一種新的檢測血清樣本中鼠疫抗體的方法和產品的製作方法
2023-05-04 15:44:11 3
專利名稱：一種新的檢測血清樣本中鼠疫抗體的方法和產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的檢測血清樣本中鼠疫抗體的定量檢測方法和產品及其 製備方法。
背景技術：
鼠疫耶爾森菌(rem'm'a pesto)屬於耶爾森菌屬(yem7w),是引起烈性傳染病 鼠疫(Plague)的病原菌。鼠疫是一種病情兇險的傳染病，傳染性強，致死率為30% 至100%,鼠疫的潛伏期大約是2至7天，各型的初期症狀有發高燒、劇烈頭痛、 嘔吐、臉部潮紅、眼紅、皮膚有出血點、意識模糊、四肢劇痛、局部'淋巴結腫
大等等:'"、''-''': ',、 .'.'n,
原或抗體主要有由雙抗原夾心測抗體、雙抗體夾心測抗原、竟爭法、間4妻法等。
間接法測抗體的原理是特異性抗原結合到固相載體上，然後和待4企血清中的相
應抗體結合形成免疫複合物，洗滌後再加酶標記抗體與免疫複合物中的抗體結
合形成酶標記抗體-抗體-固相抗原複合物，加底物顯色，判斷抗體含量。
懸浮晶片(suspension array)^稱液相晶片，是20世紀70年代美國Luminex
公司研製出的新一代生物晶片技術，利用帶編碼的微球體作為載體，流式細胞
儀作為檢測平臺，對核酸、蛋白質等生物分子進行大規模測定。目前，該技術已
廣泛應用於免疫分析、核酸研究、酶學分析、抗體篩選及受體與配體的識別分 析等領域。
目前發展的懸浮晶片主要是基於細胞因子的檢測。但是懸浮晶片是否能夠 檢測人血清中的鼠疫抗體，尚缺乏模型和評價。
發明內容
本發明涉及一種新的檢測血清中鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片，該晶片包括 編碼微球，作為包被微球抗原的鼠疫Fl抗原，生物素標記的羊抗兔IgG和羊抗 人IgG作為檢測抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩衝溶液。本發明提供上述檢測鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片的製備方法，其特徵在於， 在相關緩衝溶液中，編碼微球用鼠疫Fl抗原包被、用生物素標記的片全測抗體為
羊抗兔IgG、羊抗人IgG、用鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)作為信號檢測物。
本發明提供一種鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片定量檢測方法，該方法採用間接 法檢測抗體的免疫學^r測原理，其特徵在於，在檢測過程中所有反應可在96孔 濾板上或在微量離心管中進行，其中包括下列步驟(1 )每孔或管中加入含有 已包被捕獲抗原，即鼠疫Fl抗原包被的編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；
(2) 加入待測血清樣品，聘育後清洗；(3)加入生物素化的4全測抗體，孵育 後清洗；(4)加入鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE),孵育後清洗，(5)加入檯r 測緩沖液後混勻，(6)用懸浮晶片系統讀取MFI數值(即平均焚光強度)並分 析數據判定檢測結果陰性或陽性。
本發明還提供一種檢測血清樣品中鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片定量檢測方 法，其特徵在於，該方法包括下列步驟(1)加入的陽性檢測樣品或標準品經 4倍梯度倍比系列稀釋，(2)製作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應標準曲線，
(3) 用分析軟體擬合劑量-反應曲線和方程，(4)根據劑量-反應曲線可判斷動 態檢測範圍、未知濃度樣品可根據劑量-反應方程計算出檢測樣品的濃度，還可 判定方法的^:測限。
懸浮晶片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所製作的微球，包覆不 同比例的紅光及紅外光發色劑，而產生100種不同比例顏色，作為100種獨特 的色彩編號，每顆微球大小約5.6|im，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、 酶分析、受體和配體識別分析等，並根據不同研究目的而標定特定抗體、核酸 探針及各種受體探針。標記探針的微球與待測物在96孔板中進行反應。反應後， 利用機器自動將反應液吸起並通過一微細管檢測通道，每次僅允許一個微球通 過檢測通道。檢測通道中設有兩道雷射， 一道為紅色，激發微球基質中的顏色， 識別微球分類編碼以確定檢測項目； 一道為綠色，激發報告分子的顏色，記錄 信號強弱以檢測待測物的含量。當待測樣本與特定微球的探針吸附在一起時， 兩道雷射所激發的光都可被檢測到。而若樣本中不含該標的物，則僅有撰L球中 的激發光可被檢測到。再通過機器與計算機自動統計分析兩道雷射所激發的《鼓 球種類與數量，從而判定待測樣本中有幾種測試目標物在其中，得知測試樣本 中有無待測病原存在，或同時存在有幾種至數十種病原。懸浮晶片技術由於利 用微球在溶液中反應，克服了片膜晶片在大分子檢測時受表面張力、空間效應等對反應動力學的影響，同時利用雷射檢測技術，大大提高了樣品檢測的準確 性和重複性，具有優於片膜晶片的操作簡便、重複性好等特點。
本發明人經過大量和深入的研究，對鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片製備及其檢
測條件作了實質性的改進和創新，其具有下列優點
1、 抗原包被量的改進
鼠疫Fl抗原的包被量是成功檢測的關鍵，本發明對包被微球的抗原包被量
進行實質性優化使血清樣本的檢測效杲非常良好，並且包被懸浮晶片所需的抗
原包被量很低，本發明的抗原包被量為3-9pg /1.25x 106個微球，即 6-36ng/2500-5000個微球/測試，而一般的ELISA方法中包被量為5pg/孔/測試。
2、 生物素標記的改進
通常，標記抗體需要使用過量的生物素。理論上講，在檢測過程中，過量 的生物素因未標記上抗體而不被微球上結合捕獲抗體的抗體連接，清洗時#皮4由 濾掉，不會與隨後加入的SA-PE反應，不影響檢測。但在實際檢測過程中，偶 爾遇到過檢測信號可能過高的現象，出現假陽性，因此本申請生物素標記抗體 後，儘量去除多餘的生物素。以標記2 mg/mL的IgG (分子量150,000) 1 mL溶 液為例，需加入10mM生物素溶液約27 )iL。
3 、 檢測的靈敏度及動態範圍
本發明的血清樣品鼠疫抗體的定量檢測方法和晶片與經典的免疫學ELISA 檢測方法相比，結果有著很好的吻合性(相關係數R^0.9994)。同時，懸浮芯 片方法靈每文度為2.12ng/mL，高於ELISA方法的312.5ng/mL，靈每文度增高100 倍以上；並且，本發明的懸浮晶片方法動態檢測範圍為1.22~2000000ng/mL，高 於ELISA方法動態檢測範圍312.5 20000ng/mL達2個數量級。
4、 方法的特異性
本發明通過選用鼠疫Fl抗原為包被抗原，以兔抗鼠疫Fl抗體為待測抗體， 以生物素化的羊抗兔IgG為檢測抗體。本研究試驗證明，在存在鼠抗流感NP IgG、兔抗禽流感H5NlIgG、兔抗結核抗體、兔抗SARS IgG幹擾抗體存在條件 下，本方法具有良好的特異性。
5、 樣品的檢測能力
本發明評價了懸浮晶片方法對/ok清的檢測能力。通過對人血清的檢測， 初步證實了該方法在檢測人血清中鼠疫抗體的實用性。
圖1: 043號微球包被鼠疫F1蛋白檢測鼠疫抗體示意圖2:蛋白懸浮晶片方法檢測兔抗鼠疫F1抗體的劑量-反應標準曲線圖3: ELISA方法檢測兔抗鼠疫F1抗體標準曲線圖4:蛋白質懸浮晶片與ELISA方法檢測兔抗鼠疫F1抗體的相關性。
具體實施例方式
本發明涉及的檢測鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片製備方法、檢測及定量方法通 過下面的具體實施方式
作進一步說明，但本發明不以任何方式受該實施例的限 定。
一、材料
1. 蛋白懸浮晶片的相關緩衝液
(1 ) PBS緩衝液(pH7.4) : NaCl 137mmol/L; KC1 2.7匪ol/L; Na2HP04 10mmol/L; KH2P04 2mmol/L。用800mL蒸餾水溶解8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44g Na2HPOjo 0.24gKH2PO4。用HC1調節溶液的pH值至7.4，加水至1L。分裝後 在15psi ( 1.05kg/cm2)高壓蒸汽20分鐘，或過濾除菌，保存於室溫。
(2 )微球清洗液PBS ( pH7.4 ) , 0.05% TWEEN-20。
(3 )微球活化緩衝液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04， 5N NaOH 1.5 mL, 定容於250mL, pH6.2。
(4 )微球包被緩衝液0.05 M MES， pH 5.0: 2.44 g MES， 5NNaOH 0.15 mL， 定容於250mL。
(5) 微球保存液PBS-TBN: PBS， 0.1%BSA， 0.02% TWEEN， 0.05%疊氮 化物，pH7.4。
(6) 微球封閉液PBS-BN: PBS, 1%BSA, 0.05%疊氮化物，pH7.4。
(7) 檢測緩衝液:PBS， 1%BSA, pH7.4。
(8) 抗體稀釋液PBS, pH7.4。
(9) 微球稀釋液PBS, 1%BSA， pH7.4。
(10) 樣品稀釋液PVX: PBS, 0.5%PVA， 0.8%PVP;
(11 )生物素化抗體稀釋液PBS-TBN(PBS， 0.1%BSA, 0.02% TWEEN-20， 0.05%NaN3， pH7.4)。
(12) SA陽PE稀釋液PBS (pH7,4) , 1%BSA。
2. 抗原與抗體
本發明使用鼠疫F1抗原作為檢測抗原。
7本發明所使用待測抗體為兔抗鼠疫Fl抗原多克隆抗體。 本發明所使用檢測抗體為生物素化羊抗兔IgG、生物素化羊抗人IgG。 二、待測樣品的製備
1、 目標分析物樣品的製備
目標分析物為兔抗鼠疫F1 IgG,幹擾樣品或作為方法特異性測試的樣品是 目標;險測物外的其它抗體或其它蛋白質，包括兔抗結核血清、兔抗SARSIgG 、 兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫IgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白腖等。將上述待 分析樣品均溶於樣品稀釋液中，4 °C保存。兔抗禽流感H5N1 IgG的儲備液濃度 為0.2mg/mL 。比較實驗中，相同樣品用於ELIS A和懸浮晶片的檢測。
將待分析的兔抗鼠疫F1 IgG用樣品稀釋液以4倍倍比系列稀釋為不同濃度 樣品，以繪製樣品檢測劑量-反應的標準曲線，其中幾個樣品濃度低於檢測的敏 感度，高濃度樣品應使編碼微球的結合位點處於飽和狀態。
2、 人血清樣本的處理
分別將鼠疫病人血清樣本和健康人血清樣本用樣品稀釋1: IO稀釋，例如 如人血清樣本5pL加樣品稀釋液50|iL混勻後，作為待檢樣品進行懸浮晶片方法 的鬥全測。
實施例l、檢測鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片的製備 1、捕獲抗原包被編碼微球
本發明採用的043號編碼微球購自美國BIO-RAD公司，編碼微球用於標記 可以捕獲鼠疫抗體的鼠疫F1蛋白抗原，即利用鼠疫F1蛋白包被4鼓球。
A、 編碼微球的活化
取100|iL ( 1.25xl。6個)編碼微球到1.5mL離心管中，14000 x g離心，小 心吸出並棄去上清液。加入100^iL的微球清洗緩衝液懸浮，震蕩並超聲後14000 xg離心，小心吸出並棄去上清液。加入100jxL的微球活化緩衝液，接著先加入 l(VL新鮮配置的EDC ( 50mg/mL),再加入lOpL新鮮配置的50mg/mL的 Sulfo-NHS,高速震蕩30秒後用鋁箔包裹，在室溫震搖20分鐘。加入150pL的 PBS(pH7.4),震蕩後，14000 xg離心，小心吸出並棄去上清液。加入IOOjiL 的PBS (pH7.4)懸浮編碼微球。
B、 用抗原包被編碼微3求
取捕荻抗原鼠疫F1蛋白抗原4-50嗎加入到活化後的編碼微球中，用PBS 緩沖液定容至50(HiL,室溫震搖2小時。14000xg離心，小心吸出並棄去上清 液。用50(HiL的PBS緩衝液洗一次，14000 xg離心，小心吸出並棄去上清液。
8加入25(VL的封閉緩衝液懸浮編碼微球，在室溫震搖30分鐘，14000 x g離心， 小心吸出並棄去上清液。加入500pL的微5求保存液洗滌編碼微球，16000 x g離 心，小心吸出並棄去上清液。最後用150|iL的微球保存液懸浮編碼微球，於4"C 避光保存備用。
C、包被微球的計數
吸取適量微球，稀釋後，用血球計數板(0.10mm; 1/400mm"在普通顯微鏡 下計數。根據公式(每個大格數xlO、稀釋倍數x體積(mL))計算微球數量。 2、檢測抗體標記生物素
A、 生物素的標記
分別配製好濃度為10mM生物素溶液和2mg/mL的待標記抗體溶液，將計 算好體積的生物素加入到待標記抗體溶液中，在室溫震搖30分鐘(或冰上2小 時)，過柱脫鹽後分裝，-20。C凍存備用。
B、 抗體的用量
以標記2mg/mL的IgG (分子量150,000) lmL溶液為例，需加入10mM生物 素溶液約27 jiL。
實施例2、懸浮晶片製備法a的優化
1、 微球包被抗原包被量的選擇
分別以lpg、 3jxg、 6pg、 9昭、12昭、15嗎、20]ig的量包被lOO)iL編碼為 027號的微球。經檢測效果比較，以6昭/1.25"06個微球即12-24ng/2500~5000 個微球/測試包被效果最好，顯微鏡下計數後避光冷藏保存待用。
如圖1所示，包被鼠疫F1蛋白抗原的043號微球均落在其正確檢測區域內， 並且獲得高信噪比結果(MFI值遠大於2000)，說明優化的懸浮晶片檢測系統 可成功用於鼠疫抗體的檢測。
2、 生物素化抗體的優化
本發明分別用氨基活性的生物素，例如LC-醯肼(hydrazide)-生物素和羧 基活性的生物素，例如Sulfo-NHS-生物素和SH-活性的生物素標記檢測抗體， 經質控過程檢測效果比較，本實驗中SH-活性的生物素標記檢測抗體檢測效果較 好，檢測效果的方法採用本領域的常規方法或安裝製造商的產品說明書所述的 方法。
本發明人經過試驗驗證，發現2mg/mL生物素化的抗體羊抗兔以1: 250稀 釋作為4全測兔血清中鼠疫抗體，檢測結杲顯示生物素化檢測抗體Bio-羊抗兔抗體可獲得高檢測值和低背景值的檢測效果；2mg/mL生物素化的抗體羊抗人以1: 2500稀釋作為檢測人血清中鼠疫抗體，檢測結果顯示生物素化檢測抗體Bio-羊 抗人抗體可獲得高;f全測值和低背景值的檢測效果。實施例3、懸浮晶片樣品製備、檢測及結果判定1、 待測樣品製備用樣品稀釋液將待測樣本配置為不同濃度樣本進行蛋白懸浮晶片檢測。2、 樣品的檢測及結果判定檢測過程全部反應均在96孔濾板上進行，檢測過程如下1) 每孔加入50pL含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌並用真空泵抽濾；2) 加入50 |iL檢測樣品，混勻後室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌並抽濾；3) 加入50 適當濃度的用抗體稀釋液稀釋後的生物素化抗體，混勻後室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌並真空泵抽濾； '4) 加入50(iL的SA-PE，混勻後室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌並真空泵 抽濾；5) 加入125pL的檢測緩沖液，經蝸旋重懸混勻；6) 用懸浮晶片系統讀取MFI數值並分析數據。3、 檢測結果判定根據試驗研究結果與相關研究報導，本發明定義蛋白懸浮晶片方法檢測鼠 疫抗體的最低檢出限(LOD值)為檢測螢光強度臨界值(Cutoff)對應的檢測物 濃度。其中，Cutoff的定義是採用空白對照樣品(Blank)螢光4全測信號MFI均 值加3倍標準差(SD),即Cutoff值為=細1(空白對照)+3倍標準差。若檢測 結果高於Cutoff對應萸光強度值則判定為鼠疫抗體檢測結果陽性；若檢測結果 低於Cutoff對應螢光強度值則判定為鼠疫抗體檢測結果陰性。實施例4、懸浮晶片對鼠疫F1蛋白抗原特異性檢測應用懸浮晶片檢測方法分別對兔抗結核IgG 、鼠抗流感NP IgG、兔抗SARS IgG 、兔抗禽流感H5N1血清、兔抗鼠疫FlIgG、 BSA、酪蛋白、胰蛋白腖等 進行檢測，根據實施例3中檢測結果判定標準，僅兔抗鼠疫F1 IgG為陽性，其餘幹擾抗體或蛋白均為陰性。說明本發明所建立的鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片檢 測方法與其它測試抗體均不發生交叉反應或非特異反應。實施例5、懸浮晶片定量檢測模型的建立1 、兔抗鼠疫F1 IgG標準曲線樣品製備用樣品稀釋液將兔抗鼠疫FlIgG標準品由80略/mL以4倍倍比梯度稀釋至 73.6pg/mL成系列濃度樣品。2 、劑量-反應標準曲線的繪製按照實施例3中的檢測方法檢測上述系列濃度樣品，並根據懸浮晶片系統 檢測結果繪製劑量-反應標準曲線(如圖2所示)。其中，X軸代表抗體的濃度 (ng/mL) , Y軸代表懸浮晶片儀檢測的螢光值(MFI)。每個數據代表3次的 檢測結果平均值，坐標軸以對數-對數關係設定，圖2中兔抗鼠疫FlIgG的濃度 (ng/mL)分別為Sl: 0.0763, S2: 0.305， S3: 1.221， S4: 4.883, S5: 19.531, S6: 78.125, S7: 312.5， S8: 1250.0, S9: 5000.0 ， S10: 20000.0。懸浮晶片系統根據檢測結果擬合兔抗鼠疫FlIgG劑量-反應標準曲線方程 FI = -7.99831 +(16838.6+ 7.99831)/[1 +(Conc/ 1006.33)—3 5361Y 198701 3、懸浮晶片檢測兔抗鼠疫FllgG的靈^t度和動態範圍根據最低檢出限定義和劑量-反應標準曲線方程，本發明即蛋白懸浮晶片方 法檢測兔抗鼠疫FlIgG的靈敏度為50.3pg/mL (Cutoff =8 , Blank=8, SD=0 )。本發明定義最高檢出限為使編碼微球的結合位點處於飽和狀態的檢測物濃 度。根據標準曲線隨著兔抗鼠疫FlIgG濃度的升高，其對應的MFI值也隨之遞 增，當兔抗鼠疫FlIgG濃度達到0.025mg/mL時，抗原抗體的免疫反應即達到t包 和狀態，MFI值也進入平臺期，說明樣品中的待檢物濃度高，需要將高濃度樣 品稀釋後再檢測。因此，根據最低檢出限與最高檢出限可以判定本發明即懸浮晶片定量l企測 兔抗鼠疫F1 IgG的動態範圍為4.883 ~ 25000ng/mL。實施例6、蛋白懸浮晶片方法與ELISA方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體的比較 1、生物素-親和素ELISA (BAS-ELISA)檢測方法作為對比，生物素-親和素ELISA採用包括下列步驟 1)向普通ELISA微孔板每孔加入50jxL用PBS緩衝液稀釋的禽流感H5蛋 白5-5Ong, 4。C靜止過夜；li2) 加入封閉液，在37。C封閉2小時；3) 洗液洗3次，拍幹；4) 加入檢測樣品，每孔50 pL,室溫放置40分鐘；洗液洗3次，拍幹；5) 加入適量生物素化檢測抗體，每孔50jiL,室溫放置30分鐘；洗液洗3次， 拍幹；6) 加入適量SA/HRP (辣根酶標記鏈黴親和素)，50pL/孔，室溫放置3分 洗液洗3次，拍幹；7) 加入TMB顯色液(可溶型單組分TMB底物溶液)顯色，50pL/孔，室溫 ;汰置10分鐘；8) 用2MH2S04終止反應；9) 應用酶標儀測讀A450nm數值。2、 本發明的懸浮晶片檢測方法採用間接法測抗體的免疫學檢測模式，檢測過程中全部反應均在96孔濾板 上進行。1) 每孔加入50jiL含相應編碼提0求的工作溶液，洗液洗滌並用真空泵4由濾2次；2) 加入50 檢測樣品，混勻後室溫避光震搖30分鐘，用清洗液洗滌並抽 濾3次；3) 加入50 (iL適當濃度的用抗體稀釋液稀釋後的生物素化抗體，混勻後室溫 避光震搖30分鐘，洗液洗滌並真空泵抽濾3次；4) 加入5(HiL的SA-PE,混勻後室溫避光震搖10分鐘。用清洗液洗滌並真 空泵;^由濾3次；5) 加入125)iL的檢測緩衝液，經蝸旋重懸混勻；6) 用Bio-Plex懸浮晶片系統讀取MF1數值並分析數據。3、 兩種檢測方法的靈敏度和動態範圍及相關性的比較製備的相同 一組兔抗鼠疫Fl抗體樣品用樣品稀釋液4倍比稀釋同時應用懸 浮晶片和ELISA方法進行檢測。繪製EUSA方法檢測兔抗鼠疫Fl抗體的標準 曲線(圖中橫坐標為樣品濃度，縱坐標為吸光度值，坐標軸取對數-對數關係)， 並與懸浮晶片方法結果進行比較。衝艮據兩種方法標準曲線懸浮晶片方法如圖2所示的靈敏度為2.12ng/mL, 線性4全測範圍1.22 2000000ng/mL; ELISA方法如圖3所示的靈敏度為312.5/mL， 線性檢測範圍312.5~20000ng/mL。可以得出結論檢測相同兔抗鼠疫Fl抗體樣12品，蛋白懸浮晶片方法比ELISA方法具有更高的檢測靈敏度，即高100倍；並 且具有更寬的動態檢測範圍，即高2個數量級。另夕卜，如圖4所示，將兩種方法檢測結果在312.5 20000ng/mL範圍內進行 比較可以判定蛋白質懸浮晶片方法與ELISA方法有良好的相關性，相關係數為 0.9994。實施例7、 Ajk清樣品的檢測、人血清樣品的準備將人血清樣品用樣品稀釋液1:10稀銜人血清樣本5pL加樣品稀釋液50|liL 混勻)後用於蛋白懸浮晶片檢測。 2、人血清樣品的檢測1) 每孔加入50pL含相應編碼微球的工作溶液，用清洗液洗滌並用真空泵抽濾；2) 加入50 待檢測人血清樣品，混勻後室溫避光震搖30分鐘，用清洗液 洗滌並抽濾；後室溫避光震搖30分鐘，洗液洗滌並真空泵抽濾；4) 加入50ixL的SA-PE，混勻後室溫避光震搖IO分鐘。洗液洗滌並真空泵 抽濾；5) 加入125nL的4全測緩衝液，經蝸旋重懸混勻；6) 用懸浮晶片系統讀取MFI數值，根據標準曲線，確定待檢測人血清中鼠 疫抗體的濃度。經過多次重複試驗，生物素化羊抗人IgG稀釋比例選用1: 2500稀釋，SA-PE 稀釋比例選用1: 300稀釋，經過對94份人血清的檢測，所得的MFI值的均值 與其標準差的3倍之和作為判斷陰陽性的界值，即Cutoff值為632.35,換算為 濃度值是9.6ng/mL,檢測得到的MFI值如杲大於632.35，即血清中的鼠疫抗體 濃度超過9.6ng/mL可視為鼠疫抗體陽性可能被鼠疫感染，如果MFI值小於 632.35,即血清中的鼠疫抗體濃度低於9.6ng/mL可判斷為鼠疫抗體陰性，未感 染鼠疫。
權利要求
1、一種採用蛋白懸浮晶片檢測血清樣品中鼠疫抗體的間接免疫學定量檢測方法，其特徵在於，檢測過程中全部反應可在96孔濾板或者微量離心管中進行，該方法包括下列步驟(1)包被微球的捕獲抗原為鼠疫F1蛋白抗原；(2)向孔內加入含已包被捕獲抗原編碼微球的工作溶液，用清洗液清洗；(3)加入待測血清樣品，孵育後清洗；(4)加入用生物素化的檢測抗體，孵育後清洗；(5)加入鏈親和素-藻紅蛋白，孵育後清洗；(6)加入檢測緩衝液後混勻；(7)用懸浮晶片系統讀取平均螢光強度(MFI)數值並分析數據判定檢測結果。
2、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，採用生物素標記的羊抗人IgG 作為檢測抗體，其與鼠疫F1蛋白抗原的組合組成間接法4企測體系。
3、 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述的包被孩史球的捕獲抗原 鼠疫F1蛋白抗原用量為6嗎/1.25xl6個編碼微球或12~24ng/2500^5000個孩0求/測試。
4、 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述方法中的標記檢測抗體 羊抗人IgG的生物素為羧基活性的生物素。
5、 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，2mg/mL生物素化的檢測抗 體Bio-羊抗人IgG以1: 2500稀釋作為檢測抗體進行檢測。
6、 一種定量檢測血清樣品中鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片方法，其特徵在於， 該方法包括下列步驟(1 )加入的陽性檢測樣品或標準品經梯度倍比稀釋，所述梯度倍比稀釋 為4倍；(2) 將系列稀釋樣品在懸浮晶片系統中檢測讀取對應螢光值(MFI);(3 )製作樣品濃度對應MFI值的劑量-反應曲線； (4)用分析軟體擬合劑量-反應曲線和方程；(5 )未知濃度樣品可根據劑量-反應曲線和方程判斷未知樣本中鼠疫抗體 的濃度，其特徵在於加入的陽性檢測樣品為兔抗鼠疫Fl IgG。
7、 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，用於包被微球的捕獲抗原為 鼠疫F1蛋白，採用生物素標記的羊抗兔抗體作為4全測抗體，並且其組合 組成間接法檢測體系。
8、 一種檢測血清樣品中鼠疫抗體的蛋白懸浮晶片，該晶片包括編碼微 球，作為包被微球抗原的鼠疫Fl抗原，生物素標記的羊抗兔IgG和羊抗 人IgG作為檢測抗體，鏈親和素-藻紅蛋白和適宜的緩衝溶液。
9、 權利要求8所述蛋白懸浮晶片的製備方法，其特徵在於，在相關緩衝 溶液中，編碼微球用鼠疫Fl抗原包被、用生物素標記的4企測抗體為羊抗 兔IgG和羊抗人IgG、用鏈親和素-藻紅蛋白(SA-PE)作為信號檢測物。
全文摘要
本發明涉及一種新的檢測血清樣本中鼠疫菌抗體的定量檢測方法和產品。本發明的方法檢測能力好、靈敏度高、特異性強、動態範圍寬，並建立了以鼠疫抗體為代表的病原菌抗體蛋白質懸浮晶片檢測的開放性檢測模式化平臺。
文檔編號G01N33/569GK101533019SQ200910082599
公開日2009年9月16日 申請日期2009年4月28日 優先權日2009年4月28日
發明者孫肖紅, 宇 楊, 楊永莉, 靜 王, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院