蜈蚣酶解物抗血栓性多肽的製作方法

2023-05-12 02:40:41 3

專利名稱：蜈蚣酶解物抗血栓性多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬生物化學中的多肽藥物技術領域。
背景技術：
隨著社會人口的老齡化和生活水平的不斷提高，高血脂症、動脈粥樣硬化及由之演變而來的心、腦血管血栓栓塞性疾病的發病率逐年增加。血栓性疾病是一種常見病，發病率約為千分之二，是由於血栓引起的血管腔狹窄與閉塞，使主要器官發生缺血和梗塞而引起機能障礙的各種疾病。其中血液凝固、血小板聚集、紅細胞壓積增高等，都是形成血栓的幾種直接原因。這是一類嚴重影響健康的疾病，市場上對於預防和治療血栓性疾病藥物的需求量呈現出逐年增長的勢頭。因此，治療此類疾病的藥品的研究開發就顯得尤為重要。抗血檢形成的重要機制包括抑制凝血系統的活化和對血小板聚集的抑制。凝血過程由於啟動環節不同而分為內源性與外源性凝血兩條途徑，無論內源性還是外源性凝血途徑最終都通過激活凝血因子使纖維蛋白原變為纖維蛋白，從而發生凝血。抑制凝血因子及纖溶作用能有效的抑制血栓的生成。檢測抗血栓物質對凝血因子的抑制和纖溶活性對篩選抗血栓藥物有著重要的意義。血小板對止血和血栓形成有著重要的作用，血小板聚集是血栓形成的必經途徑，具有和依替巴肽類似抗血小板聚集的六肽能夠抑制血小板聚集，能同時減少血栓的生成，明顯的延長CT，TT, P T，PRT和APTT。血小板抑制劑能有效的抑制和治療心血管疾病。蜈蚣中含有抗血栓組分，代龍等對蜈蚣抗血栓作用進行了研究，比較了 6種不同提取工藝對凝血酶源時間(PT)、纖溶活性(FA)、大鼠凝血時間(CT)及靜脈血栓重量(TW)的影響，發現6種工藝的PT、FA、CT、TW4項指標與空白對照組相比較均有明顯差異。You等從韓國產蜈蚣中分離純化出一種具有纖維蛋白溶解活性的絲氨酸蛋白酶，scolonase，其分子量為25KD，等電點4.8。結構解析結果表明該酶由244個胺基酸組成。現代藥理研究表明，動物類藥材發揮作用的主要為其小肽類成分。鑑於動物類蛋白質、粘多糖等大分子物質只有到達胃腸道後受消化酶、酸、鹼等作用，方可被酶解或水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分子物質，吸收人血而發揮藥效，故用胃蛋白酶提取方法模擬體內消化過程，以得到蜈蚣在體內產生藥效的小分子肽。本發明基於上述研究，從蜈蚣毒素中分離純化出一個由七個胺基酸組成的多肽，通過測定其APTT和PT時間，並且通過生色底物法來確定其抗凝活性。

發明內容

本發明涉及一種對內源凝血途徑和血小板抑制作用，從而抗血栓的多肽，該多肽是蜈蚣酶解，經超濾得到小分子，用凝膠層析、反相高效液相色譜分離純化後所得。本發明所提供的蜈蚣酶解物純化的抗血栓多肽是利用Edman降解法測得其胺基酸序列的，序列為 Asp-Leu-Asp-Hi s-Tyr-Ser-Phe。本發明所提供的蜈蚣毒素抗凝多肽，經質譜測定期分子量為895.4Da。
本發明所提供的多肽，經測試具有抗凝活性:在0.2mg/mL-lmg/mL範圍內對血小板聚集的抑制作用具有劑量依賴性；在0.2mg/mL-lmg/mL範圍內能延長APTT時間，也呈現劑量依賴性。
具體實施例方式1、蜈蚣酶解物抗血栓活性多肽的製備a、取70g蜈蚣，由南京先聲藥店提供，加入20倍量人工胃液，密閉，於37°C恆溫水浴作用30min後,加入4.0 %胃蛋白酶水解4h,將酶解液置於100°C恆溫水浴作用IOmin,冷卻至室溫，以8000r/min離心15min,取上清液，，將之前得到的產物用0.45um濾膜過濾,利用IOOOODa的濾膜將大小分子分開，凍幹。b、上述溶液樣品通過葡聚糖凝膠Sephadex G-50純化,柱高100cm,直徑2.6cm。用去離子水平衡後，上樣lmL，流動相去離子水，流速為0.6ml/min。每管收集
4.8ml，共收集180管。根據214nm吸收值合併組分。C、活性組分C用C8-HPLC柱純化，柱高25cm，直徑0.46cm。用10%乙腈(含0.1%了 4)201^平衡後，0.2511^樣品上樣，先用10%乙腈(0.1%TFA) IOmL洗脫，然後用90%乙腈(0.1% TFA) 30mL進行0-30%梯度洗脫，流速為lml/min，檢測波長214nm和280nm。收集活性峰c_10，冷凍乾燥。下列附圖用於說明本發明的具體實施方案，而不用於限定由權利要求書所界定的本發明發明範圍。


:圖1A為經凝膠色譜分離純化的色譜圖:活性峰為峰C。圖1B為經RP-HPLC分離純化的色譜圖:活性峰為c-10。2、蜈蚣酶解物抗血栓多肽的測序本發明所提供的蜈蚣毒素抗凝多肽用Edman降解法進行測序。Edman降解法是一種對蛋白質進行測序的化學方法，是從多肽鏈游離的N末端測定胺基酸殘基序列的過程。N末端胺基酸殘基被苯異硫氰酸酯修飾，然後從多肽鏈上切下修飾的殘基，再經過層析鑑定，餘下的多肽鏈(少了一個殘基)被回收再進行下一輪降解循環。整個測序過程是通過自動測序儀進行的。本發明所提供的多肽經Edman降解法測序，序列為Asp-Leu-Asp-His—Tyr—Ser—Phe。3、蜈蚣酶解物抗血栓多肽的APTT和PT活性測定a、小鼠的摘眼球取血離心管事先用3.8%的枸櫞酸鈉溶液潤溼，並放入約100 μ I枸櫞酸鈉溶液，備用；左手姆、食指抓取小鼠雙耳及頸後皮膚，小指固定尾部；中指將小鼠左側前肢輕壓在胸骨心臟部位，無名指按在腹部，捻動拇指，輕壓取血側眼部皮膚，使眼球充血突出；用彎頭鑷夾取眼球；根據需要捻動拇指與食指的方向，使血液從眼眶以不同流速垂直流入離心管；同時用左手中指輕按小鼠心臟部位，以加快心臟泵血速度；當血液流盡時，用脫白法處死小鼠。

b、分離貧血小板血漿(PPP)將小鼠血液與枸櫞酸鈉溶液混合均勻，配平後放入離心機，轉速為3000r/min，離心時間為15min，離心完成後，吸取上清，分離得到貧血小板血漿(PPP)。
c、APTT 和 PT 的測定APTT試劑在37°C下預熱不超過15min，CaCl2溶液37°C下預溫15min。每個EP管根據分別加入50 μ I的PPP>50 μ I的樣品溶液、100 μ I的APTT試劑於37°C下預熱3min,加入150 μ ICaCl2溶液，測定凝固時間。PT試劑預熱時間不低於IOmin但不高於30min，在EP管中加入25 μ 1ΡΡΡ、25 μ I樣品於37°C下預熱3min，加入50 μ IPT試劑，測定凝固時間。樣品的水溶液濃度為0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、lmg/ml,對照組為
去離子水。每個濃度測定三次。對該多肽進行APTT和PT活性的測定，蜈蚣毒素抗凝多肽能夠延長APTT，對PT沒有延遲作用，且呈現劑量依賴性。其結果如下:蜈蚣毒素抗凝多肽APTT活性分析
權利要求
1.一種蜈蚣酶解物中的抗血栓多肽，其特徵在於以蜈蚣全蟲為原材料提取，由Asp-Leu-Asp-His-Tyr-Ser-Phe 組成的七妝，分子量為 895.4Da。
2.根據權利要求1所述蜈蚣酶解物抗血栓多肽的應用，其特徵在於該多肽具有抗凝作用，能夠延長APTT時間，對血小`板聚集具有抑制作用，可作為在抗血栓藥物製備中的應用。
全文摘要
本發明公布從蜈蚣酶解物中分離出的多肽，並對其抗血栓性進行測定。應用凝膠層析和反相高效液相色譜等分離方法從蜈蚣酶解物中分離純化出一個由七個胺基酸組成的多肽，應用Edman降解法測得其序列為Asp-Leu-Asp-His-Tyr-Ser-Phe，質譜法測得其分子量為895.4Da。並通過測定APTT和PT，以及抗血小板聚集活性測定該多肽的抗血栓活性。本發明中的多肽延遲APTT時間，有抑制血小板聚集的作用，具有抗血栓活性，可以應用於製備抗血栓藥物。
文檔編號C07K7/06GK103145800SQ20131006310
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者孔毅, 李帥, 邵妤, 李志裕, 周秋梅, 何志龍 申請人:中國藥科大學