓瘤細胞培養物如NSO細胞(GalfreG和Milstein，C酶學方法，1981，73，3)。骨髓瘤細胞是漿母細胞瘤細胞，即淋巴樣細胞系的細胞。舉例的NSO細胞系是例如可從歐洲的Applied Microbiology Research，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG，UnitedKingdom的細胞培養物收藏中心(ECACC)免費得到的細胞系ECACC No，85110503。發現NSO能獲得極高的產品產量，特別是用於生產重組抗體時。還發現至少採用野生型蛋白A的重組短片段的某些蛋白A親和層析系統時，NSO細胞重複性產生汙染性蛋白質A的水平比其它類型宿主細胞高得多，所述重組蛋白A是可以單點結合的蛋白A。其例子是StreamlineTMrProtein A親和層析樹脂(Amersham Biosciences；主要是硫酯鍵單點結合的重組蛋白A，見美國專利6,399,750)。採用StreamlineTMrProteinA親和柱可能獲得每毫克抗體含約1000納克或更多的汙染性蛋白質A。本發明方法與現有技術不同在於，能在一次快速純化步驟中有效降低汙染的蛋白質A，使上述高水平降至＜1ng/mg，而純化係數約為1000x。
另一優點是，單獨或與上述章節聯合時，待用蛋白質A親和層析法純化的抗體在收穫時或在收穫後不必滅活蛋白酶，更優的是收穫後不必與至少一種外源添加的蛋白酶抑制劑混合。最優的是，所述蛋白酶抑制劑選自PMSF、Laskowski等人所述的特異性蛋白酶抑制肽(Protein inhibitors of proteinases，Ann.Rev.Biochem.49593-626)和ε-已酸。
科技文獻中對蛋白質A親和層析的操作已有廣泛描述，不需要進一步述說。與以上引用文獻不同的另一例子是Duhamel等，J Immunological Methods.31211-217，1979，從蛋白質A-Sepharose上pH梯度洗脫人IgG1、IgG2和IgG4。
宜在流經第一離子交換劑時將汙染的蛋白質A濃度降低至＜10ng/mg抗體，更宜＜4ng/mg抗體，最宜＜1ng/mg抗體，其中所述的抗體應理解為指IgG。驗證這些域值的ELISA試驗方法見實驗章節中的詳細描述；但應注意將樣品酸化至pH≤4並宜存在溫和的洗滌劑，是精確測定脫落蛋白質A量的關鍵。不必說待了解的這個域值，例如結合蛋白質A的第一離子交換劑的加載容量不能過量，否則將不可避免地導致汙染性蛋白質A的斷裂。測定蛋白質A或其片段的合適ELISA方法見美國專利4,983,722中所述。合適的抗-蛋白A抗體可從市場上，例如Sigma-Aldrich購買到。特別是採用蛋白A的衍生物時，可工程改造此衍生物使含額外的巰基，蛋白質標準品的保持很重要。可能重要的是應驗證用作定量測定測試樣品標準品的純化蛋白質A衍生物的單體特徵，因為通過-S-S-橋形成的共價二聚體或多聚體可導致錯誤的結果。如本領域常規，在還原和非還原條件下進行SDS-PAGE分析不難實行此種驗證。用DTT或β巰基乙醇還原蛋白質A衍生物-標準溶液有助於糾正ELISA-技術測定中的錯誤。
本發明方法的另一優點是，在第一離子交換柱的離子交換劑流穿液中，可回收到加載抗體量的至少70％，更優至少80％，最優至少90％。
本發明的第一離子交換劑是陰離子交換樹脂；EP-289129B1中描述了二種樹脂可結合蛋白質A。可採用柱模式以某種流速，或以分批模式操作第一離子交換劑或陰離子交換劑，即將離子交換樹脂浸泡在溫和攪拌的樣品液中，通過隨後的滲濾交換液體介質。依據本發明要考慮給定抗體的等電點pI，可以確定其加載到第一離子交換劑時的合適pH和離子強度條件，此條件應使抗體留在流穿液中，而蛋白質A汙染物結合於樹脂而從抗體中除去。如前所述本發明方法可將汙染的蛋白質A快速與抗體分離。能結合於基質載體的第一陰離子交換劑的功能基團是，例如伯、仲銨基、特別是叔、季銨基，如氨基乙基、二乙氨基乙基、三甲基氨基乙基、三甲基基氨基甲基和二乙基(2-羥丙基)-氨基乙基。陰離子交換用的合適層析載體基質是本領域已知的。例子有瓊脂糖為基礎的樹脂和珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯珠和聚苯乙烯/二乙烯基苯樹脂。最優選的離子交換劑是固定在瓊脂糖基質上的季銨陰離子交換劑，如Amersham-Biosciences/Pharmacia的Sepharose CL-6B或Sepharose Fast Flow(FF)。其例子是Amersham-Biosciences/Pharmacia的Sepharose QTM。GN TX與第一陰離子交換劑聯用的本發明抗體宜為單克隆抗體，其等電點(pI)宜至少高於上述蛋白質A親和層析步驟所用的蛋白A的pI兩個pH單位，即比之更鹼性；例如，天然蛋白質A的pI約為5.0，Streamline的重組蛋白質A的pI約為4.5，本發明優選的單克隆抗體的pI宜至少為6.5或以上，更優選項為7.0或以上，最優選pI至少為7.5或以上。應注意所述的pI是真實收穫和純化抗體的pI，而不只是從胺基酸序列簡單預測的pI。真實純化的抗體將經歷多肽骨架的進一步的修飾，如糖基化，這種修飾可能加入帶電荷部分從而改變該分子的pI。用等電聚焦(IEF)法測定抗體產品的pI時，抗體蛋白質，如單克隆抗體蛋白翻譯後加工的微小異質性，會導致各抗體糖蛋白分子產品更寬廣的pI範圍，它們在IEF凝膠中類似於塗片而非一條帶，因此至少大多數產品都有特定的數值。依據本發明在上述優選實施方式中，「抗體的pI」指抗體產品分子的pI在上述優選的pI範圍內。此說法的所有定義，如某給定步驟後抗體的回收比率％，只指符合該pI範圍的抗體的回收。
本發明的第一陰離子交換劑的操作模式，要求將蛋白質A親和層析步驟從第一陰離子交換劑的酸性平衡緩衝液，交換成中性洗脫液。在本發明的方法中，平衡緩衝液與加樣緩衝液是相同的。適合用於此目的的常用超濾裝置可購買自Amicon或Millipore，這些裝置避免了稀釋作用同時採用低分子量的多孔滲濾基質，如Sephadex G-25。本發明的平衡緩衝液所含置換鹽如氯化鈉的的鹽濃度，宜在1-150mM範圍內，更優選5-110mM，最優選20-100mM的鹽。該平衡緩衝液的pH宜在pH6.5-pH9.0範圍內，更優選在pH7.5-pH8.5範圍內，最優選在pH7.9-pH8.4範圍內。應記住，蛋白質的N-末端氨基具有約9.25的pK值，從而在較鹼性pH下，汙染的蛋白質A和任何其它已變成負電荷的蛋白質與陰離子交換劑的結合更強；對於給定的應用，加樣緩衝液的pH可能需要細調，以最佳區分給定的一對抗體和pI值不同、半胱氨酸和組氨酸側鏈含量不同(它們可能引起電荷在所選pH範圍內變化)的汙染性蛋白A之間的結合和不結合。此外，更鹼性的pH會干擾蛋白A-抗體之間的相互反應，如同離子強度增加那樣；同樣需要細調離子強度以均衡防止抗體結合與消除汙染性蛋白A結合的需要。不用說，本領域技術人員知道，緩衝液的離子強度常與pH值呈相反關係；蛋白A結合陰離子交換劑的強度取決於pH，更多的鹽可防止抗體的結合併幹擾蛋白A-抗體之間的可能相互反應。因此可理解，上述pH和置換鹽濃度的範圍是相關的pH越低，允許在上述給定範圍內實施本發明的鹽用量越少。此外，加入pH緩衝液中的鹽量可進一步提高該溶液的離子強度。可通過測定平衡緩衝液的導電率，確定離子強度。術語「導電率」指水溶液在二電極間傳導電流的能力，衡量的是帶電離子的總量和計數離子遷移。因此，隨著水溶液中存在的離子量增加，溶液的導電性也增高。導電率的測定單位是mS/cm(毫西門子/釐米)，可採用市售的，如Topac Inc.(Hingham，MA/USA)或Honeywell出售的電導計測定。本申請書中，所有的數值指25℃時的特定電導率。陰離子交換第一步所用的加樣或平衡緩衝液電導率為0.5-5mS/cm，更優選1-3mS/cm，最優選1.25-2.5mS/cm。理想的電導率約為2mS/cm。合適的緩衝鹽例子可在Good，NE(1986，Biochemistry，5467-476)中找到。例如，常用的Tris-HCl緩衝劑或磷酸氫鈉緩衝劑是適合的緩衝劑。緩衝劑的濃度通常[在例如10-40mM緩衝鹽範圍內。設計緩衝液的可用陰離子劑中，與具有低洗脫強度性能的氯化物相比，優選那些具有洗脫特異性較低強度的陰離子，它們與離子電荷密度幾乎呈相反關係，而與離子大小几乎呈正相關。陰離子洗脫液強度的經驗性比較，已在生化標準教材中列表說明。更優選本發明的緩衝劑是磷酸緩衝劑。磷酸氫鈉具有低的洗脫強度，特別是在pH8.0或以下使用時，特別是其低的離液性能更優。可進行批次操作模式，第一步陰離子交換宜採用柱操作模式。此時，可優選採用流速約10-60ml/h。加載的抗體濃度宜為每ml交換樹脂10-30mg抗體。不用說，採用極稀的樣品會使抗體產量降低，這是技術人員知道的。在加載操作時以低流速，用一倍柱體積的同一平衡緩衝液洗滌收集要純化的抗體。將流穿液的pH調至中性pH，以改善抗體蛋白的穩定性和防止凝聚和/或沉澱。
第一步陰離子交換後，抗體已可應用，或可能需要用常規純化方法進一步精加工。在另一優選實施方式中，第一步離子交換後是第二離子交換，此第二步中將抗體加載到並結合於第二離子交換介質，用加樣液以外的緩衝液，通過提高鹽濃度和/或pH洗脫抗體，成為基本上是單體的不凝聚抗體。「基本上」指該成分不到5％。單獨或與以上章節所述的優選實施方式聯用的第二離子交換劑，宜是陽離子交換劑。這種蛋白質A層析後第一離子交換劑和第二離子交換劑的聯用是新穎方法。公知細胞培養基產生的最微量汙染蛋白質具有比抗體，特別是IgG抗體低得多的pI值；陽離子交換因而能有效地去除凝聚的抗體和潛在的傳染因子如病毒包衣及抗體以外的汙染蛋白質。由於加載後，結合和從柱上洗脫操作快速，及加載量高而高效地回收了抗體，一批抗體還可反覆地循環操作，因而一輪結合和洗脫中可獲得更高的純化效率。加樣緩衝液的pH宜約4-7，更優選pH為4.01-6，最優選pH為4.02-5.5。還優選用0.1-1.2M的鹽梯度從陽離子交換劑中洗脫抗體，其中優選的鹽是鹼金屬鹽，更優選鋰鹽、鉀鹽或鈉鹽。優選用pH7-8的洗脫液最大程度去除凝聚物和最大程度減少酸性條件對抗體的損傷。任選採用pH4-7，更優選4.01-6的洗脫液以最大程度地去除蛋白A的汙染；此法可達到每毫克抗體低至＜0.4ng的汙染蛋白A。此第二步陽離子交換可賦予傳統的凝膠過濾作用，同時具有離子交換通常具有的高容量及快速操作優點。離子交換載體每毫升樹脂可加載10-30mg的抗體。在具體優選實施方式中，蛋白質A層析後相配的第一步陰離子交換和第二步陽離子交換的純化方法可得到臨床級的抗體，不需要最後的大小排斥層析(SEC)步驟，此SEC步驟的分子量截留適合將抗體凝聚物和/或抗體-蛋白A複合物與單體抗體如正常IgG相分離。
一般應注意，本發明的方法不適合針對蛋白質A表位的抗體。這種抗體不是本發明權利要求的，雖然這是本領域技術人員明知的局限性。
本發明方法最吸引人的特徵是通過陰離子交換劑，以非結合或流穿形式純化抗體，柱的容量均不限制物質的流通；柱的容量只由保留的汙染蛋白A的最小量決定。這就節約了大量加工時間和原料，同時能夠非常有效地去除蛋白A汙染。
實驗1.蛋白質A ELISA已報導了許多的蛋白質A或重組蛋白質A的ELISA測試方法(見美國專利4983722和其中的參考文獻)。對於下述所有工作，採用簡單的夾心ELISA法，其中平底96孔微滴板(NuncTM)上包被有捕獲性抗-蛋白A抗體來保留蛋白A。然後用生物增強活力化抗-蛋白A檢測抗體，再與鏈黴親和素偶聯的辣根過氧化物酶(Amersham#RPN 1231)結合，來檢測結合的蛋白質A。用於捕獲的抗-蛋白A兔抗體(針對天然金黃色葡萄球菌蛋白質A)購自Sigma-Aldrich(#P-3775)。此研究整個過程都用此抗體。檢測用的兔抗體同樣購自Sigma-Aldrich(#P-3775)。利用非特異性吸附過程包被蛋白後，利用包被的蛋白質來保留特異性捕獲蛋白A的抗體，該捕獲抗體再用生物素化兔抗蛋白A抗體和鏈黴親和素-辣根過氧化物酶檢測。採用四甲基聯苯胺作為產色底物。針對採用待測的汙染蛋白A的非常親本的蛋白A或其衍生物製作的標準曲線，讀取未知樣品的濃度。用酸性pH包被及標準品的製備證明是重要的。特別是重組的蛋白A經工程改造而攜帶了半胱氨酸殘基，如Streamline Protein ATM(Amersham-Biosciences，原先為Pharmacia)，發現標準溶液需要用還原性巰基試劑預處理以確保該蛋白質標準溶液處於單體狀態。相反，購自-些公司如Sigma-Aldrich/Switzerland(#P6031)或Pharmacia(#17-0770-01)的野生型蛋白A標準品不需要這種預處理。以下敘述的實驗顯示了從StreamlineTM基質上脫落的汙染蛋白質A，採用獲自廠商的非偶聯重組蛋白質A作為標準品。
1.1富含半胱氨酸蛋白質A-標準品的預處理購自Pharmacia/Amersham-Biosciences的凍幹純化重組蛋白A-Cys，用於StreamlineTM蛋白A親和層析(Amersham-Biosciences)柱材料。將20mg/ml蛋白質溶於含0.5M NaCl、1mM EDTA和20mM二硫赤蘚糖醇的0.1M Tris pH8.0液中，室溫培育15-30分鐘，用一次性使用的PD-10凝膠過濾柱(Amersham-Biosciences)脫鹽。用於處理標準液的所有緩衝液在包被前，應用N2-處理以防巰基氧化。蛋白質標準液最好在臨用於包被微滴板前製備。任選地，製備1mg/ml的貯藏液冰凍保存於-65℃；融化後測定加到非還原性SDS-PAGE上的等份樣品中的單體蛋白A性質。蛋白標準液的濃度用Bradford試驗測定(Bradford等，1976，Anal.Biochem.72248-254；Splittgerber等，1989，Anal.Biochem.179198-201)以及進行自動化胺基酸分析。

圖1顯示此預處理的結果，採用非還原性10％SDS-PAGE分析葡萄球菌蛋白A標準液(泳道1天然蛋白A；泳道2預處理後)和純化的非偶聯StreamlineTM重組蛋白A(由Pharmacia，現為Amersham-Biosciences惠贈；泳道4天然重組蛋白A；泳道5預處理後)。泳道1是分子量標誌，相應於垂軸上所指分子量。Pharmacia的重組蛋白A在還原為低分子量後含有一額外的半胱氨酸殘基轉移；保存了一條約34kD的帶很強，二硫橋二聚體解離後形成明顯的條帶。
1.2ELISA1.2.1樣品製備通過二步稀釋，製備含1mg/ml的蛋白A標準貯藏液的1∶200000稀釋液，提供50ng/ml的最高標準液。從其製備0.2ng/ml的稀釋液用於測定標準曲線。此外，用標準稀釋液(『加料液(spiking solution)』)來加料一式二份待測產品樣品，以排除樣品中存在的幹擾性物質。
對於最終產品樣品的測試，將每份樣品分成二等份體積500微升。一份用100ng/ml，如合適用10μg/ml的加料液加料，達到每毫克抗體最終含有10納克的蛋白A。另一半用相同體積的相同緩衝液加料；計算出產品樣品因加料液所致的稀釋係數。以下將二種類型製品稱為「加料樣品(Spiked sample)」。將7.5lg甘氨酸(鹼)、5.84g NaCl、0.5ml Triton X-100溶於1升去離子水或雙蒸水中製備樣品緩衝液。為了最佳精確測定，用本領域公知的常規ELISA法預先測定樣品中的抗體濃度。標準液加入等量的蛋白A親和常數相當的已知標準抗體，來測定酸化步驟的效應，和解決因抗體結合所引起的任何潛在性系統誤差，從而清除該試驗捕獲的蛋白質A。
酸化在450μl的加料樣品或標準液中加入200μl的0.2M檸檬酸/0.05％TritonX-100pH3.0緩衝液。所有樣品疫一式三份進行測試。製備樣品稀釋液並測試一式三份，因為對於1mg/ml-0.2mg/ml範圍內的抗體濃度該試驗運作得最佳。酸化步驟是該試驗釋放汙染的蛋白A或其片段的關鍵，否則蛋白A或其片段會結合樣品液中的過量抗體。
1.2.2用抗體包被微滴板製備由1.59g/L Na2CO3、2.93g/L NaHCO30.20g/L疊氮鈉組成的包被緩衝液。調整該緩衝液的pH至9.6。每孔加入100μl抗體液，其抗體含量足夠使蛋白A標準液不會飽和。用塑料膜封蓋板，置於潮溼箱中37℃培育過夜約18小時。用至少300μl洗滌緩衝液(NaCl 5.8g/L、Na2HPO41.15g/L、NaH2P.H2O 0.26g/L、EDTA3.7g/L、Tween-200.2g/L、丁醇10ml/L pH7.2)淋洗所有孔3次，拍幹。每孔加入250μl封閉緩衝液(含0.5％酪蛋白hammarsten的包被緩衝液)在旋轉搖動平臺上室溫培育2小時(速度120rpm)。用至少300μl洗滌緩衝液淋洗所有孔3次，拍幹。
1.2.3培育樣品並檢測將標準液和樣品液(包括加料樣品液)置入測定板中，100μl/孔。用塑料膜封蓋板，在旋轉搖動平臺上室溫培育90分鐘。所有孔用至少300μl洗滌緩衝液淋洗3次，拍幹。以預定的最佳條件稀釋生物素化兔抗蛋白質A抗體。加入100μl/孔，用塑料膜封蓋板，在旋轉平臺上室溫培育90分鐘。反覆淋洗。以預定的最佳條件，用偶聯緩衝液(Na2HPO41.15g/L、NaCl 5.84g/L、NaH2P.H2O 0.26g/L、EDTA3.73g/L、TritonX-1000.05％(v/v)、pH 7.2)稀釋鏈黴親和素-辣根過氧化物酶。加入100μl/孔，用塑料膜封蓋板，旋轉搖動室溫培育45分鐘。反覆淋洗。加入新鮮配製的四甲基聯苯胺(TMB，ICN產品#980502)底物液。如下製備底物液將10mg TMB溶於1ml DMSO中。取10μl該貯藏液和10μ1H2O2加入到2.05％(w/w)乙酸鈉水溶液中，用0.5M檸檬酸調pH至6.0。不用說，所用的製備該試驗任何試劑的水都是最高質量的水，即去離子超純水或至少是雙蒸水。
在搖動臺上室溫培育該底物液8-11分鐘。每孔加入中止液(13％H2SO4)50μl中止反應。加入中止液後10分鐘內在平板讀數分光光度儀上測定各孔450nm波長吸光度。
此ELISA的檢測限度是0.2ng/ml蛋白質A，工作範圍0.2-50ng/ml，試驗間變異係數不到10％。
圖2顯示從硫醚鍵單點結合蛋白A的StreamlineTM重組蛋白A層析柱洗脫的抗體中，脫落的重組蛋白A的水平。輪次數指用1M氯化鈉洗脫後重新平衡反覆使用的次數。而雜交瘤細胞培養物的細胞培養液的滲漏量通常為500ppm級，其它類型細胞滲漏水平高至1000ppm。表1給出了不同來源基質滲漏速率的概況；按廠商說明書進行層析。
表1
圖3還提供關於採用同一親和基質材料進行多輪蛋白A親和層析時汙染性蛋白A脫落不大為降低的資料；如以下章節2.1所述反覆使用野生型蛋白A多點結合的Sepharose FF(Amersham-Biosciences)，用上述ELISA法測定洗脫液(在其進一步加工之前)中汙染性蛋白A的水平。
2.蛋白質A和Sepharose Q層析2.1用StreamlineTM進行蛋白A親和層析離心和充分滲濾初步純化NSO骨髓瘤細胞培養物的細胞培養上清液，並超濾濃縮；還利用超濾將培養液交換成PBS pH7.5。細胞產生的抗體滴度為0.2mg/ml，總共加入1升經緩衝液交換的上清液。該單抗#5的pI為8.5。預先用10倍柱體積的50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH 8.84.3M NaCl平衡蛋白質A StreamlineTM柱(5ml體積)，流速200cm/ml。加樣時此柱操作流速為50cm/h，加載量約每毫升基質材料20mg。洗脫前用至少10倍柱體積的含200mM NaCl 0.1％、Tween-20的甘氨酸平衡緩衝液洗滌。用0.1M甘氨酸/HCl pH4.0的洗脫緩衝液獲得洗脫液。洗脫後立即將含抗體峰的組分用0.5M TrisHCl pH7.5等份水溶液中和，用Amicon滲濾裝置交換緩衝液，成為本發明後續陰離子交換步驟用的加樣/平衡緩衝液(10mM TrisHCl pH8.0，0.5mM NaCl)，防止其過久暴露於酸性pH下。如上所述測定抗體濃度和汙染的蛋白A濃度。滲濾前洗脫中的汙染蛋白A水平約為1434ng/mg抗體，滲濾後為1650ng/mg抗體。加載前依據緩衝液交換的上清液滴度，抗體回收率為81％，滲濾液的抗體濃度為3.6mg/ml。
2.2非結合模式中的Q-SepharoseFF陰離子交換步驟如下所述進一步加工章節2.1純化的抗體用10ml 0.1M NaCl液，然後2倍柱體積的0.1M Tris pH8液填裝Q-Sepharose FF柱(Amersham-Biosciences)，用10倍柱體積的10mM Tris pH8/50mM NaCl平衡，流速75cm/h。平衡後將流速降低至50cm/h。將6ml滲濾後的抗體液加入柱中，收集流穿液作進一步加工；繼續收集流穿液直到加完最初的6ml抗體液，持續到加完後或平衡緩衝液(10mM Tris pH8、50mM NaCl)，監測流穿液的280nm吸收值直到返回基線。流穿液中的抗體總共回收到23mg(87％)。測定的蛋白A汙染水平為＜3ng/mg抗體。
在Sephacryl S-300上用10mM pH7.0磷酸緩衝液、140mM NaCl，流速10cm/h進行凝膠過濾(大小排除層析SEC)進一步加工Q-Sepharose純化的抗體，加載比率為每毫升膠15mg抗體，發現基本上不會改變痕量的蛋白A汙染水平。憑經驗，可SEC將汙染性蛋白A的約30-100ng/mg水平進一步降低至約1-5ng/mg。因此對於痕量蛋白A，SEC的純化係數很低，可能是由於抗體與汙染蛋白A之間的親和性相互反應而致。然而，由於樣品的稀釋不可避免，緩慢加工時抗體蛋白的同樣衰變，SEC可獲得加入抗體量70％的回收。這意味著SEC不可避免地會導致材料的損失，同時需要更多時間。
如上所述，將分離的洗脫物用2M NaCl再平衡，重新循環使用Q-Sepharose柱。
3.蛋白質A和用後續陽離子交換步驟進行Sepharose Q純化另一實驗中，將實驗2.2的抗體以非結合模式用Q-Sepharose陰離子交換層析純化。不測試最後的SEC純化步驟，將SepharoseQ柱流穿液中收集的抗體，用SP-SepharoseFF(SP＝Sulphopropyl-)基質(購自Amersham-Biosciences)作第二步陽離子交換層析。SP-SepharoseFF允許的流速為100cm/h，加載後抗體的可重複性產率為93％，洗滌並從陽離子交換劑中洗脫抗體。為了加樣，將獲自SepharoseQ純化步驟的抗體液pH用50mM pH4.5乙酸緩衝液調至4.5-5.0。加載容量設為10mg/ml基質材料，加載導電率為17mS/cm。再用50mM pH4.5乙酸緩衝液洗滌至基線。用50mM pH4.5乙酸鈉、1M NaCl高鹽緩衝液洗脫抗體；單體抗體先洗脫，而凝聚體洗脫在高離子強度的末尾組分中。同樣可行的是在泵入該柱前採用不太陡的鹽梯度洗脫液洗脫；直接採用高鹽緩衝液可使抗體較少稀釋、隨後採樣較精確並縮短留遲在酸性液中的時間。洗脫後將酸性緩衝液迅速交換成PBS pH7.5。測定合併洗脫液中的汙染蛋白A水平＜0.4ng/mg，大小排除HPLC測定表明＞99％的抗體為單體。
4.用顧客定製的多點結合蛋白質A進行StreamlineTM蛋白A親和層析Pharmacia Biotech(現為Amersham-Pharmacia)為顧客定製提供了這種多點結合的StreamlineTM蛋白A親和基質。廠家通過將含有末端Cys殘基的同樣34kD的StreamlineTM型重組蛋白質A偶聯於同樣的Sepharose基質材料，但採用傳統的CNBr化學試劑活化和偶聯，代替環氧化物介導的活化和只偶聯-SH基團的選擇性反應條件(見廠家的產品資料)，製備了這種親和基質。重複實驗2.1的方法，測得汙染性蛋白A的水平為353ng/mg抗體。這意味著該交聯模式解釋了高容量單點結合的重組蛋白質A親和基質蛋白質脫落增加的原因；導入這種重組蛋白質A的胺基酸序列中的修飾也相當於野生型全長蛋白質A，對蛋白質脫落的增加有相當影響。
5.方法的平行比較與Miles法(美國專利4,983,722)比較Miles專利(No4,983,722)要求權利如下採用結合性DEAE Sepharose作為鹽梯度(0.025M-0.25M NaCl)洗脫的第二層析步驟，可將洗脫液中脫落的蛋白A含量減少至15ng/mg抗體以下(蛋白A的範圍是0.9-14ng/mg抗體)。
表2用單點和多點結合蛋白質A親和基質純化的6A1抗體洗脫樣品中的殘留蛋白質A比較
這些實驗的目的是證實採用較低pI的抗體進行MabSelect(新的單點結合重組蛋白質A基質)純化的結果，並直接比較非結合性Q-Sepharose方法(採用不同的平衡/加樣緩衝液)與Miles專利方法。
應用的方法純化6A1抗體(pI6.5-7.5)包括二步層析，即MabSelect蛋白質A後進行Q-Sepharose陰離子交換層析(非結合性)或DEAE Sepharose層析(結合性)步驟。見L090074和L09375。
MabSelect蛋白質A層析柱基質MabSelect重組蛋白質A(單點結合的rPA)柱尺寸1.6cm內徑×15cm床高柱體積30ml操作流速 500cm/hr(16.80ml/分)清洗 6M鹽酸胍(2倍柱體積)加載容量 35mg/ml基質平衡液50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱體積)洗脫緩衝液100mM甘氨酸pH 3.50(6倍體積)洗滌 100mM檸檬酸pH 2.1(2倍柱體積)在連接有AKTA FPLC系統的MabSelect柱(30ml)上純化含6A1抗體的培養上清液。所有條件見上表所述。用0.1M pH 3.5甘氨酸洗脫抗體。洗脫後將洗脫液pH調至7，然後將洗脫液樣品分成5等份，每份用不同緩衝液滲濾作陰離子交換層析。
第一等份用50mM TrisHCl pH 8/75mM NaCl滲濾作Q-Sepharose層析運作1。第二等份用50mM TrisHCl pH 8/100mM NaCl滲濾作Q-Sepharose層析運作2。第三等份用20mM磷酸鈉pH 6.5/80mM NaCl滲濾作Q-Sepharose層析運作3。第四和五等份用25mM TrisHCl pH 8/25mM NaCl交換評價Miles專利所述結合性DEAE-Sepharose方法。運作4和5之間的差別是，運作4中主峰收集為一個組分，用標準的磷酸緩衝鹽水滲濾然後分析，運作5的洗脫峰分組分收集用Miles專利所述方法製備的磷酸緩衝液滲濾。
5個柱各自運作條件如下Q-Sepharose層析運作1柱基質Q-Sepharose Fast Flow柱尺寸1.6cm內徑×8cm床高柱體積16ml柱準備用0.1M氫氧化鈉，150cm/hr裝填操作流速100cm/hr(3.35ml/分)清洗0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量15mg/ml基質平衡液 50mM TrisHCl pH 8.0/75mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 50mM TrisHCl pH 8.0/75mM NaCl(5倍柱體積)洗脫緩衝液 2M氯化鈉(2倍柱體積)洗滌0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)Q-Sepharose層析運作2柱基質 Q-Sepharose Fast Flow柱尺寸 1.6cm內徑×8cm床高柱體積 16ml柱準備 用0.1M氫氧化鈉，150cm/hr裝填操作流速 100cm/hr(3.35ml/分)清洗 0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量 7.5mg/ml基質平衡液 50mM TrisHCl pH 8.0/100mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 50mM TrisHCl pH 8.0/100mM NaCl(5倍柱體積)洗脫緩衝液 2M氯化鈉(2倍柱體積)洗滌 0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)Q-Sepharose層析運作3柱基質 Q-Sepharose Fast Flow柱尺寸 1.6cm內徑×8cm床高柱體積 16ml柱準備 用0.1M氫氧化鈉，150cm/hr裝填操作流速 100cm/hr(3.35ml/分)清洗 0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量 7.5mg/ml基質平衡液 20mM磷酸鈉pH 6.5/80mM NaCl加樣後洗滌 20mM磷酸鈉pH 6.5/80mM NaCl(5倍柱體積)
洗脫緩衝液 2M氯化鈉(2倍柱體積)洗滌 0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)DEAE Sepharose運作4柱基質 DEAE-Sepharose柱尺寸 1.6cm內徑×8cm床高柱體積 16ml柱準備 用平衡緩衝液，150cm/hr裝填操作流速100cm/hr(3.35ml/分)清洗0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量7.5mg/ml基質平衡液 25mM TrisHCl pH 8.6/25mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 25mM TrisHCl pH 8.6/25mM NaCl(5倍柱體積)洗脫緩衝液 25mM TrisHCl pH 8.6/25mM NaCl至25mM TrisHCl pH 8.6/250mM NaCl(10倍柱體積)洗滌2M氯化鈉(2倍柱體積)DEAE Sepharose結合法運作5(Miles方法)柱基質 DEAE-Sepharose柱尺寸 1.6cm內徑×8cm床高柱體積 16ml柱準備 用平衡緩衝液，150cm/hr裝填操作流速100cm/hr(3.35ml/分)清洗0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量7.5mg/ml基質平衡液 25mM TrisHClpH 8.6/25mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 25mM TrisHClpH 8.6/25mM NaCl(5倍柱體積)洗脫緩衝液 25mM TrisHCl pH 8.6/25mM NaCl至25mM TrisHCl pH 8.6/250mM NaCl(10倍柱體積)洗滌2M氯化鈉(2倍柱體積)
此項研究中所用的不同緩衝液性質見表3。每次陰離子交換層析運作的洗脫曲線圖見圖2-5。
在rPA ELISA中測定了5次離子交換運作產生的洗脫樣品中的蛋白質A水平，結果見表4所示。
表3此研究中所用的緩衝液
*梯度洗脫緩衝液收集重組蛋白質A ELISA中DEAE-Sepharose運作5(Miles法)諸組分洗脫圖並分析；結果見表5中所示。
表4蛋白質A ELISA的結果*其中的CV指柱體積
表5結合性DEAE-Sepharose分離(Miles法)獲得的洗脫峰各洗脫組分中的重組蛋白質A水平
在Q-Sepharose上採用20mM磷酸鈉pH 6.5/80mM NaCl緩衝液(相應於運作3)的非結合性條件下，獲得了該抗體(6A1；pI6.5-7.5)的最高回收率(85％)和重組蛋白質A的最佳清除。運作1也顯示了良好的回收(82％)和蛋白A的清除，然而此運作的洗脫體積顯著高於非結合性方法所預計的；提示抗體部分保留在柱上的此緩衝液系統中。提高NaCl濃度導致較低的蛋白A清除，因此運作3所用的緩衝液系統更適合此抗體。我們先前觀察到運作1所用的緩衝液系統更適合高pI抗體，而運作3的緩衝液系統特別適合用於中性或微酸性抗體。這些實驗具有相似的容量(7.5mg/ml樹脂)，我們預計這種非結合性方法可能採用高得多的容量(＞30mg/ml)。我們預計這種非結合性方法適用於許多陰離子交換層析，如陰離子交換膜吸附劑(如Mustang Q、InterceptQ和Sartobind Q)以外的Q-Hyper D。我們也預計，與Miles法相比較，此法更適合大規模生產，因為可採用更高容量等等。
就運作5(Miles法)而言，如表5所示，洗脫主峰中可觀察到重組蛋白A的分級。因此需要小心合併各組分以保證良好清除蛋白質A。這將影響到回收率(73％)，甚至不如用非結合性方法獲得的很好清除率。因為對於細胞系/抗體，Miles法更難達到良好清除率和高回收率，其方法可見到非常高的脫落(如通常用單點結合基質獲得的那樣)。
運作5的數據代表了Miles專利法所述的情況。這些方法的比較和獲得的數據綜合見以下表6中所示。
表6不同方法純化抗體時汙染的重組蛋白質A的水平小結 *所有實施例採用7.5mg/ml交換載量，或15mg/ml加載容量濃縮和滲濾(50mM TrisHcl/75m MNaCl pH 8.00)和陽離子交換Q(＜0.4)(50mM TrisHcl/75m MNaCl pH 8.00)注意括弧中的重組蛋白A水平為ng/mg；注意並非所有NSO克隆細胞系上清液的蛋白A汙染水平都相似。
6.高pI抗體的純化高pI抗體的純化，先用蛋白A親和層析(MabSelect-單點結合重組蛋白A基質)，繼用Q-Sepharose陰離子交換層析(在非結合性條件下，去除痕量汙染物)，再用SP-Sepharose陽離子交換層析(在結合條件下，去除凝聚物)
實驗材料和方法MabSelect 蛋白質A層析柱基質 MabSelect重組蛋白質A(單點結合的rPA)柱尺寸 1.6cm內徑×15cm床高柱體積 30ml操作流速 500cm/hr(16.80ml/分)清洗 6M鹽酸胍(2倍柱體積)加載容量 35mg/ml基質平衡液 50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 50mM甘氨酸/甘氨酸鹽pH 8.0/250mM NaCl(8倍柱體積)洗脫緩衝液 100mM甘氨酸pH 3.50(6倍體積)洗滌 100mM檸檬酸pH 2.1(2倍柱體積)在連接有AKTA FPLC系統的MabSelect蛋白A親和柱(30ml)上純化含高pI抗體的培養上清液。所用條件見上表所述。用0.1M pH3.5甘氨酸洗脫抗體。洗脫後將洗脫液pH保持在3.69(不需要調節)60分鐘(低pH病毒滅活步驟)，然後用2MTris鹼中和至pH8。在蛋白A上進行三輪循環；測定回收產物的A280nm，每輪結果見表7。
表7MabSelect蛋白A柱的回收率％
在MabSelect蛋白A親和層析後，將三輪的洗脫液合併在一起，並用Amic用Amicon的裝有10kDa Millipore膜的攪拌小室on的裝有10kDa Millipore膜的攪拌小室濃縮器將緩衝液交換成25mM Tris pH8.0(Q-Sepharose平衡緩衝液)。
Q-Sepharose層析柱基質 Q-Sepharose Fast Flow柱尺寸 1.6cm內徑×15cm床高柱體積 30ml柱準備用 0.1M氫氧化鈉，225cm/hr裝填操作流速 150cm/hr(5.0ml/分)清洗 0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量 40mg/ml基質平衡液 20mM Tris pH 8.0/100mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 20mM Tris pH 8.0/100mM NaCl(5倍柱體積)洗脫緩衝液 20mM Tris pH 8，0/2M氯化鈉(2倍柱體積)洗滌 0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)將40ml濃縮/滲濾的MabSelect蛋白A親和洗脫液加到Q-Sepharose柱上，加載量為40mg/ml基質。以非結合模式操作該柱，收集含抗體的不結合組分，A280測定此步回收率為69％，略低於這些條件下此抗體獲得的回收率。可能是FPLC加樣泵加載量因保留體積估計不夠精確所致。
Q-Sepharose後，將不結合組分濃縮到13.98mg/ml，用Amicon的裝有10kDaMillipore超濾膜的攪拌小室以SP-Sepharose平衡緩衝液(25mM pH5.0/25mMNaCl)滲濾。
SP-Sepharose層析柱基質 Q-Sepharose Fast Flow柱尺寸 1.6cm內徑×15cm床高柱體積 30ml柱準備用0.1M氫氧化鈉，150cm/hr裝填操作流速100cm/hr(3.35ml/分)清洗0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)加載容量10mg/ml基質平衡液 25mM乙酸鈉pH 5.0/25mM NaCl(8倍柱體積)加樣後洗滌 25mM乙酸鈉pH 5.0/25mM NaCl(6倍柱體積)洗脫液 25mM乙酸鈉pH 5.00/186mM NaCl(25倍柱體積)洗脫緩衝液 25mM乙酸鈉pH 5.00/2M NaCl(2倍柱體積)洗滌0.1M氫氧化鈉(2倍柱體積)將24ml緩衝液已交換的Q-Sepharose洗脫液加到SP-Sepharose柱上，加載容量10mg/ml基質。以結合模式操作此柱；分組分收集洗脫液，用GP-HPLC分析各洗脫組分圖，測定凝聚物水平，結果見表8。收集各步層析後的樣品，分析殘留的重組蛋白質A，結果見表9。
表8各層析步驟後重組蛋白質A的ELISA測定結果
表9SP-Sepharose組分的GP-HPLC分析
結論觀察了抗體峰分步洗脫時凝聚物的各組分；風表4。富含凝聚物的組分比與不含凝聚物的組分後洗脫(在洗脫峰的尾端)。從主要合併液中刪掉此尾端組分獲得99％的單體合併液，回收率仍高(＞95％)。
表4SP-Sepharose洗脫峰中高pI抗體凝聚物組分
權利要求
1.純化抗體，優選IgG抗體的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟·通過蛋白質A親和層析的方法純化抗體，其中，所述蛋白質A是天然蛋白質A或其功能性衍生物，·在允許蛋白質A或其衍生物結合的條件下將純化的抗體加載到離子交換材料上，·收集離子交換劑流穿液中的抗體，宜收集加載到該離子交換材料上抗體量的至少70％，更優收集至少80％，最優收集至少90％的抗體，而汙染性蛋白質A仍結合在離子交換材料上。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述蛋白質A是一種經工程改造而能單點結合於柱基質的重組蛋白質A。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述重組蛋白質A的胺基酸序列中含有一個半胱氨酸。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述半胱氨酸含在該重組蛋白質A的C-末端胺基酸序列至少30個胺基酸組成的區段中。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述重組蛋白質A的至少50％通過一硫醚鍵的硫原子與蛋白質A親和層析的層析載體物質結合。
6.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，離子交換劑流穿液中的蛋白質A或其功能性衍生物的濃度降低至1ng/mg IgG以下。
7.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述離子交換劑是一種陰離子交換劑。
8.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗體的pI至少為6.5或更高。
9.純化抗體的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟·通過蛋白質A親和層析的方法純化抗體，其中，所述蛋白質A是天然蛋白質A或其功能性衍生物，·在允許蛋白質A或其衍生物結合的條件下將純化的抗體加載到第一離子交換材料上，·收集離子交換劑流穿液中的抗體，宜收集加載到該離子交換材料上抗體量的至少70％，更優收集至少80％，最優收集至少90％的抗體，而汙染性蛋白質A仍結合在離子交換材料上。·再將流穿液抗體加到第二離子交換劑上，與之結合併洗脫，進一步純化抗體。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述第一離子交換劑是一種陰離子交換劑。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述抗體的pI至少為7.5或更高。
12.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述第二離子交換劑是一種陽離子交換劑。
13.如權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述純化抗體是基本上非凝聚的單體抗體。
14.如以上權利要求中任一項所述的方法，其特徵在於，所述抗體是單克隆抗體，優選IgG抗體，其中IgG抗體可以是嵌合的或CDR-移植的IgG抗體。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述IgG抗體至少具有與結合蛋白質A相關的那些抗體部分，優選與結合蛋白質A相關的部分是其Fc部分，更優選在起源於對蛋白質A有高親和力的物種和IgG亞類的IgG的Cγ2-Cy3界面區域中含有蛋白質A的結合位點。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述IgG抗體就抗體的Fc部分而言選自人IgG1、IgG2和IgG4。
17.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述抗體收集自細胞培養物，然後用蛋白質A親和層析法純化。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述抗體收集自哺乳動物細胞培養物。
19.如權利要求17或18所述的方法，其特徵在於，所述經蛋白質A親和層析法純化的抗體未作滅活蛋白酶處理，優選不與至少一種蛋白酶抑制劑混合。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述蛋白酶抑制劑選自PMSF、一種蛋白酶抑制性肽、ε-己酸和還原性巰基化合物。
全文摘要
本發明公開了一種新的從通過蛋白質A親和層析法純化的抗體中選擇性去除蛋白質A的方法。
文檔編號C07K17/02GK1771260SQ200480009347
公開日2006年5月10日 申請日期2004年3月1日 優先權日2003年2月28日
發明者J·邦納傑, A·普倫塔 申請人:英國龍沙生物醫藥股份有限公司