一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法
2023-05-11 13:27:46
專利名稱：一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法
一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法
技術領域：
本發明涉及發酵與生物質能源技術領域，具體地說，是一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法。
背景技術：
農作物秸稈等纖維質原料是世界上最豐富的可再生資源，利用纖維質原料發酵生 產酒精，用於車用燃料乙醇是一個極具前景的產業。秸稈作為一種豐富的農業副產物，成本 低廉，分布廣泛，以它作為原料能夠降低生物乙醇的原料成本，擴大乙醇生產規模。纖維質原料發酵生產乙醇一般包括原料的預處理、酶水解、發酵、提純等步驟。現 有主要的預處理方法包括稀酸預處理和蒸汽汽爆等技術，原料預處理能夠破壞纖維質原料 對酶解過程的抵抗性，有利於酶水解的進行，但是預處理過程會產生大量的抑制物，這些抑 制物抑制了發酵微生物在纖維質原料水解液中的生長以及乙醇發酵。為了能夠有效的進行 秸稈乙醇發酵，研究者首先提出通過脫除水解液中抑制物的方式來提高發酵效率，包括鹼 中和、離子交換、溶劑萃取等方法，這些方法使得過程成本提高，操作複雜，也加大後續乙醇 分離的難度。另一種途徑即把發酵微生物培養在含纖維素水解液清液的培養基中，進行馴 化培養，使菌種具備對抑制物的耐受性，再用於乙醇的同步糖化發酵。但是，無論水解液的 脫毒處理或菌種的馴化培養，都需要液固分離設備，這不僅增加設備成本，在液固分離和脫 毒過程都會導致可發酵糖的損失，此外也增大染菌的風險。這就需要一種能夠實現低成本 培養乙醇發酵種子液的方法，在工藝上簡單可行，同時也能夠起到馴化發酵微生物的目的。
發明內容本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種以固體秸稈為碳源培養發酵種 子液的方法。本發明的構思以固體秸稈類物質為原料發酵生產燃料乙醇過程中種子培養液的 低成本培養方法，適合於以固體秸稈類物質為原料進行乙醇發酵或其它生物基產品發酵的 工業發酵菌種種子培養，菌種在多級培養過程中，向培養基中添加預處理後的固體秸稈作 為碳源，同時加入纖維素酶和營養鹽，使種子在培養階段即採用同步糖化與發酵的方式生長。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的—種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其具體步驟為(1)發酵菌種的活化從菌種保藏平板、保藏斜面或冷凍甘油保藏管保存的菌種接種於合成培養基，培 養溫度25 45°C，優選溫度為30°C;轉速50 500rpm，優選轉速為150rpm ；培養12 36 小時，OD600值達到4 16 ；在合成培養基中，葡萄糖濃度10 100g/L，營養鹽濃度是KH2PO4或K2HPO4O. 5 10g/l，MgSO4 · 7H20 0. 1 5g/l，(NH4)2SO4O. 5 10g/l，酵母萃取粉或玉米漿 0. 1 IOg/1 ；所述的菌種包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、樹幹畢赤酵母(Pichia stipitis)、克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)菌株，以及通過誘變、基因工程等操作 改造上述菌株以及上述菌株的兩種或數種的混合發酵；優選為釀酒酵母；其中誘變篩選 的菌株是指通過化學、物理以及射線等誘變改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通過轉 入質粒、同源重組及改善代謝路徑後的可用於代謝六碳糖或五碳糖發酵生產乙醇的菌株；OD600值是指含有菌體的溶液在600nm波長處的吸光值；(2)培養基中添加預處理的固體秸稈進行同步糖化馴化培養種子活化的種子液的體積百分數為5 20%接種於固體秸稈的混合培養基中，在混合 培養基中固體秸稈的質量百分數為3 30%，加入纖維素酶和營養鹽，轉速50 500rpm， 溫度25 45°C，培養12 36小時；優選條件為轉速150rpm，溫度37°C，培養18小時；得 到發酵菌種的漿液；混合培養基是指以0. 1 50g/L葡萄糖溶液調整固體秸稈固含量的培養基，其pH 為2. O 8. 0，優選pH為5. O ；所述的纖維素酶選自纖維素酶或者纖維二糖酶中的一種或兩者的混合酶液，加酶 量為1 30FPU/gDM，FPU指纖維素酶液中的纖維素酶濾紙酶活，DM是指秸稈類物質乾重； 其中，纖維素酶液包括商品化纖維素酶液以及用黴菌等微生物培養獲得的具有纖維素酶活 的培養液；調整PH的溶液選自硫酸、氫氧化鈣溶液、氫氧化鈉溶液、氨水中的一種或者兩種 以上混合溶液；所述的營養鹽為KH2PO4 或 K2HPO4O. 5 10g/L，MgSO4 · 7Η200· 1 5g/L， (NH4)2SO4O. 5 10g/l，酵母萃取粉或玉米漿0. 1 10g/L ；所述的固體秸稈選自固體秸稈原料或者固體秸稈處理物；其中所述的固體秸稈原料選自玉米秸稈、麥秸、稻草、木屑、能源植物或者林業廢棄物 中的一種，優選玉米秸稈；所述的固體秸稈處理物選自採用稀酸、蒸汽爆破、氨氣爆破、生物法方式預處理後 的玉米秸稈、麥秸、稻草、木屑、能源植物、林業廢棄物中的一種，優選蒸汽汽爆預處理的玉 米禾吉稈；(3)種子液的多級擴大培養過程菌種在多級培養過程中，直接向培養基中添加預處理後的固體秸稈作為碳源，根 據發酵罐的裝液量大小，擴大培養種子液的體積，將步驟(2)獲得的種子液接種於含固體 秸稈的培養基，在培養基中固體秸稈的質量百分數為3 30%，加入纖維素酶和營養鹽，在 搖瓶或種子罐中擴大培養種子，培養轉速100 500rpm，溫度25 45°C，培養12 36小 時，獲得種子培養液；種子液多級培養過程中培養級數涵蓋1級到6級，各培養級間接種量 的體積百分比為5 20%，接種於發酵罐的種子液包括從1級到6級培養種子獲得的任一 級的培養液；得到含發酵菌種的漿液；(4)接種與發酵將步驟⑵或(3)培養獲得的含發酵菌種的漿液接種於高固含量的發酵罐進行同 步糖化發酵製備乙醇或其他生物基產品。
與現有技術相比，本發明的積極效果是(1)本發明基於低固體含量同步糖化培養種子，在種子多級培養過程中，向培養基 中添加預處理後的玉米秸稈作為碳源，提高了種子在纖維乙醇發酵過程中的耐受性，適合 於高固體含量乙醇同步糖化發酵過程接種，發酵周期縮短，提高了乙醇產率和得率，適合於 工業應用；(2)本發明基於低固體含量同步糖化培養種子，與採用合成培養基或與採用秸稈 水解液清液獲得的種子培養液相比，避免了固液分離過程可發酵糖的損失，消除了固液分 離獲得水解液清液過程中的染菌風險，提高了原料的利用率，能夠實現纖維質原料發酵生 產乙醇過程的可行性；(3)同現有技術相比，本發明沒有液固分離和水解液脫毒過程，減少了固定設備投 資，同時採用低成本營養鹽以及易於操作的工藝過程，充分利用水解液資源，降低了生產成 本，適合於大規模和工業化生產。
具體實施方式以下提供本發明一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法的具體實施方式
。實施例1在IOOmL搖瓶中加入20mL合成培養基做菌種的活化，菌種為釀酒酵母；種子培養 第二步，在250mL搖瓶中用20g/L的葡萄糖溶液調整汽爆預處理秸稈含量為15%，培養溫 度30°C，150rpm;加酶量5FPU/g DM，培養18小時。同步糖化發酵在發酵罐中進行，固體含 量為 25%，加酶量 7FPU/gDM，營養鹽濃度分別為 KH2P042g/L，MgSO4 · 7H202g/L，(NH4)2SO4Ig/ L，酵母萃取粉lg/L，50°C溫度預糖化8小時；接種量10%，接種後調整發酵溫度到37°C，發 酵48小時，乙醇濃度46g/L，得率62%。實施例2在IOOmL搖瓶中加入20mL合成培養基做菌種的活化，菌種為管囊酵母菌種；種子 培養第二步，在250mL搖瓶中用20g/L的葡萄糖溶液調整汽爆預處理秸稈含量為10%，培 養溫度 37°C，150rpm ；加酶量 15FPU/gDM ；營養鹽濃度分別為 KH2P04lg/L，MgSO4 · 7H200. 5g/ L，(NH4)2S04lg/L，酵母萃取粉2g/L ；同步糖化發酵在發酵罐中進行，固體含量為27%，加酶 量30FPU/gDM，預糖化溫度為50°C，8小時，接種後調整溫度到37°C，發酵72小時，乙醇濃度 55g/L，得率 60%。實施例3在IOOmL搖瓶中加入20mL合成培養基做菌種的活化，菌種為樹幹畢赤酵母菌；種 子培養第二步，在250mL搖瓶中用20g/L的葡萄糖溶液調整汽爆預處理秸稈含量為5%，培 養溫度 37°C，150rpm ；加酶量 15FPU/gDM ；營養鹽濃度分別為 KH2P04lg/L，MgSO4 · 7H200. 5g/ L，(NH4) 2S04lg/L，玉米漿0. 5g/L ；種子培養第三步，在250mL搖瓶中用水調整汽爆秸稈含量 為10%，加酶量15FPU/g DM;同步糖化發酵在發酵罐中固體含量為29.6%，加酶量7 ~8 DM，預糖化溫度50°C，12小時，接種量10%，接種後調整溫度到30°C，發酵72小時，乙醇濃 度 53g/L，得率 59. 1%0實施例4在IOOmL搖瓶中加入20mL合成培養基進行菌種的活化，菌種為運動發酵單胞菌；種子培養第二步，用10g/L的葡萄糖溶液調整汽爆預處理秸稈含量為10%，加酶量15FPU/gDM;種子培養第三步，在250mL搖瓶中用水調整汽爆預處理秸稈固含量為10%，培養溫度 37°C，轉速250rpm ；加酶量30FPU/gDM ；同步糖化發酵在發酵罐中進行，加酶量30FPU/gDM， 營養鹽濃度分別為KH2P042g/L，MgSO4 · 7H202g/L, (NH4) 2SO4Ig/L，酵母萃取粉lg/L，固體含 量為28.9%，調整溫度到35°C，發酵72小時，乙醇得率75%。此外，本發明所涉及的菌種不限於實施例所提供的菌種，還可以為釀酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、iW ■ _ · (Pachysolen tannophilus) > W zF ^1F 母(Pichia stipitis)、克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、運動發酵單胞菌 (Zymomonas mobilis)菌株，以及通過誘變、基因工程等操作改造上述菌株以及上述菌株的 兩種或數種的混合發酵；其中誘變篩選的菌株是指通過化學、物理以及射線等誘變改造 的菌株；基因工程操作的菌株是指通過轉入質粒、同源重組及改善代謝路徑後的可用於代 謝六碳糖或五碳糖發酵生產乙醇的菌株；此外，本發明所涉及的固體秸稈不限於玉米秸稈，還可以為麥秸、稻草、木屑、能源 植物或者林業廢棄物中的一種；固體秸稈處理物選自採用稀酸、蒸汽爆破、氨氣爆破、生物 法方式預處理後的麥秸、稻草、木屑、能源植物、林業廢棄物中的一種。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為 本發明的保護範圍內。
權利要求
一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於，其具體步驟為(1)發酵菌種的活化從菌種保藏平板、保藏斜面或冷凍甘油保藏管保存的菌種接種於合成培養基，培養溫度25～45℃；轉速50～500rpm；培養12～36小時，OD600值達到4～16；在合成培養基中，葡萄糖濃度10～100g/L，營養鹽濃度是KH2PO4或K2HPO40.5～10g/l，MgSO4·7H2O 0.1～5g/l，(NH4)28O40.5～10g/1，酵母萃取粉或玉米漿0.1～10g/l；所述的菌種包括釀酒酵母、管囊酵母、樹幹畢赤酵母、克魯維酵母、運動發酵單胞菌菌株，以及通過誘變、基因工程等操作改造上述菌株以及上述菌株的兩種或數種的混合發酵；其中誘變篩選的菌株是指通過化學、物理以及射線誘變改造的菌株；基因工程操作的菌株是指通過轉入質粒、同源重組及改善代謝路徑後的用於代謝六碳糖或五碳糖發酵生產乙醇的菌株；OD600值是指含有菌體的溶液在600nm波長處的吸光值；(2)培養基中添加預處理的固體秸稈進行同步糖化馴化培養種子活化的種子液的體積百分數為5～20％接種於固體秸稈的混合培養基中，在混合培養基中固體秸稈的質量百分數為3～30％，加入纖維素酶和營養鹽，轉速50～500rpm，溫度25～45℃，培養12～36小時，得到發酵菌種的漿液；混合培養基是指以0.1～50g/L葡萄糖溶液調整固體秸稈固含量的培養基，其pH為2.0～8.0；所述的纖維素酶選自纖維素酶或者纖維二糖酶中的一種或兩者的混合酶液，加酶量為1～30FPU/gDM，FPU指纖維素酶液中的纖維素酶濾紙酶活，DM是指秸稈類物質乾重；其中，纖維素酶液包括商品化纖維素酶液以及用黴菌等微生物培養獲得的具有纖維素酶活的培養液；調整pH的溶液選自硫酸、氫氧化鈣溶液、氫氧化鈉溶液或者氨水中的一種或者兩種以上混合溶液；所述的營養鹽為KH2PO4或K2HPO40.5～10g/LL，MgSO4·7H2O 0.1～5g/L，(NH4)2SO40.5～10g/l，酵母萃取粉或玉米漿0.1～10g/L；所述的固體秸稈選自固體秸稈原料或者固體秸稈處理物；(3)種子液的多級擴大培養過程將步驟(2)獲得的種子液接種於含固體秸稈的培養基，在培養基中固體秸稈的質量百分數為3～30％，加入纖維素酶和營養鹽，在搖瓶或種子罐中擴大培養種子，培養轉速100～500rpm，溫度25～45℃，培養12～36小時，獲得種子培養液；種子液多級培養過程中培養級數涵蓋1級到6級，各培養級間接種量的體積百分比為5～20％，接種於發酵罐的種子液包括從1級到6級培養種子獲得的任一級的培養液，得到含發酵菌種的漿液；(4)接種與發酵將步驟(2)或(3)培養獲得的含發酵菌種的漿液接種於高固含量的發酵罐進行同步糖化發酵製備乙醇或其他生物基產品。
2.如權利要求1所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 在所述的步驟(1)中，菌種接種於合成培養基，培養溫度為30°C，轉速為150rpm。
3.如權利要求1所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 在所述的步驟(1)中，所述的菌種為釀酒酵母。
4.如權利要求1所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 在所述的步驟(2)中，轉速為150rpm，溫度為37°C，培養為18小時。
5.如權利要求1所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 在所述的步驟(2)中，混合培養基的pH為5.0。
6.如權利要求1所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 在所述的步驟(2)中，所述的固體秸稈原料選自玉米秸稈、麥秸、稻草、木屑、能源植物或者 林業廢棄物中的一種。
7.如權利要求6所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 所述的固體秸稈原料選自玉米秸稈。
8.如權利要求1所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 在所述的步驟(2)中，所述的固體秸稈處理物選自採用稀酸、蒸汽爆破、氨氣爆破、生物法 預處理後的玉米秸稈、麥秸、稻草、木屑、能源植物或者林業廢棄物中的一種。
9.如權利要求8所述的一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其特徵在於， 所述的固體秸稈處理物選自蒸汽汽爆預處理的玉米秸稈。
全文摘要
本發明涉及一種以固體秸稈為碳源培養發酵種子液的方法，其具體步驟為，(1)發酵菌種的活化從菌種保藏平板、保藏斜面或冷凍甘油保藏管保存的菌種接種於合成培養基；(2)培養基中添加預處理的固體秸稈進行同步糖化馴化培養種子；(3)種子液的多級擴大培養過程；(4)接種與發酵將步驟(2)或(3)培養獲得的含發酵菌種的漿液接種於高固含量的發酵罐進行同步糖化發酵製備乙醇或其他生物基產品。本發明的優點消除了固液分離獲得水解液清液過程中的染菌風險，提高了菌株對抑制物和固體基質的耐受性，過程成本降低，發酵周期縮短，具有很好的工業化應用前景。
文檔編號C12R1/645GK101824395SQ200910047148
公開日2010年9月8日 申請日期2009年3月6日 優先權日2009年3月6日
發明者張建, 朱培, 楚德強, 畢德璽, 蘆晨陽, 範超, 鮑傑 申請人:華東理工大學