基於聚合物微球變化的編碼檢測方法
2023-05-04 16:08:56
專利名稱：基於聚合物微球變化的編碼檢測方法
技術領域：
本發明涉及生物醫用檢測技術領域，主要涉及一種基於聚合物微球變化的編碼檢 測方法。本發明是建立在免疫反應以及基因雜交特異性反應的基礎上，對編碼技術的創新， 可同時實現多個待測樣本或指標的檢測，簡單、快速、可靠。
背景技術：
在生物醫學領域中，人們對生命現象的觀察和研究已經深入到單細胞、單分子水 平。生物醫學檢測技術是現代生命科學與醫學發展的重要手段和實驗工具，尤其是對感染 性疾病、遺傳性疾病和惡性腫瘤等的臨床診斷具有極其重要的作用。流式細胞術(Flow Cytometry, FCM)是一種在功能水平上對細胞或其他生物粒子 定量檢測和分選的分析方法，在生物床醫學領域應用廣泛。細胞或粒子在雷射束的照射下 產生散射光和激發螢光，這兩種光信號同時被前向光電二極體和90°方向的光電倍增管 (PMT)接收。光散射信號在前向小角度進行檢測，稱為前向散射(forward scatter, FSC)， 這種信號反映了微球粒徑或體積的大小；90°散射光又稱側向散射(side scatter, SSC)， 是指與雷射束_液流平面垂直的散射光，其信號強度可反映微球內部複雜程度。檢測後的 信號經計算機處理後即轉化為可直觀觀察的一維直方圖或二維散點圖。流式細胞儀的分辨 率主要取決於儀器本身，常用變異係數(Cv)來表示，Cv = d/mX100% (d是分布的標準偏 差，m是分布的平均值)。近年來，流式細胞儀在技術原理和設計研製方面無突破性進展，但 在各種功能上卻有了很大提高，尤其是螢光探針的不斷推陳出新，使流式細胞儀新的參量 分析方面不斷有新的發展，並使儀器不斷向小型化，操作自動化、簡單化方向發展。顧忠澤 等(CN1595149A)發明一種基於編碼微球的微流控生物晶片，是基於流式細胞術原理發展 的一種新的檢測技術。編碼技術是目前用於醫學檢測以及科學研究的關鍵技術，是將待檢測的信息轉 換為微球顏色、粒徑或者磁性等能快速、準確檢測的信號，便於判斷和篩選。Chandler等 (美國專利，US626822)利用聚苯乙烯納米微球，溶脹吸附螢光物質實現了編碼。顏曉梅等 (CN101392172A)製得了粒徑均一的、羧基化螢光編碼微球。蘇星光等(CN101530766A)發 明了磁性螢光編碼微球，集磁響應與螢光編碼於一身，在應用方面具有很大優勢。但是由於 螢光物質本身發光效率和穩定性難控制、不同波長螢光效率差別顯著等引發的問題仍然存 在。目前應用較多微球聚合方法主要包括分散聚合、懸浮聚合、乳液聚合、種子聚合、SPG膜 乳化法等。20世紀八十年代Ugelstad等開發了種子溶脹聚合法，通過引入惰性溶劑和單體 一起溶脹單分散種子微球，可以用來製備單分散的聚合物微球。目前對種子溶脹聚合的理 論和方法已經相當成熟，通過二步種子溶脹聚合可以獲得不同系列粒徑、高度均勻的功能 化微球，不僅可以獲得高交聯度的緻密微球，還能獲得介孔或微孔球。由於微球表面帶有功 能基團，特別是羧基基團，可以與抗體、抗原以及基因片段結合成為診斷微球。診斷微球基 於免疫反應或基因雜交特異性反應，特異地識別待測物質，通過流式細胞儀檢測即可準確 判斷樣品中是否含有該物質或診斷患者是否患有某種疾病。
目前很多液相生物晶片的載體微球採用螢光微球，由於微球螢光負載不均勻、穩定性差、容易發生洩漏、不同螢光波長的螢光效率不同，且螢光染料的成本較高、過程複雜， 在生物醫學檢測方面應用受限；對微球的要求高，不但要求微球高度均勻，表面官能團富集 而且能有效、穩定的包埋小分子。如何既能實現多通量同時檢測、又能使操作簡單、檢測信 號穩定性強、區分度高，且成本低廉的編碼技術，一直受到研究人員的廣泛關注。
發明內容
本發明旨在提供一種易於檢測、準確區分，同時實現多通量檢測的基於聚合物微 球變化的編碼檢測方法，可廣泛應用於生物學、臨床醫學、免疫學、藥學等生物醫學檢測領 域。本發明提供了基於聚合物微球變化的編碼檢測方法本發明採用表面偶聯特異性的抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內 部結構的聚合物微球，通過免疫反應或基因雜交反應特異性識別待測樣品中的抗原、抗體、 DNA或RNA片段；用表面攜帶螢光物質的分子探針與待測的抗體、抗原、DNA或RNA片段特異 性偶聯，使得微球表面呈現螢光顏色；在檢測儀器中檢測螢光信號，與陰性和陽性對照標本 或已知濃度的標準品對比，判斷待測樣品是陰性或是陽性；在檢測儀器中對微球粒徑和內 部結構進行表徵，根據微球粒徑和內部結構與檢測信息的一一對應關係，從而對待測物質 進行準確判斷。所述的聚合物微球是不同交聯度的緻密微球、介孔或微孔球；微球的粒徑為2 30 μ m,相鄰編碼微球粒徑間隔在1 10 μ m。所述的聚合物微球微球的粒徑優選4 16 μ m。所述的聚合物微球為聚苯乙烯類微球、聚丙烯酸酯類微球、聚苯乙烯-丙烯酸共 聚微球或聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸共聚微球，分散係數低於15%。所述的微球表面帶有氨基、羧基或氯甲基官能團，表面官能團負載率為0.5 1.5mm0l/g;與蛋白或基因結合成為診斷微球，從而建立不同微球與不同蛋白或基因的一一 對應關係。所述的抗體、抗原、DNA或RNA片段是抗結核桿菌抗體、抗B肝病毒抗體抗微生物 抗體中的一種或幾種；類風溼因子、抗甲狀腺球蛋白抗體自身抗體中的一種或幾種；抗小 鼠抗體、抗兔二抗第二抗體中的一種或幾種；小鼠血清、兔血清動物血清抗原類中的一種或 幾種；豬流感病毒NS1基因、胰島素基因微生物體內的特異基因、人體或動物體內基因的轉 錄產物其中的一種或幾種。所述的一一對應關係是表面偶聯抗體的編碼微球和螢光標記的同種抗體，對應檢 測待測樣品中的抗原；表面偶聯抗原的編碼微球和螢光標記的同種抗原，對應檢測待測樣 品中的抗體；表面偶聯DNA片段或RNA片段的編碼微球和螢光標記相同的DNA或RNA片段， 對應檢測待測樣品中的DNA或RNA片段。所述的檢測儀器可分辨聚合物微球不同粒徑和緻密與介孔微球的散射光信號，優 選流式細胞儀。所述的檢測儀器其檢測信號的變異係數在20%以下；其前向角散射光信號最小 分辨尺寸為0. 3μπι ；其側向角散射光信號反映微球密微球與介孔微球的散射信號強；將檢測信號檢轉化為直觀顯示的一維直方圖和二維散點圖，以精確識別不同微球，通過一一對 應的關係確定待測物質的信息。所述的編碼微球包括1)採用一系列粒徑為 2um、4um、6um、8um、10um、12um、14um、16um、18um、 20 um,22u m、24 um,26u m、28 um,30um的緻密微球，通過檢測譜圖能明顯區分，可同時實 現16種不同待測物質的同時檢測。2)採用一系列粒徑為 2um、4um、6um、8um、10um、12um、14um、16um、18um、 20 um,22u m、24 um,26u m、28 um,30um的致孔微球，通過檢測譜圖能明顯區分，可同時實 現16種不同待測物質的同時檢測。3)採用 4 ii m、6 ii m、8 ii m、10 ii m、12 ii m、14 ii m、16 ii m粒徑的微球，可編碼 7 種診斷
微球，分別採用緻密、致孔兩種不同內部結構的微球，可使得微球種類增加一倍；當採用不 同交聯度微球時，能使得編碼微球種類增加多倍，可實現多通量檢測。根據編碼微球的粒徑以及內部結構信息確定的檢測標準，在生物反應前後偏差範 圍在0. 2 y m左右，對檢測信號影響很小，能夠保證診斷微球標準粒徑和內部結構信息的可靠性。總之，與現有的編碼檢測技術相比，本發明涉及的編碼檢測方法具有微球粒徑分散 係數小於8%，內部結構多樣；檢測圖譜峰半峰寬窄，重疊程度小於10%，檢測信號區分度高， 能夠實現多個待測樣本、多個指標的同時檢測；微球表面富集官能團，偶聯生物分子能力強， 能有效地診斷疾病、判斷藥物療效以及實現對抗體、抗原、DNA或RNA等的標記和識別。
圖1 雙抗夾心法檢測的原理2:幻411111、511111、611111緻密微球的前向角-側向角二維散點圖；B)4iim、5iim、6iim緻密微球的前向角-個數一維直方圖。圖3 :A) 5. 7 ii m、9. 8umU2.3um致孔微球的前向角-側向角二維散點圖；B)5.7um,9.8umU2.3um致孔微球的前向角-個數一維直方圖。圖4 :A) 5.7 iim緻密微球、7.3 iim致孔微球、12. 3 iim緻密微球的前向角-側向角 二維散點圖；B)5. 7um緻密微球、7. 3 u m致孔微球、12. 3 y m的前向角-個數一維直方圖。C) 5. 7 u m緻密微球、7. 3 u m致孔微球、12. 3 y m的側向角-個數一維直方圖。
具體實施例方式下面給出本發明的實施例，是對本發明的進一步說明，而不是限制本發明的範圍。一、編碼微球檢測方法聚合物微球製備方法可以是分散聚合、乳液聚合、SPG膜乳化法、懸浮聚合、種子聚 合，優選二步種子溶脹聚合，通過改變種子微球粒徑或適當改變溶脹聚合過程的單體和添 加劑的比例以獲得粒徑範圍寬的系列微球。微球表面帶有功能基團，可以是氨基、羧基、氯 甲基，優選羧基，羧基與生物小分子結合能力強。如分散聚合、乳液聚合、二步種子溶脹聚 合、SPG膜乳化法等均可製備粒徑範圍在2 30 y m的微球，可以是聚甲基丙烯酸-丙烯酸、聚苯乙烯-衣康酸微球、聚苯乙烯-丙烯酸微球、聚丙烯酸-二乙胺微球、聚苯乙烯-氯甲基苯乙烯微球，表面官能團負載率為0. 5 1. 5mmol/g。編碼微球優選採用二步種子溶脹聚 合，粒徑範圍優選4-16 μ m，表面官能團負載率優選0. 7-1. Ommol/g的聚苯乙烯-丙烯酸微 球。實施例1選取4 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為7. 1 %，表面功能基團負載率為 0. 505mmol/g ；5 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為5. 0%，表面功能基團負載率為 為0. 571mmol/g ；6 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為5. 5 %，表面功能基團負載 率為0. 585mmol/g三種高交聯度的微球，各5mg，分別用100 μ L PBS緩衝液分散然後超聲， 標號為1、2、3。將1、2、3混合後，超聲分散，用流式細胞儀進行檢測，得到一維直方圖和二維 散點圖，保存並列印結果，如附圖2。實施例2選取5. 7 μ m致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為6. 4%，表面功能基團負載 率為0. 597mmol/g、9.8ym致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為5.2%，表面功能基團 負載率為0. 633mmol/g、12. 3 μ m致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為7. 7%，表面功 能基團負載率為0. 693mmol/g，各5mg，分別用100 μ L PBS緩衝液分散然後超聲，標號為1、 2、3。將1、2、3混合後，超聲分散，用流式細胞儀進行檢測，得到一維直方圖和二維散點圖， 保存並列印結果，如附圖3。實施例3選取5. 7 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為5. 0 %，表面功能基團負載率 為0、670mmol/g ；7. 3 μ m致孔的聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為5. 2%，表面功能基團 負載率為0. 633mmol/g ； 12. 3 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，分散係數為5. 5%，表面功能 基團負載率為為0. 700mmol/g ；各5mg，分別用100 μ L PBS緩衝液分散然後超聲，標號為1、 2、3，混合在一起後超聲分散，用流式細胞儀進行檢測，得到一維直方圖和二維散點圖，保存 並列印結果。如附圖4。二、活性生物分子檢測實施例5採用免疫夾心法，即採用表面偶聯不同檢測蛋白或基因的聚合物微球(簡稱檢測 基元)，與血液中的蛋白或基因相互作用，再用待有螢光標記的檢測蛋白或基因(簡稱報告 基元)識別，通過流式細胞儀進行檢測，根據粒徑和內部結構的信息判斷血液中含有何種 蛋白或基因，並且根據流式一維直方圖或二維散點圖顯示，可以建立微球個數與待測物質 的定量關係。1)選取2 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯類風溼因子製備了診斷微球Α。診 斷微球A用以檢測樣品中的變性lgG。2)選取16 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯抗甲狀腺蛋白抗體製備了診斷微 球B。診斷微球B用以檢測樣品中的抗甲狀腺蛋白。3)選取30 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯抗神經原抗體製備了診斷微球B。 診斷微球C用以檢測樣品中的抗神經元蛋白。將A、B兩種種診斷微球混合後對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得2 y m粒徑和內部結構 信息，則證明樣品中含有變性IgG ；若測得16i!m粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有 抗甲狀腺蛋白，若測得30 ym粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有抗神經元蛋白，。若 同時檢測到2 ii m、16 ii m和30 ii m微球的信息，則證明同時含有三種物質。檢測圖譜半峰寬 較窄，很容易分辨。實施例61)選取4 y m緻密聚苯乙烯_丙烯酸微球，偶聯抗結核桿菌抗體製備了診斷微球
A。診斷微球A用以檢測樣品中的結核桿菌，判斷待測樣品中是含有結核桿菌。2)選取10 y m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯抗愛滋病病毒抗體製備了診斷微 球B。診斷微球B用以檢測樣品中的愛滋病病毒，判斷待測樣品中是含有愛滋病病毒。3)選取16 ym緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，偶聯我抗B肝病毒抗體製備了診斷微 球C。診斷微球C用以檢測樣品中的B肝病毒，判斷待測樣品中是含有B肝病毒。將A、B、C三種診斷微球混合後對血液樣本採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光 顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得粒徑和內部結構 信息，則證明樣品中含有結核桿菌；若測得10 ym粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有 愛滋病病毒；若測得16ym粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有B肝病毒。若同時檢測 到4 y m、10 y m、16 y m的信息，則證明同時含有三種物質。檢測圖譜半峰寬較窄，很容易分 辨。實施例7檢測原理同上。1)選取4. 1 P m聚苯乙烯-衣康酸微球，偶聯小鼠血清製備了診斷微球A。診斷微 球A用以檢測樣品中的抗鼠抗體。2)選取6. 6 ii m聚苯乙烯-衣康酸微球，偶聯兔血清製備了診斷微球B。診斷微球 B用以檢測樣品中的抗兔抗體。將A、B兩種種診斷微球混合後對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光 顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得4. 粒徑和內部結 構信息，則證明樣品中含有抗鼠抗體；若測得6.6 ym粒徑和內部結構信息，則證明樣品中 含有抗兔抗體。若同時檢測到4.1 i!m、6. 6 ym的信息，則證明同時含有兩種生物分子。檢 測圖譜半峰寬較窄，很容易分辨。實施例8檢測原理同上。1)選取2 ym聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸微球，偶聯抗B肝病毒抗體製備了診斷微 球A。診斷微球A用以檢測樣品中的B肝病毒。2)選取lOym聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸微球，偶聯類風溼因子製備了診斷微球
B。診斷微球B用以檢測樣品中的變性IgG。將A、B兩種種診斷微球混合後對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光 顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得2 y m粒徑和內部結構 信息，則證明樣品中含有B肝病毒；若測得10 ym粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有 抗兔抗體。若同時檢測到ZiimUOiim的信息，則證明同時含有兩種生物分子。檢測圖譜半峰寬較窄，很容易分辨。實施例9檢測原理同上。1)選取5 μ m聚苯乙烯-氯甲基苯乙烯微球，偶聯抗B肝病毒抗體製備了診斷微球A0診斷微球A用以檢測樣品中的B肝病毒。2)選取13 μ m聚苯乙烯-氯甲基苯乙烯微球，偶聯類風溼因子製備了診斷微球B。 診斷微球B用以檢測樣品中的變性lgG。將A、B兩種種診斷微球混合後對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光 顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得5 μ m粒徑和內部結構 信息，則證明樣品中含有B肝病毒；若測得13μπι粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有 變性lgG。若同時檢測到5μπι、13μπι的信息，則證明同時含有兩種生物分子。檢測圖譜半 峰寬較窄，很容易分辨。實施例10檢測原理同上。1)選取4μπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團負載率為0.5mmol/g，偶聯抗乙 肝病毒抗體製備了診斷微球A。診斷微球A用以檢測樣品中的B肝病毒。2)選取ΙΟμπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團負載率為0.7mmol/g，偶聯抗甲 狀腺球蛋白製備了診斷微球B。診斷微球B用以檢測樣品中的甲狀腺球蛋白。將A、B兩種種診斷微球混合後對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光 顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得4μπι粒徑和內部結構 信息，則證明樣品中含有B肝病毒；若測得ΙΟμπι粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有 甲狀腺球蛋白。若同時檢測到4μπι、10μπι的信息，則證明同時含有兩種生物分子。檢測圖 譜半峰寬較窄，很容易分辨。實施例11檢測原理同上。1)選取4μπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團負載率為l.Ommol/g，偶聯抗乙 肝病毒抗體製備了診斷微球A。診斷微球A用以檢測樣品中的B肝病毒。2)選取ΙΟμπι聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面官能團負載率為1. 5mmol/g，偶聯抗結 核桿菌抗體製備了診斷微球B。診斷微球B用以檢測樣品中的結核桿菌。將A、B兩種種診斷微球混合後對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光 顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式譜圖信息，若測得4μπι粒徑和內部結構 信息，則證明樣品中含有B肝病毒；若測得ΙΟμπι粒徑和內部結構信息，則證明樣品中含有 結核桿菌。若同時檢測到4μπι、10μπι的信息，則證明同時含有兩種生物分子。檢測圖譜交 叉重疊少，易於分辨。實施例12檢測原理同上。選取3 μ m聚苯乙烯-二乙胺微球，偶聯抗小鼠二抗製備了診斷微球A ；選取13 μ m 聚苯乙烯_ 二乙胺微球，偶聯抗兔二抗製備了診斷微球B，將兩種診斷微球混合在一起。對 待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光顏色，與陰性和陽性對照標本比較、判斷。根據流式圖譜能很好的區分A、B，A和B粒徑不同，差別顯著。實施例13檢測原理同上。分別製備了表面偶聯豬流感病毒NS1基因片段的5. 7 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球A、表面偶聯胰島素基因片段的5. 7 μ m致孔聚苯乙烯-丙烯酸微球B，將兩種診斷微球 混合在一起。對待測樣品採用免疫夾心法檢測，根據所帶的螢光顏色，與陰性和陽性對照標 本比較、判斷。根據流式圖譜能很好的區分A、B，A和B粒徑相同但內部結構差別顯著。若測得5. 7μπι粒徑和致孔結構信息，則證明樣品中含有互補的豬流感病毒基因 片段；若測得5. 7 μ m粒徑和緻密結構信息，則證明樣品中含有互補的胰島素基因片段。若 同時檢測到兩種內部結構的信息，則證明同時含有兩種生物分子。檢測圖譜半峰寬較窄，很 容易區分。實施例14檢測原理同上。分另Ij 選取粒徑為 2 μ m、4 μ m、6 μ m、8 μ m、10 μ m、12 μ m、14 μ m、16 μ m、18 μ m、 20μπι、22μπι、24μπι、26μπι、28μπι、30μπι的緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面分別偶聯16 種不同的抗體、抗原、DNA或RNA片段，得到16種不同的診斷微球，建立粒徑和內部結構與 抗體、抗原、DNA或RNA片段的一一對應關係，可同時檢測16種不同待測物質，在檢測圖譜 能明顯區分。實施例I5檢測原理同上。分另Ij 選取粒徑為 2 μ m、4 μ m、6 μ m、8 μ m、10 μ m、12 μ m、14 μ m、16 μ m、18 μ m、 20μπι、22μπι、24μπι、26μπι、28μπι、30μπι的致孔聚苯乙烯-丙烯酸微球，表面分別偶聯16 種不同的抗體、抗原、DNA或RNA片段，得到16種不同的診斷微球，建立粒徑和內部結構與 抗體、抗原、DNA或RNA片段的一一對應關係，可同時檢測16種不同待測物質，在檢測圖譜 能明顯區分。實施例I6檢測原理同上。分別選取粒徑為4 μ m、8 μ m、12 μ m、16 μ m的緻密和致孔微球，表面分別偶聯8種 不同的抗體、抗原、DNA或RNA片段，得到8種不同的診斷微球，建立粒徑和內部結構與抗體、 抗原、DNA或RNA片段的一一對應關係，可同時檢測8種不同待測物質。粒徑間隔較大且內 部結構區別顯著，容易區分。實施例17檢測原理同上。製備了表面偶聯類風溼因子的5. 7 μ m緻密聚苯乙烯-丙烯酸微球分別對兩份含 有不同濃度的變異IgG的樣品1和2，進行雙抗夾心法檢測。根據流式圖譜顯示，兩份樣品 檢測粒徑均在5. 7 μ m左右，但是變異IgG的濃度高的樣品譜峰明顯高於濃度低的樣品。根 據這一特點，可製得標準樣品，以不同濃度的待測樣和標樣的比較判斷患者所處的時期。本發明公開和揭示粒徑和內部結構編碼微球的檢測技術，可通過借鑑本文公開內 容。儘管本發明的基於聚合物微球粒徑和內部結構的編碼檢測方法已通過較佳實施例進行了描述，但是本領域技術人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法改動，更具體地說，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們 都被視為包括在本發明精神、範圍和內容中。
權利要求
基於聚合物微球變化的編碼檢測方法，其特徵在於採用表面偶聯特異性抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內部結構的聚合物微球，通過免疫反應或基因雜交反應特異性地識別待測樣品中的抗原、抗體、DNA或RNA片段；用表面攜帶螢光物質的分子探針與待測的抗體、抗原、DNA或RNA片段特異性偶聯，使得微球表面呈現螢光顏色；在檢測儀器中檢測螢光信號，與陰性和陽性對照標本或已知濃度的標準品對比，判斷待測樣品是陰性或是陽性；在檢測儀器中對微球粒徑和內部結構進行表徵，根據微球粒徑和內部結構與檢測信息的一一對應關係，從而對待測物質進行準確判斷。
2.如權利要求1所述編碼檢測方法的聚合物微球，其特徵在於聚合物微球是不同交 聯度的緻密微球、介孔或微孔球；微球的粒徑為2 30 ym，相鄰編碼微球粒徑間隔在1 10 u m。
3.如權利要求2所述的聚合物微球，其特徵在於聚合物微球微球的粒徑優選4 16 u m。
4.如權利要求2或3所述的聚合物微球，其特徵在於聚合物微球為聚苯乙烯類微球、聚 丙烯酸酯類微球、聚苯乙烯_丙烯酸共聚微球或聚甲基丙烯酸甲酯_丙烯酸共聚微球，分散 係數低於15%。
5.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於微球表面帶有氨基、羧基或氯甲基官能 團，表面官能團負載率為0. 5 1. 5mmol/g ；與蛋白或基因結合成為診斷微球，從而建立不 同微球與不同蛋白或基因的一一對應關係。
6.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於所述的抗體、抗原、DNA或RNA片段是抗 結核桿菌抗體、抗B肝病毒抗體抗微生物抗體中的一種或幾種；類風溼因子、抗甲狀腺球蛋 白抗體自身抗體中的一種或幾種；抗小鼠抗體、抗兔二抗第二抗體中的一種或幾種；小鼠 血清、兔血清動物血清抗原類中的一種或幾種；豬流感病毒NSi基因、胰島素基因微生物體 內的特異基因、人體或動物體內基因的轉錄產物其中的一種或幾種。
7.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於表面偶聯抗體的編碼微球和螢光標記的 同種抗體，對應檢測待測樣品中的抗原；表面偶聯抗原的編碼微球和螢光標記的同種抗原， 對應檢測待測樣品中的抗體；表面偶聯DNA片段或RNA片段的編碼微球和螢光標記相同的 DNA或RNA片段，對應檢測待測樣品中的DNA或RNA片段。
8.如權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於檢測儀器是分辨聚合物微球不同粒徑和 緻密與介孔微球的散射光信號。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於所述的檢測儀器為流式細胞儀，流式細 胞儀檢測信號的變異係數在20%以下；前向角散射光信號最小分辨尺寸為0. 3pm ；側向角 散射光信號反映微球密微球與介孔微球的散射信號強；將檢測信號檢轉化為直觀顯示的一 維直方圖和二維散點圖，以精確識別不同微球，通過一一對應的關係確定待測物質的信息。
全文摘要
本發明是基於聚合物微球變化的編碼檢測方法。採用表面偶聯特異性的抗體、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒徑和內部結構的聚合物微球，通過免疫或基因雜交反應特異性識別待測樣品中的抗原、抗體、DNA或RNA片段；用表面攜帶螢光物質的分子探針與待測抗體、抗原、DNA或RNA片段特異性偶聯；在檢測儀器中檢測螢光信號，與陰性和陽性對照標本或已知濃度的標準品對比，判斷待測樣品是陰性或陽性；在檢測儀器中對微球粒徑和內部結構進行表徵，根據微球粒徑和內部結構與檢測信息的一一對應關係，從而對待測物質進行準確判斷。本發明是建立在免疫以及基因雜交特異性反應的基礎上，對編碼技術的創新，可同時實現多個待測樣本或指標的檢測，簡單、快速、可靠。
文檔編號G01N33/68GK101846672SQ20101016566
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月7日 優先權日2010年5月7日
發明者宋濤, 常津, 張琦, 李雲紅, 逯超亮 申請人:天津大學