高效表達重組水蛭素及其生產方法
2023-05-04 08:28:51
專利名稱：高效表達重組水蛭素及其生產方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程的抗栓藥物及其生產方法，特別涉及一種新型水蛭素及其生產方法。
水蛭素是由水蛭唾液產生的小分子蛋白，能與α-凝血酶形成非共價穩定複合物，因而完全破壞凝血酶裂解纖維蛋白原的能力，從而使之成為抗凝、抗栓藥物。天然水蛭素有一系列類似物，主要的水蛭素類似物包括水蛭素I型(HV1)、水蛭素II型(HV2)和水蛭素III型(HV3)。由於在吸血水蛭中水蛭素的含量極少，從水蛭中大量提取水蛭素是不可能的。隨著基因工程技術的不斷完善，開始利用原核及真核表達體系來大量生產重組水蛭素。目前HV1產品已正式上市。但HV2和HV3尚無產品上市。由於重組水蛭素用量較大，因此為提高產率，降低成本，獲得高表達、穩定性好的重組水蛭素，已成必須解決的問題。
本發明的目的在於尋找一種新的水蛭素2型基因，簡分操作步驟，提高效率，並獲得新型結構的水蛭素。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的根據文獻報導的天然HV2基因序列，採用全人工合成的方法獲得HV2全基因。有以下二個方案同時實施，第一個方案全人工合成的基因編碼序列與天然水蛭素2型DNA編碼序列相比較，分別在121位和156位的核苷酸發生了變異。本發明實施例所涉及的DNA編碼序列的第121位由胞苷酸變異為鳥苷酸，第136位由胸苷酸變異為胞苷酸。同時在其5』端上遊加入一段前導序列，共有12個核苷酸，其序列為CTCGAGAAAAGA。第二個方案全人工合成的基因編碼序列與天然水蛭素2型DNA編碼序列相比較，分列在121位。所涉及的DNA編碼序列的第121位由胞苷酸變異為鳥苷酸，第156位由胸苷酸變異為胞苷酸，第157位由腺苷酸變異為鳥苷酸。同時在其5』端上遊加入一段前導序列，共有12個核苷酸，其序列為CTCGAGAAAAGA。
通過基因工程的方法，對以上二種重組水蛭素DNA序列，構建其畢赤酵母分泌型表達載體pHV2，重組表達載體轉化宿主細胞GS115，並整合入宿主細胞的染色體中。篩選高效表達工程細胞株，對工程細胞株進行發酵培養，在誘導物作用下特異表達目的基因。表達產物進行分離純化，胺基酸序列的分析及生物學活性的測定。針對重組水蛭素的基因結構特點和畢赤酵母的生長特性，優化發酵、分離、純化的生產工藝。僅用兩步分離、純化工藝既可得到較純的產品。所得到的新型水蛭素的胺基酸序列與天然得到的水蛭素2型的胺基酸序列相比較，在第一方案中第47位胺基酸發生了變異，本發明實施例所涉及的新型水蛭素的胺基酸序列的第47位胺基酸由天門冬醯胺變異為賴氨酸，在第二方案中第47位和第53位胺基酸發生了變異，本發明實施例所涉及的新型水蛭素的胺基酸序列的第47位胺基酸由天門冬醯胺變異為賴氨酸第53位由天門冬醯胺變異為天門冬氨酸。
由於本發明所述的水蛭素基因的合成在其上遊都含有一段合適的前導序列，因此在酵母表達體系中能獲得高水平表達。其表達產物分泌在細胞外，簡化了分離純化步驟，提高了重組基因產物的生產效率，產物表達水平和生物學活性，以及對抗凝、抗栓的藥效學研究表明，高於文獻報導，這為水蛭素II型的大規模生產和臨床應用的深入研究提供了物質來源。
本發明所涉及的畢赤酵母由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2001年8月23日，分類命名為巴氏畢赤酵母，編號為0619。
以下為本發明的實施例附說明1為本發明(方案一所涉及的)高效表達水蛭素DNA序列2為本發明(方案一所涉及的)高效表達水蛭素胺基酸序列3為本發明(方案二所涉及的)高效表達水蛭素DNA序列4為本發明(方案二所涉及的)高效表達水蛭素胺基酸序列一、含有前導序列的二種新型水蛭素基因的獲得利用全人工合成方法，合成含有前導序列的新型水蛭素，其中一種為在其結構基因中121位核苷酸為鳥苷酸，156位為胞苷酸，另一種為在其結構基因中121位核苷酸為鳥苷酸，156位為胞苷酸，157位為鳥苷酸。並在以上的結構基因的5』端上遊合成包括XhoI酶切位點的12個核苷酸的前導序列，在其3』端下遊合成含有終止子和EcoRI酶切位點。XhoI和EcoRI雙酶切、電泳回收率物-20℃保存備用。
二、構建高效表達的酵母表達質粒將pBSR用XhoI和EcoRI雙酶切，電泳回收，將二種合成產物與pBSK連接，轉化Ecoli DH5α受體菌內，經篩選得到重組克隆，擴增後提取質粒DNA，分列進行測序(結果見1)。重組質粒pBSK-HV2用XhoI和EcoRI雙酶切，電泳回收小片段，將畢赤酵母表達質粒PIC9用XhoI和EcoRI雙酶切，產物回收後將上述兩個回收片斷用T4連接酶連接過夜，獲得重組質粒pHV2。轉化至Ecoli TOP10F篩選陽性擴增提質粒克隆。
三、獲得高表達水蛭素2型的酵母工程菌將重組質粒pHV2用Sall單酶切，回收酶切產物，用電轉法轉入中遊誘導型酵母菌GS115感受態菌株中。篩選出最高表達活性菌株。在搖瓶培養48小時誘導後其上清中水蛭素活性可達1500ATU/ml。表達產物經鑑定為目的蛋白(結果見2)。
四、大規模生產水蛭素對構建的甲醯快速利用型Pichia酵母分泌表達工程菌，用大容量發酵罐進行大規模發酵，發酵液上清工程蛋白表達量達1.5g/L以上，發酵液目的蛋白電泳純度在80％以上，發酵液離心上清經超濾，離子交換二步分離純化步驟，蛋白純度即可達98.8％，總回收率50-60％，這種高效表達水蛭素簡化了操作步驟，並且達到了低成本大規模生產的工藝要求。15-CTC GAG AAA AGA ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCGGGT CAA AAT TTG TGC CTC TGC GAG GGA AGC AAT GTT TGCGGT AAA GGC AAT AAG TGC ATA TTG GGT TCT AAT GGA AAGGGC AAC CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAG CCTGAA AGC CAT AAC AAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAAGAA TAT TTA CAA TAA GAA TTC-32ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQKVTGEGTPKPESHNNGDFEEIPEEYLQ35-CTC GAG AAA AGA ATT ACT TAC ACT GAT TGT ACA GAA TCGGGT CAA AAT TTG TGC CTC TGC GAG GGA AGC AAT GTT TGCGGT AAA GGC AAT AAG TGC ATA TTG GGT TCT AAT GGA AAGGGC AAC CAA TGT GTC ACT GGC GAA GGT ACA CCG AAG CCTGAA AGC CAT AAC GAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAAGAA TAT TTA CAA TAA GAA TTC-34ITYTDCTESGQNLCLCEGSNVCGKGNKCILGSNGKGNQKVTGEGTPKPESHNDGDFEEIPEEYLQ
權利要求
1.一種新型編碼水蛭素的DNA序列，其特徵在於該DNA編碼序列與來源於水蛭的天然的水蛭素2型DNA序列相比，該DNA編碼序列的第121位核苷酸由胞苷酸變異為鳥苷酸、第156位核苷酸由胸苷酸變異為胞苷酸。其前導序列為CTCGAGAAAAGA。
2.一種重組表達載體，其特徵在於該重組表達載體含有權利要求1所述的編碼新型水蛭素的DNA序列，該重組載體的載體為質粒Phv2-A。
3.一種重組細胞，其特徵在於該重組細胞的宿主細胞被權利要求2所述的重組載體所轉化。權利要求1所述的DNA序列整合至重組細胞染色體中，並在傳代中上述序列，保持其遺傳穩定性。
4.根據權利要求5所述的重組載體，其特徵在於宿主細胞為酵母細胞GS115。
5.一種編碼新型水蛭素的胺基酸序列，其特徵在於該胺基酸序列由權利要求1所述的DNA序列所編碼。
6.根據權利5所述的新型水蛭素的胺基酸序列，其特徵在於該胺基酸序列與來源於水蛭的天然水蛭素2型DNA序列所編碼的核苷酸相比，第47位的天門冬醯胺發生了變異，變異為賴氨酸。
7.一種產生如權利要求5、6所述新型水蛭素的方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)人工合成如權利要求1所述的新型水蛭素DNA序列(2)如權利要求2所述表達載體的構建；(3)如權利要求3所述的重組細胞的構建；(4)步驟(3)所獲得的重組細胞的培養表達；(5)步驟(4)所獲得的表達產物的分離純化；(6)步驟(5)所獲得的純化產物的胺基酸序列的分析及生物活性的測定。
8.一種新型編碼水蛭素的DNA序列，其特徵在於該DNA編碼序列與來源於水蛭的天然的水蛭素2型DNA序列相比，該DNA編碼序列的第121位核苷酸由胞苷酸變異為鳥苷酸、第156位核苷酸由胸苷酸變異為胞苷酸，第157位核苷酸由腺苷酸變異為鳥苷酸。其前導序列為CTCGAGAAAAGA。
9.一種重組表達載體，其特徵在於該重組表達載體含有權利要求8所述的編碼新型水蛭素的DNA序列，該重組載體的載體為質粒Phv2-A。
10.一種重組細胞，其特徵在於該重組細胞的宿主細胞被權利要求9所述的重組載體所轉化。權利要求8所述的DNA序列整合至重組細胞染色體中，並在傳代中上述序列，保持其遺傳穩定性。
11.根據權利要求18所述的重組載體，其特徵在於宿主細胞為酵母細胞GS115。
12.一種編碼新型水蛭素的胺基酸序列，其特徵在於該胺基酸序列由權利要求8所述的DNA序列所編碼。
13.根據權利25所述的新型水蛭素的胺基酸序列，其特徵在於該胺基酸序列與來源於水蛭的天然水蛭素2型DNA序列所編碼的核苷酸相比，第47位的天門冬醯胺變異為賴氨酸和第53位天門冬醯胺變異為天門冬氨酸。
14.一種產生如權利要求12、13所述新型水蛭素的方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)人工合成如權利要求8所述的新型水蛭素DNA序列(2)如權利要求9所述表達載體的構建；(3)如權利要求10、11所述的重組細胞的構建；(4)步驟(3)所獲得的重組細胞的培養表達；(5)步驟(4)所獲得的表達產物的分離純化；(6)步驟(5)所獲得的純化產物的胺基酸序列的分析及生物活性的測定。
全文摘要
本發明涉及一種生物工程的抗栓藥物及其生產方法，具體而言是涉及一種新型水蛭素及其生產方法。採用全人工合成的方法獲得變異的HV2全基因，在其5』端上遊加入一段合適前導序列。構建畢赤酵母分泌型表達載體pHV2，載體轉化宿主細胞GS115，並整合入宿主細胞的染色體中。篩選高效表達菌株，經優化發酵誘導、分離純化步驟，提高了重組基因產物的生產效率，產物表達水平和生物學活性，以及對抗凝、抗栓的藥效學研究表明，高於文獻報導，這為水蛭素II型的大規模生產和臨床應用的深入研究提供了物質來源。
文檔編號C12N15/15GK1420176SQ0114141
公開日2003年5月28日 申請日期2001年9月24日 優先權日2001年9月24日
發明者趙凱, 吳祖澤, 苑賓, 張津輝, 李滿文, 熊志紅, 蔣中華, 董春娜, 曹菊榮, 於愛平 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所, 北京魯銀利華醫藥科技發展有限公司