一種金屬螯合層析填料的製備方法

2023-05-11 21:53:26 1

專利名稱：一種金屬螯合層析填料的製備方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質純化領域，特別地，本發明涉及一種層析填料的製備方法。
背景技術：
金屬螯合層析，又名固定化金屬親合層析(Immobilized Metal Ion AffinityChromatography)，是利用特定金屬離子(如鎳離子、銅離子、鋅離子)和特定胺基酸殘基(如組氨酸、半胱氨酸、色氨酸)之間的特異性配位作用，來選擇性地分離純化蛋白質的技術，已廣泛應用於帶組氨酸標記(His-tag)的基因工程蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、血製品等的實驗室規模和工業規模純化。
目前，金屬螯合層析所用的填料普遍採用葡聚糖凝膠或瓊脂糖凝膠結合亞氨基二乙酸(IDA)或次甲基三乙酸(NTA)來製備。如中國專利第CN1280134A號公開的Sepharose6B-IDA和中國專利第CN1163902A號公開的Sephadex-IDA即是典型的IDA類金屬螯合層析填料，在填料使用壽命、降低非特異吸附等方面均已能滿足目前蛋白質純化的需要。但上述填料由於基質耐壓能力差，實際使用時線性流速僅為14-40釐米/小時。這延長了純化操作時間，限制了生產效率。由於上述兩專利分別採用Sepharose6B和Sephadex G10、Sephadex G25作為基質，使得填料的分子排阻極限只能達到4×106道爾頓(Sepharose6B)和700-5000道爾頓(Sephadex)，大分子蛋白無法進入凝膠內部與金屬離子螯合，從而導致在純化大分子蛋白(如以多聚體形式存在的包涵體蛋白)時載量明顯下降。

發明內容
為了解決現有金屬螯合層析填料流速低、分子排阻極限低的問題，本發明提供一種用交聯結構的4％瓊脂糖凝膠和亞氨基二乙酸製備金屬螯合層析填料的方法，包括下列步驟1)向交聯結構的4％瓊脂糖凝膠中逐步加入環氧氯丙烷、氫氧化鈉、硼氫化鈉，在20-30℃緩慢攪拌，反應2-3小時；隨後升溫至60-65℃繼續緩慢攪拌，反應2-3小時；
2)向經步驟1)處理得到的瓊脂糖凝膠中逐步加入碳酸鈉、亞氨基二乙酸、硼氫化鈉，在60-65℃水浴中緩慢攪拌，反應10-20小時；3)將經步驟2)處理得到的瓊脂糖凝膠依次用20-30℃蒸餾水、10％乙酸、蒸餾水洗滌，加20％乙醇保存，得到金屬螯合層析填料。
本發明採用交聯結構的4％瓊脂糖凝膠為填料基質，包括Sepharose 4 Fast Flow、Sepharose CL-4B等，上述基質能保證填料的高流速，又能提高填料的分子排阻極限。由於上述凝膠瓊脂糖含量為4％，凝膠顆粒孔徑較大，可容許生物大分子通過，故分子排阻極限可達20×106道爾頓，是中國專利第CN1280134A號所公開的基質的5倍。同時，由於採用了交聯結構，凝膠的強度得到保證，線性流速可達26-200釐米/小時(具體流速由基質凝膠而定)，較中國專利第CN1280134A號所公開的基質提高85％到14倍。上述或類似的瓊脂糖凝膠可從Pharmacia等公司購得。由於交聯結構的4％瓊脂糖基質的孔徑大小、親水性等與現有金屬螯合層析填料所用基質不同，需要專門的結合IDA的工藝，以確保足夠的結合量和結合強度。
為達到上述目的，本發明採用階段升溫的活化方式和60-65℃恆溫接臂工藝。首先，在較低溫度下(20-30℃)向凝膠中逐步添加環氧氯丙烷，使環氧氯丙烷逐步擴散入凝膠內部，使兩者能充分接觸活化。在此階段，凝膠內、外表面的羥基基團與環氧氯丙烷發生取代反應，形成了凝膠-環氧丙烷的活性中間體。由於交聯結構的4％瓊脂糖基質結構緊密，此階段活化反應並不完全，凝膠上仍存在部分未活化羥基。待環氧氯丙烷全部添加完畢後升溫至60-65℃繼續反應2-3小時，保證活化完全，特別是讓凝膠孔徑內部的羥基也參與反應。隨後，在60-65℃條件下進行接臂，通過提高溫度來增強亞氨基二乙酸的分子熱運動，提高其和凝膠-環氧丙烷活性中間體結合的效率。在接臂過程中使用的碳酸鈉用於控制pH值鹼性範圍內。本發明最優的pH範圍在8～11之間，提高pH值有利於增加IDA與凝膠的結合速率，降低pH值有利於提供溫和的反應條件。在整個反應過程中使用硼氫化鈉來提供還原性氛圍。
本發明中，所加入的亞氨基二乙酸與4％瓊脂糖凝膠的質量比為1∶7.5-1∶8.5。
接上亞氨基二乙酸的凝膠依次用20-30℃蒸餾水、10％乙酸、蒸餾水洗滌，去除游離的亞氨基二乙酸，加20％乙醇保存，即得到金屬螯合層析填料。使用時取所需體積的填料，裝入層析柱，洗去殘留乙醇後，用2-3倍體積的金屬硫酸鹽溶液(如硫酸鎳等)緩慢流過後，再依次用2倍體積10％乙酸、5倍體積純化緩衝液平衡，即可上樣。吸附於填料上的蛋白質可用200mM咪唑洗脫。
本發明所製備的填料，提高了線性流速，可達到26-200釐米/小時；分子排阻極限增大，達到20×106道爾頓。從而提高了純化大分子蛋白似的載量，能夠實現工業化規模的蛋白質純化。
本發明中主要的化學反應如下，■代表凝膠基質1)活化 2)接臂具體實施方式
下面結合具體的實施方式對本發明作進一步的詳細描述。但以下僅是本發明的較佳實施例，本發明的內容並不受下列較佳實施例的限制。
實施例1取吸乾的Sepharose CL-4B 40g，放入200ml燒杯內，加入2M氫氧化鈉20ml、環氧氯丙烷2ml、硼氫化鈉75mg，充分混合後置於恆溫磁力攪拌器上，恆溫25℃，緩慢攪拌2小時。攪拌期間每隔12分鐘，添加入2M氫氧化鈉2ml、環氧氯丙烷1ml，總計添加10次，累計添加2M氫氧化鈉20ml、環氧氯丙烷10ml。之後升溫至65℃，繼續恆溫緩慢攪拌2小時。將反應產物轉移至砂芯漏鬥中，用真空泵抽乾活化後的Sepharose CL-4B。再將Sepharose CL-4B轉移到燒杯內，加2M碳酸鈉50ml、亞氨基二乙酸5g、硼氫化鈉60mg，充分混合後置於恆溫磁力攪拌器上，恆溫60℃，緩慢攪拌15小時，反應體系pH值9。攪拌結束後，將反應產物轉移至砂芯漏鬥中，依次用20-30℃蒸餾水5L、10％醋酸500ml洗滌，然後用蒸餾水衝洗至pH中性。此即製備好的Sepharose CL-4B-IDA金屬螯合層析填料。如果不立即使用，則將填料轉移至塑料瓶內，加入20％酒精保存。
實施例2取吸乾的Sepharose 4 Fast Flow 40g，放入200ml燒杯內，加入2M氫氧化鈉20ml、環氧氯丙烷2ml、硼氫化鈉80mg，充分混合後置於恆溫磁力攪拌器上，恆溫30℃，緩慢攪拌3小時。攪拌期間每隔12分鐘，添加入2M氫氧化鈉2ml、環氧氯丙烷1ml，總計添加10次，累計添加2M氫氧化鈉20ml、環氧氯丙烷10ml。之後升溫至65℃，繼續恆溫緩慢攪拌3小時。將反應產物轉移至砂芯漏鬥中，用真空泵抽乾活化後的Sepharose 4Fast Flow。再將Sepharose 4 Fast Flow轉移到燒杯內，加2M碳酸鈉50ml、亞氨基二乙酸5g、硼氫化鈉70mg，充分混合後置於恆溫磁力攪拌器上，恆溫60℃，緩慢攪拌20小時，反應體系pH值10。攪拌結束後，將反應產物轉移至砂芯漏鬥中，依次用20-30℃蒸餾水5L、10％醋酸500ml洗滌，然後用蒸餾水衝洗至pH中性。此即製備好的Sepharose 4 FastFlow-IDA金屬螯合層析填料。如果不立即使用，則將填料轉移至塑料瓶內，加入20％酒精保存。
實施例3取製備好的金屬螯合層析填料Sepharose 4 Fast Flow-IDA 5ml，轉移至內徑1.6cm的層析柱內，先用10ml磷酸鹽緩衝液(pH7.4)洗去填料內殘留乙醇，然後依次用15ml、200mM硫酸鎳、10ml、10％乙酸、50ml磷酸鹽緩衝液(pH7.4)洗柱。將帶有pET32a質粒的大腸桿菌DH5α表達後菌體裂解液上樣(pET32a和DH5α均可從Novagen公司購得)，待穿過峰出盡後用200mM咪唑洗脫，流速30釐米/小時，所得洗脫峰為純的帶有His-Tag的硫氧還蛋白。另取同等體積的帶有pET32a質粒的大腸桿菌DH5α表達後菌體裂解液，再次上樣，待穿過峰出盡後用200mM咪唑洗脫，流速150釐米/小時，所得洗脫峰為帶有His-Tag的硫氧還蛋白，純度與30釐米/小時純化所得硫氧還蛋白相同。
權利要求
1.一種金屬螯合層析填料的製備方法，包含下列步驟1)向交聯結構的4％瓊脂糖凝膠中逐步加入環氧氯丙烷、氫氧化鈉、硼氫化鈉，在20-30℃條件下緩慢攪拌，反應2-3小時；隨後升溫至60-65℃繼續緩慢攪拌，反應2-3小時；2)向經步驟1)處理得到的瓊脂糖凝膠中逐步加入碳酸鈉、亞氨基二乙酸、硼氫化鈉，在60-65℃水浴中緩慢攪拌，反應10-20小時；3)將經步驟2)處理得到的瓊脂糖凝膠依次用20-30℃蒸餾水、10％乙酸、蒸餾水洗滌，加20％乙醇保存，得到金屬螯合層析填料。
2.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述瓊脂糖凝膠為Sepharose4 Fast Flow或Sepharose CL-4B。
3.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述步驟2)中加入的亞氨基二乙酸與4％瓊脂糖凝膠的質量比為1∶7.5-1∶8.5。
4.如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，步驟2)反應體系中的pH值範圍為8-11。
全文摘要
本發明提供了一種金屬螯合層析填料的製備方法，是通過將交聯結構的4％瓊脂糖凝膠和亞氨基二乙酸結合而成。所獲得的填料較現有類似產品，在流速和分子排阻極限上具有顯著優勢，適合應用於工業化規模的蛋白質純化。
文檔編號B01D15/08GK1525165SQ0311551
公開日2004年9月1日 申請日期2003年2月25日 優先權日2003年2月25日
發明者黃竹, 翁辰川, 黃 竹 申請人:上海實業科華生物技術有限公司