玉米C₄型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麥生產中的應用的製作方法

2023-05-05 01:48:51 1

專利名稱：玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麥生產中的應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物基因領域，具體涉及一種玉米(禾本科玉米屬，Ze"m"^L.) 中C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpymvate carboxylase, PEPC)基 因及其在小麥生產中的應用。
背景技術：
小麥、水稻等農作物是我國主要的糧食作物，其生產能力及供需狀況始終 關係到我國國民經濟發展和糧食安全等重大戰略問題。從世界範圍來看，世界 糧食生產狀況始終與各國政治、經濟發展狀況緊密聯繫，糧食生產量和儲備量 一有下降，國際糧價就大幅攀升，恐慌情緒就大勢蔓延，對各國的政治經濟形 勢造成重大影響；從國內來看，隨著我國人口的增長，工業化和城鎮化的快速 發展，對糧食的需求將持續加大。同時，由於我國糧食作物種植面積不可能大 幅度恢復增長，因此要保障我國糧食安全，唯一的出路是持續提高單產，這就 要求在小麥、水稻等主要糧食作物的產量性狀遺傳改良方面獲得跨越性的進展。
光合作用是一切綠色植物物質生產的基礎，據估計，植物地上部乾物質的 90%來自於光合作用。因此，提高作物產量的關鍵是提高光能利用效率，從而提 高單位面積的產量。而要大幅度提高光能利用率和實現超高產，必須採取合理 株型(外在光合效率)和高光效(內在光合效率)相結合的技術路線。目前小 麥、水稻等農作物單產水平的提高，主要是由於品種產量潛力遺傳改良和生產 條件改善的結果，而產量潛力的遺傳改良主要是通過形態性狀的改良和雜種優 勢等途徑來實現的，在現有小麥、水稻等農作物品種產量水平已相對較高，且 都已具有良好的形態結構，葉面積指數和收穫係數都己接近極限的情況下，再 單純依靠上述途徑巳很難實現產量潛力的跨越式提高。在此背景下，國內外許 多學者把目光紛紛投向光能利用效率的遺傳改良研究，希望通過提高光合效率來實現生物學產量的大幅度提高，進而獲得產量潛力改良的突破性進展。
根據光合作用途徑的不同，植物可分為C3型、C4型和CAM (景天酸)型。 Q和CAM植物是在逆境下經過長期馴化，從C3植物進化而來的。與小麥、水稻、
大豆等C3植物相比，玉米、高粱、甘蔗等C4植物具有C02濃縮機制，光補償點高，
C02補償點低，光呼吸弱，特別在高溫、乾旱等逆境條件下具有明顯的光合優勢。 由於C4植物具有高光合、高水分、高氮素利用效率以及高生物學產量，因此將 Q途徑引入C3植物以提高其光合效率和籽粒產量， 一直是國內外生物學研究領 域的重大科學命題。以前此方面的研究主要途徑是同室篩選、細胞融合和遠緣 雜交等方法，但一直未獲得突破性進展。近年來日趨成熟的轉基因技術由於可 以打破物種間的生殖隔離，實現基因在不同物種中的交流，因此已成為解決農 作物重要性狀遺傳改良瓶頸問題的主要技術途徑。
PEPC是C4光合途徑中第一個也是最關鍵的酶，其主要分布在C4植物葉肉細 胞的葉綠體內，形成C02濃縮機制，為維管束鞘細胞進行的C3途徑提供C02。 1999 年Maurice S.B. Ku等將玉米j^^基因轉入水稻，獲得的轉基因植株PEPC活性較 未轉化對照高110倍，轉;^^基因水稻已具備初級的C02濃縮機制，C02補償點降 低，光呼吸顯著減弱，光飽和點、淨光合速率及羧化效率明顯提高，耐光抑制 和光氧化能力顯著增強，產量較未轉化對照可提高10%—30%。但是，該項研究 所利用的p印c基因全長接近9kb，目的片段過大，對於小麥、水稻等農作物的規 模化遺傳轉化研究難度較大。因此，通過篩選不同玉米自交系材料，獲得高光 效玉米種質資源作為P印cr基因的供體材料，並從中克隆C4型p卬cr基因的cDNA序
列，可獲得優異的C4型/7印C基因供體材料，並可克隆出片段顯著減小、適合於小
麥、水稻等農作物規模化遺傳轉化的目的基因，為C3農作物高光效基因工程研
究提供重要的基因來源。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供了一種玉米中編碼Q型磷酸烯醇式丙酮 酸羧化酶(PEPC)基因的核苷酸序列及其編碼的胺基酸序列，還提供了該基因
在C3型農作物小麥生產中的應用。是
玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因克隆、生物信息學分析包括以下過
程
(1)玉米高光效材料篩選。通過光合特性分析、酶活測定等手段，從大量玉 米種質資源中篩選出高光效玉米材料；(2)目的基因克隆與載體構建。從玉米自 交系Z561中提取總RNA，反轉錄合成cDNA。根據GenBank (登錄號X15238) 中公布的序列，設計一對引物，以cDNA為模板進行PCR擴增，得到目的條帶 並回收，通過T/A克隆法連接到pMD-19T載體上，形成含目的基因的克隆載體 pMD19-pepc，熱激法將克隆載體導入￡力0//感受態細胞01153，並進行目的基因 測序。利用雙酶切的方法，將目的基因重組進真核表達載體pCAMBIA3301; (3) 生物信息學分析。針對獲得的目的基因序列，用生物信息學軟體進行同源性分 析、胺基酸序列進化樹分析和功能位點分析；(4)/^^在小麥中的應用。
本發明的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因是下列核苷酸序列之一
(1) 序列表中的SEQIDNo: l所示的核苷酸序列；
(2) 編碼SEQIDNo: 2所示的蛋白質序列的核苷酸序列。 所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特徵在於所述基因的
引物序列如下，
Pl: 5'-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG-3'禾口 P2: 5'-GGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT畫3'。 所述基因的克隆載體為pMD19-pepc，真核表達載體為p3301-pepc，宿主菌
為E.coli感受態細胞DH5a。
所述玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有所述核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶具有SEQ ID No: 2所示的氨基 酸序列。
所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麥高光效基因工程 育種及生產中的應用。
5本發明的積極效果
1. 通過同源克隆法從玉米材料中克隆了 c4型高光效磷酸烯醇式丙酮酸羧化 酶基因，並進行了生物信息學分析，提供了玉米C4型pepc基因的核苷酸序列、 編碼的胺基酸序列以及生物學信息。
2. 提高光合效率是小麥等農作物超高產育種的重要技術途徑。本項研究通過 將玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的真核表達載體pCAMBIA3301用基因槍 法導入小麥，用分子手段驗證外源/^c基因在轉基因小麥植株中的整合和表達。 對轉基因植株的功能分析(光合特性分析)結果表明，轉基因植株的淨光合速 率較未轉化對照實現了大幅度提高，增幅最大的提高了 1.39倍，為目前國內外 提高C3作物淨光合速率幅度最大的一項研究。上述結果表明，本發明所涉及的
玉米C4型高光效;^pc基因可實現小麥等C3作物淨光合速率的大幅度提高，將 為小麥等Q農作物高光效轉基因育種提供重要的技術與材料支撐，因此具有重 大的現實意義。
3. 獲得的高光效轉基因小麥種質為揭示C4途徑關鍵酶基因在C3作物中的遺 傳與表達規律提供重要的理論支撐，為C3作物高光效轉基因育種提供重要的共 性技術基礎，因此對於C3作物高光效基因工程研究具有重要的理論意義。


圖1玉米C4型pepc基因cDNA的PCR產物電泳結果
圖2玉米C4型PEPC蛋白與其它C3、 C4植物PEPC蛋白進化樹分析結果
圖3玉米Ct型PEPC蛋白功能位點分析結果
圖4玉米(34型PEPC蛋白與其它C3、 Q植物PEPC蛋白胺基酸部分序列比
較
圖5轉基因植株基因的PCR產物電泳分析
圖屮1-8， 10-16:部分轉基因植株；17:陽性對照(質粒)；18:非轉基因對照植株；9: DNA分子量標準。
圖6轉基因小麥/ e^c基因表達的RT-PCR檢測
圖中，1-6:轉基因植株；Ck:非轉基因對照植株。圖7轉基因To代/ ^c基因Southern雜交檢測
圖中，1:陽性對照；2:非轉基因對照植株；3-8:部分轉基因植株。 實施例l :玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的克隆及生物信 息學分析 1.材料與方法 1.1材料
1.1.1植物材料及試劑
本發明所涉及玉米自交系材料由河南省農業科學院糧食作物研究所提供。 實驗用RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自天為時代公 司，MLV反轉錄試劑盒購自Promega公司，LA-TaqDNA聚合酶、pMD-19T克 隆載體、大腸桿菌(菌株DH5a感受態細胞製備試劑盒均為 TaKaRa公司產品，植物表達載體pCOMBIA3301為本實驗室保存，限制性內切 酶為MBI公司產品，氨苄青黴素為Amersco公司產品，其餘試劑為進口或國產 分析純。
1.1.2引物設計及合成
根據已報導的玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的cDNA序列 (GenBank登錄號X15238)，利用Primer 5.0軟體設計一對引物，序列為
Pl: 5'—GCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG匪-3'
P2:5'—GCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT—3'，
所用引物由上海生物工程公司合成。 1.2方法
1.2.1高光效玉米自交系篩選
選擇8月份晴朗無雲的天氣，利用CIRAS-1光合分析系統和葉綠素螢光動 力學分析儀分析玉米種質資源的光合特性，並於室內分析上述種質資源的PEPC 酶活性。
1.2.2總RNA提取及反轉錄
在晴天中午光照較強時，提取玉米幼嫩葉片總RNA，進行反轉錄。總RNA
7提取及cDNA合成參照RNA提取試劑盒和MLV反轉錄試劑盒說明書進行。 1.2.3 PCR產物的克隆與測序 1.2.3.1 PCR反應
以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系如下
ddmO 30.9nl
Buffer 5 jil dNTP(20mM， mix) 10|il
PI 1 pi
P2 1 pi
質粒DNA 1.6 pi
LA-Taq 0.5|il
PCR反應程序採用兩步法進行，94"C預變性5min; 94"C變性30s， 62'C復 性30s， 72。C延伸3min， 35個循環;然後72。C延伸10 min。 1.2.3.2克隆載體構建
PCR產物用0.8M瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下3kb的目的條帶，用瓊脂糖凝 膠DNA回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段與克隆載體pMD-19進行 連接，連接體系如下
目的片段 4.5pl
p函-19 0.5 pl
Solutionl 5 pl
Total 10 |il
16。C連接過夜。
從-80。C冰箱取出100ri感受態細胞DH5a，解凍，加入連接液，冰 浴30分鐘，42。C水浴90秒，取出Eppendorf管後立即置於冰浴中放置2-3分 鍾，其間不要搖動離心管。加入37。C的LB(不含抗生素)培養基600W， 37°C 振蕩培養1小時。4000rpm離心2分鐘，吸除600W培養液，留下培養基 懸浮菌液。菌液與叫1IPTG及401^1 X-gal混合塗含有50mg/Ap的LB平板上，37°C12-16小時。挑選白色菌落於含50mg/L的氨苄青黴素的LB液體培養基， 37'C劇烈振蕩下培養過夜。鹼裂解法提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒 大小，經PCR和酶切鑑定後，進行測序。 1.2.3.3真核表達載體構建
首先對質粒pMD19-pepc進行Pml I和Bgl II雙酶切消化，回收; 印c基因目 的片段，與經過PmlI和Bgin雙酶切的質粒pCOMBIA3301連接，轉化E.coli DH5a菌株，經卡那黴素抗性篩選，將含有/^pc基因的陽性克隆命名為 p3301-pepc。連接反應程序為
Ligase Buffer 1 |il
pCOMBIA3301 4 pl
目的片段 4pl
T4 DNA ligase1 (il
22。C恆溫過夜。
從-80。C冰箱取出100lil感受態細胞DH5a，解凍，加入10pl連接液，冰浴 30分鐘，42。C水浴90秒，取出Eppendorf管後立即置於冰浴中放置2-3分鐘， 其間不耍搖動離心管。加入37。C的LB(不含抗生素)培養基600^， 37。C振蕩培 養1小時。4000rpm離心2分鐘，吸除600^1培養液，留下100^1培養基懸浮菌 液。菌液塗於含有50mg/L卡那黴素的LB平板上，37°C、 250rpm小時。挑選 菌落於含50mg/L卡那黴素的LB液體培養基，37°C、 250rpm振蕩下培養過夜。 鹼裂解法提取質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒大小，經PCR和酶切鑑定。 1.2.3.4 p印c基因序列生物信息學分析
將核苷酸測序結果在NCBI伺服器上用Blast搜索軟體進行同源性基因檢 索分析，禾U用網際網路在http:〃www.expasy.org/tools/protparam.html上對玉米； e/7c 基因所表達的蛋白質胺基酸序列進行理化性質分析，應用DNAMAN軟體對8 個PEPC蛋白胺基酸序列做系統進化分析。 2.結果與分析
2.1玉米C4型p印c基因的克隆
9以玉米總RNA為模板，01igo(dT)15為引物反轉錄合成總cDNA，以cDNA 為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果，在3kb處有一條亮帶(見附圖1)， 回收該片段與測序載體連接後進行測序。 2.2玉米C4型p卬c基因cDNA序列測定
核苷酸序列分析表明，該開放閱讀框全長2910bp，編碼970個胺基酸，如 SEQIDNo: 1和SEQIDNo: 2所示序列。與已登陸的玉米/ e/^基因(X15238) 相比，核苷酸序列中有16處鹼基差異，分別為第105、 291、 621、 651、 657、 669、 798、 803、 852、 1168、 1416、 1531、 1543、 1614、 1785和1795位。上述 核苷酸序列的差異導致蛋白質水平上5處胺基酸差異，其中第803， 1168， 1531， 1614和1795位的變化使編碼的胺基酸分別由非極性的AIa變為酸性的Asp，非 極性的Phe變為非極性的Leu，非極性的Pro變為極性的Ser，酸性的Asp變為 酸性的Glu，酸性的Asp變為極性的Tyr，其它鹼基的變化不影響胺基酸編碼。 2.3玉米C4型PEPC蛋白胺基酸序列分析
禾U用網際網路在http:〃www.expasy.org/tools/protparam.html上對玉米pe/ c基因 所表達的蛋白質胺基酸序列進行理化性質分析，表明該基因由970個胺基酸組 成，分子量為109.359KD，等電點PI為5.77，分子式C4883H7726N134401444S31，不 穩定係數為45.74。
2.4玉米PEPC蛋白胺基酸序列的系統進化分析
應用DNAMAN軟體對8個PEPC蛋白胺基酸序列做系統進化分析。從系統 進化樹中可以看出(見附圖2)，所克隆的玉米C4型PEPCase與甘蔗和高粱的 C4型遺傳距離最近，與穀子C4型次之。穀子C4型先與C3型PEPC聚為一類， 然後再與Q型聚合，表明玉米Q型PEPCase與甘蔗和高粱的(34型同源性高於 與穀子C4型PEPCase的同源性。 2.5玉米C4型PEPC編碼蛋白質的功能位點分析
在EMBL伺服器上用Iterproscan軟體對克隆的玉米C4型PEPC編碼蛋白質 的功能位點進行分析，結果表明，玉米PEPC蛋白質胺基酸序列有7個保守區(見 附圖3)。其中，15—970胺基酸序列為該蛋白質的功能域部分，177位的組氨酸
10(H)可能與草醯乙酸(OAA)的形成有關，606位的賴氨酸(K)和639位的 組氨酸(H)可能與底物PEP結合有關，731位的纈氨酸(V)和780位的絲氨 酸(S)為C4型PEPCase特性，而在C3和CAM植物中，PEPCase在731位和 780位左右的胺基酸分別是異亮氨酸(I)和丙氨酸(A)(見附圖4), C末端731 位和780位的胺基酸分別是纈氨酸(V)和絲氨酸(S)，表明是該基因是一個 C4型基因。C末端區域包含有高度保守的賴氨酸殘基，推測可能是PEP結合位 點。另外，還含有與催化機制有關的高度保守區域。
實施例2玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因導入小麥及其功能分析 1.材料與方法
1.1材料
1.1.1植物材料及試劑
5個小麥品種(系):周麥19、 00H97-54-2-7、鄭麥9023、 17-1和新麥18
由河南省農科院小麥研究中心分子育種研究室提供。基因槍試劑及耗材購自美 國伯樂公司，PCR試劑購自大連寶生物公司，其餘試劑為進口或國產分析純。 1.2方法
1.2.1目的基因的轉化、篩選與再生
以5個小麥品種(系)的幼胚為受體材料。取開花後12-14d的穗中部、大 小致的未成熟種子，用70%的酒精表面消毒lmin，無菌水衝洗3次後用0.1% 的HgCl2消毒10min，無菌水衝洗3-4次。無菌條件下剝出幼胚(lmm左右)， 於含有2mg/L 2，4-D的MS誘導培養基上暗培養4-5d後，置於高滲培養基上滲 透處理4-6h，基因槍轟擊後高滲處理16h，轉至愈傷誘導培養基。培養2周後轉 至草丁膦抗性篩選再生培養基，連續篩選2代，每代2周，經過篩選的抗性苗 轉至生根培養基，生根、壯苗後移入花盆中。 1.2.2轉化植株的PCR分析鑑定
CTAB法提取草丁膦抗性植株和對照植株葉片的總DNA，用於轉化植株目 的基因的PCR篩選，所用引物為P3: 5 ， - TGGAAGGGCGTGCCTAAGTT-3 ， 和 P4:5， -ATGCCGAGGTGCGTGGTGAT-3'。目的片段大小為668bp，擴增程序為94。C預變性3min; 94"C變性15s， 58'C復性15s， 72。C延伸30s， 34個循環; 72。C延伸10min。
1.2.3轉基因小麥pepc基因表達的半定量RT-PCR分析
在晴天晴朗條件下，提取對照和轉基因小麥植株幼嫩葉片總RNA,並進行 反轉錄。分別以其cDNA為模板進行半定量RT-PCR分析。p印c基因引物與PCR 鑑定時相同，Jc"w基因作為內參對照，引物序列為
AP1: 5'-GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC國3';
AP2: 5'-GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC誦3'。
PCR程序為94。C預變性2min; 94。C變性15s， 55'C復性15s， 72。C延伸15s， 34個循環；72'C延伸10min。 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。 1.2.4轉基因Southern雜交
Southern雜交由北京鼎國生物技術有限公司完成。取部分經PCR檢測的轉 基因植株和未轉化陰性對照DNA用HindIII酶切、電泳、洗膠、轉膜、預雜交後， 質粒p3301-pepc用Pml I和Bgl II雙酶切，以酶切獲得的戸戶c基因片段為探針 進行雜交，洗膜後在-7(TC冰箱中放射自顯影3-4天。 l丄5 T。代轉基因小麥植株氣體交換測定
在小麥孕穗期，選擇上午11時晴朗無雲天氣時，利用CIRAS-1可攜式光合 測定系統(選自英國PP System公司)測定轉基因和對照植株葉片的淨光合速率。 每株測定倒一葉、倒二葉和倒三葉，取其平均值。測定時葉室溫度為26。C左右， 光照強度lOOO-llOOPmol m-2s-l，環境溫度25。C左右。 2.結果與分析
2.1轉玉米C4型/;e/7c基因的獲得及PCR檢測結果
本研究共獲得400株草丁膦抗性再生植株，其中周麥19抗性再生植株52 株，00H97-54-2-7抗性再生植株92株，鄭麥9023抗性再生植株122株，17-1 抗性再生植株83株，新麥18抗性再生植株51株。提取所有抗性再生植株總 DNA，進行PCR擴增，對照植株均未擴增出目標條帶，抗性再生植株中有344 株擴增出668bp的目的條帶(見附圖5)，其中周麥19有49株，00H97-54-2-7有87株，鄭麥9023有86株，17-l有73株，新麥18有47株。周麥19、00H97-54-2-7、 鄭麥9023、17-1和新麥18轉化植株的PCR陽性頻率分別為1.530/。，4.01。/。，2.57。/。， 2.10%和0.76% (見表l)。初步證明目的基因已整合到小麥DNA中。
表i基因槍轉化不同基因型小麥的轉化頻率
基因型轟擊幼胚數抗性幼苗數PCR陽性植株數PCR陽性頻率
周麥19320052491.53
00H97-54-2216792874.01
鄭麥90233348m862.57
17-1347483732.10
新麥18615151470.76
其中PCR陽性頻率- (PCR陽性植株數/轟擊幼胚總數)X100
2.2轉基因小麥p印c基因表達的半定量RT-PCR檢測結果
取1株對照和6株轉基因小麥植株，提取總RNA，分別進行pepc基因和Actin 基因的RT-PCR擴增。以Actin基因確定PCR的循環數為35吋進入平臺期，因此PCR 取34個循環。用J"i77調整模板用量，當擴增產物的亮度基本一致時，可確定模 板濃度一致，以用於pepc基因擴增。擴增結果見圖7，對照植株沒有擴增出目的 條帶，而6株轉基因小麥植株均擴增出668bp的目標條帶。不同轉基因植株表達 pe/^的量存在較大差異，l號和2號的表達量明顯高於其它植株，3號表達量較低。 內參4"/"基因的表達在對照和轉基因植株間沒有差別，表明玉米pe/7c基因在小 麥基肉組中得到了正確轉錄。見附圖6。 2.3轉基因小麥Southern雜交驗證
Southem雜交結果顯示，所選取的經PCR檢測的轉基因植株均出現1至多條雜 交帶，證明玉米高光效p印c基因已經整合進轉基因植株中，見附圖7。 2.4 TO代轉基因小麥植株淨光合速率測定結果
在5個受體材料中分別選擇生育期和對照一致的轉基因T0代PCR陽性植株 測定其淨光合速率。由表2可看出，在所檢測的28株轉基因植株中，除周麥19有 3株光合速率低於對照外，其餘25株均高於對照(佔89.3%)，光合速率比對照增 力口3%-30%的有6株，佔21.4%;增加30°/。-100%的有14株，佔50%;增加100%以
13上的有5株，佔17.9%。光合速率最高的(20.03)轉基因植株較未轉化對照(8.37) 提高了139%。光合速率增幅除在OOH97-54-2和鄭麥9023間無差異以外，其餘不 同材料間差異明顯，可能與所檢測植株數目較少有關。17-1增幅100%以上的佔 62.5%,新麥18增幅在30%-100%之間。此結果證明轉入的玉米pepc基因在小麥 中得到了正確表達，並使部分轉基因植株淨光合速率明顯提高。
表2轉基因植株淨光合速率頻率分布
基因型範圍低於對照增加3-30%增加30-100%增加 100%以上對照光合速 率
周麥19個體數 頻率(％)3 50%3 50%0 00 013. 59
00H97-54-2-個體數012011. 70
7頻率(％)033. 3%66. 7%0鄭麥9023個體數 頻率(％)0 01 33. 3%2 66. 7%0 011.40
17-1個體數(]1258.37
頻率(％)012. 5%25%62. 5%新麥18個體數 頻率(％)0 00 08 100%0 08. 57
14序列表
河南省農業科學院
—種玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因
PCR產物的克隆與測序
2
Patentln version 3.4
1
2913
DNA
禾本科玉米屬(Zeamo"L.)
1
噸gcgtcga cc肌ggc3cc cggccccggc gagaagcacc actccatcg3 cgcgcagctc 60
cgtcagctgg tcccaggcaa ggtctccgag gacgacaagc tcatcgagta cgatgcgctg 120
ctcgtcgacc gcttcctcaa catcctccag gacctccacg ggcccagcct tcgcgaattt 180
gtccaggagt gctacgaggt ctcggccgac tacgagggca aaggagacac gacgaagctg 240
ggcgagctcg gcgccaagct cacggggctg gcccccgccg acgccatcct cgtggcgagc 300
tccatcctgc 3catgctc犯cctcgcc犯c ctggccgagg昭gtgc紹at cgcgcaccgc 360
cgccgcaaca gcaagctcaa gaaaggtggg ttcgccgacg agggctccgc caccaccgag 420
tccgacatcg aggagacgct caagcgcctc gtgtccgagg tcggcaagtc ccccgaggag 480
gtgttcgagg cgctcaagaa ccagaccgtc gacctcgtct tcaccgcgca tcccacgcag 540
tccgcccgcc gctcgctcct gcagaaaaac gccaggatcc ggaattgtct gacccagctg 600
aatgccaagg acatcactga cgacgacaag caggagctcg atgaggctct gcagagagag 660
atccaagcag ccttcagaac cgatgaaatc aggagggcac aacccacccc ccaggacgaa 720
atgcgctatg ggatgagcta catccatgag actgtatgga agggcgtgcc taagttcttg 780
cgccgtgtgg atacagccct gaagaatatc ggcatcaatg agcgccttcc ctacaatgtt 840
tctctcattc ggttctcttc ttggatgggt ggtgaccgcg atggaaatcc aagagttacc 900ccggaggtga caagagatgt atgcttgctg gccagaatga tggctgcaaa cttgtacatc 960
gatcagattg aagagctgat gtttgagctc tctatgtggc gctgcaacga tgagcttcgt 1020 gttcgtgccg aagagctcca cagttcgtct ggttccaaag ttaccaagta ttacatagaa 1080
ctctggaagc aaattcctcc aaacgagccc taccgggtga tactaggcca tgtaagggac 1140 aagctgtaca acacacgcga gcgtgctcgc catctgctgg cttctggagt ttctgaaatt 1200
tcagcggaat cgtcatttac cagtatcgaa gagttccttg agccacttga gctgtgctac 1260
aaatcactgt gtgactgcgg cgacaaggcc atcgcggacg ggagcctcct ggacctcctg 1320
cgccaggttt tcacgttcgg gctctccctg gtgaagctgg acatccggca ggagtcggag 1380 cggcac3ccg 3cgtgatcg3 cgccatcacc acgcscctcg gcatcgggtc gtaccgcgag1440 tggtccgagg acaagcggca ggagtggctg ctgtcggagc tgcgaggcaa gcgcccgctg 1500
ctgcccccgg accttcccca gaccgaggag atcgccgacg tcatcggcgc gttccacgtc 1560
ctcgcggagc tcccgcccga cagcttcggc ccctacatca tctccatggc gacggccccc 1620
tcggacgtgc tcgccgtgga gctcctgcag cgcgagtgcg gcgtgcgcca gccgctgccc 1680
gtggtgccgc tgttcgaaag gctggcctac ctgcagtcgg cgcccgcgtc cgtggagcgc 1740
ctcttctcgg tggactggta catggaccgg atcaagggca agcagcaggt catggtcggc 1800
tactccgact ccggcaagga cgccggccgc ctgtccgcgg cgtggcagct gtacagggcg 1860 caggaggaga tggcgcaggt ggccaagcgc tacggcgtca agctcacctt gttccacggc 1920 cgcggaggca ccgtgggcag gggtggcggg cccacgcacc ttgccatcct gtcccagccg 1980 ccggacacca tcaacgggtc catccgtgtg acggtgcagg gcgaggtcat cgagttctgc 2040 ttcggggagg agcacctgtg cttccagact ctgcagcgct tcacggccgc cacgctggag 2100 cacggcatgc acccgccggt ctctcccaag cccgagtggc gcaagctcat ggacgagatg 2160 gcggtcgtgg ccacggagga gtaccgctcc gtcgtcgtca aggaggcgcg cttcgtcgag 2220 tacttcagat cggctacacc ggagaccgag tacgggagga tgaacatcgg cagccggcca 2280 gccaagagga ggcccggcgg cggcatcacg accctgcgcg ccatcccctg gatcttctcg 2340
tggacccaga ccaggttcca cctccccgtg tggctgggag tcggcgccgc attcaagttc 2400
gccatcgaca aggacgtcag gaacttccag gtcctcaaag agatgtacaa cgagtggcca 2460
ttcttcaggg tcaccctgga cctgctggag atggttttcg ccaagggaga ccccggcatt 2520
gccggcttgt atgacgagct gcttgtggcg gaagaactca agccctttgg gaagcagctc 2580
agggacaaat acgtggagac acagcagctt ctcctccaga tcgctgggca caaggatatt 2640cttgaaggcg atccattcct gaagcagggg ctggtgctgc gcaaccccta catoaccacc 2700
ctgaacgtgt tccaggccta cacgctgaag cggataaggg accccaactt caaggtgacg 2760
ccccagccgc cgctgtccaa ggagttcgcc gacgagaaca agcccgccgg actggtcaag 2820
ctg犯cccgg cgagcgagte cccgcccggc ctggaagaca cgctcatcct caccatgaag 2880
ggcatcgccg ccggcatgca gaacactggc tag 2913
2 970 PRT
禾本禾鬥玉米屬(Zeawfl^L.) 2
Met Ala Ser Thr Lys Ala Pro Gly Pro Gly Glu Lys His His Ser 15 10 15
lie Asp Ala Gin Leu Arg Gin Leu Val Pro Gly Lys Val Ser Glu 20 25 30
Asp Asp Lys Leu lie Glu Tyr Asp Ala Leu Leu Val Asp Arg Phe
35 40 45
Leu Asn lie Leu Gin Asp Leu His Gly Pro Ser Leu Arg Glu Phe
50 55 60
Val Gin Glu Cys Tyr Glu Val Ser Ala Asp Tyr Glu Gly Lys Gly
65 70 75
Asp Thr Thr Lys Leu Gly Glu Leu Gly Ala Lys Leu Thr Gly Leu
80 85 90
Ala Pro Ala Asp Ala lie Leu Val Ala Ser Ser lie Leu His Met
95 100 105
Leu Asn Leu Ala Asn Leu Ala Glu Glu Val Gin lie Ala His Arg
110 115 120
Arg Arg Asn Ser Lys Leu Lys Lys Gly Gly Phe Ala Asp Glu Gly125 130 135
Ser Ala Thr Thr Glu Ser Asp lie Glu Glu Thr Leu Lys Arg Leu
140 145 150
Val Ser Glu Val Gly Lys Ser Pro Glu Glu Val Phe Glu Ala Leu
155 160 165
Lys Asn Gin Thr Val Asp Leu Val Phe Thr Ala His Pro Thr Gin 170 175 180
Ser Ala Arg Arg Ser Leu Leu Gin Lys Asn Ala Arg lie Arg Asn
185 190 195
Cys Leu Thr Gin Leu Asn Ala Lys Asp lie Thr Asp Asp Asp Lys 200 205 210
Gin Glu Leu Asp Glu Ala Leu Gin Arg Glu lie Gin Ala Ala Phe 215 220 225
Arg Thr Asp Glu lie Arg Arg Ala Gin Pro Thr Pro Gin Asp Glu
230 235 240
Met Arg Tyr Gly Met Ser Tyr lie His Glu Thr Val Trp Lys Gly 245 250 255
Val Pro Lys Phe Leu Arg Arg Val Asp Thr Ala Leu Lys Asn lie
260 265 270
Gly lie Asn Glu Arg Leu Pro Tyr Asn Val Ser Leu lie Arg Phe
275 280 285
Ser Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Arg Val Thr
290 295 300
Pro Glu Val Thr Arg Asp Val Cys Leu Leu Ala Arg Met Met Ala
305 310 315
Ala Asn Leu Tyr lie Asp Gin lie Glu Glu Leu Met Phe Glu Leu
320 325 330
Ser Met Trp Arg Cys Asn Asp Glu Leu Arg Val Arg Ala Glu Glu
335 340 345
18Leu His Ser Ser Ser Gly Ser Lys Val Thr Lys Tyr Tyr lie Glu 350 355 360
Leu Trp Lys Gin lie Pro Pro Asn Glu Pro Tyr Arg Val lie Leu 365 370 375
Gly His Val Arg Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Arg Glu Arg Ala Arg 380 385 390
His Leu Leu Ala Ser Gly Val Ser Glu lie Ser Ala Glu Ser Ser 395 400 405
Phe Thr Ser lie Glu Glu Phe Leu Glu Pro Leu Glu Leu Cys Tyr 410 415 420
Lys Ser Leu Cys Asp Cys Gly Asp Lys Ala He Ala Asp Gly Ser 425 430 435
Leu Leu Asp Leu Leu Arg Gin Val Phe Thr Phe Gly Leu Ser Leu 440 445 450
Val Lys Leu Asp lie Arg Gin Glu Ser Glu Arg His Thr Asp Val 455 460 465
lie Asp Ala lie Thr Thr His Leu Gly Ik Gly Ser Tyr Arg Glu 470 475 480
Trp Ser Glu Asp Lys Arg Gin Glu Trp Leu Leu Ser Glu Leu Arg 485 490 495
Gly Lys Arg Pro Leu Leu Pro Pro Asp Leu Pro Gin Thr Glu Glu 500 505 510
He Ala Asp Val lie Gly Ala Phe His Val Leu Ala Glu Leu Pro 515 520 525
Pro Asp Ser Phe Gly Pro Tyr He lie Ser Met Ala Thr Ala Pro 530 535 540
Ser Asp Val Leu Ala Val Glu Leu Leu Gin Arg Glu Cys Gly Val 545 550 555
Arg Gin Pro Leu Pro Val Val Pro Leu Phe Glu Arg Leu Ala Tyr560 565 570
Leu Gin Ser Ala Pro Ala Ser Val Glu Arg Leu Phe Ser Val Asp
575 580 585
Trp Tyr Met Asp Arg lie Lys Gly Lys Gin Gin Val Met Val Gly
590 595 600
Tyr Ser Asp Ser Gly Lys Asp Ala Gly Arg Leu Ser Ala Ala Trp 605 610 615
Gin Leu Tyr Arg Ala Gin Glu Glu Met Ala Gin Val Ala Lys Arg
620 625 630
Tyr Gly Val Lys Leu Thr Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Thr Val
635 640 645
Gly Arg Gly Gly Gly Pro Thr His Leu Ala lie Leu Ser Gin Pro
650 655 660
Pro Asp Thr He Asn Gly Ser lie Arg Val Thr Val Gin Gly Glu
665 670 675
Val lie Glu Phe Cys Phe Gly Glu Glu His Leu Cys Phe Gin Thr 680 685 690
Leu Gin Arg Phe Thr Ala Ala Thr Leu Glu His Gly Met His Pro
695 700 705
Pro Val Ser Pro Lys Pro Glu Trp Arg Lys Leu Met Asp Glu Met 710 715 720
Ala Val Val Ala Thr Glu Glu Tyr Arg Ser Val Val Val Lys Glu
725 730 735
Ala Arg Phe Val Glu Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu Thr Glu
740 745 750
Tyr Gly Arg Met Asn lie Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg Pro
755 760 765
Gly Gly Gly lie Thr Thr Leu Arg Ala He Pro Trp He Phe Ser
770 775 780
20說
Trp Thr Gin Thr Arg Phe His Leu Pro Val Trp Leu Gly Val Gly 785 790 795
Ala Ala Phe Lys Phe Ala lie Asp Lys Asp Val Arg Asn Phe Gin 800 805 810
Val Leu Lys Glu Met Tyr Asn Glu Trp Pro Phe Phe Arg Val Thr 815 820 825
Leu Asp Leu Leu Glu Met Val Phe Ala Lys Gly Asp Pro Gly lie 830 835 840
Ala Gly Leu Tyr Asp Glu Leu Leu Val Ala Glu Glu Leu Lys Pro 845 850 855
Phe Gly Lys Gin Leu Arg Asp Lys Tyr Val Glu Thr Gin Gin Leu 860 865 870
Leu Leu Gin lie Ala Gly His Lys Asp lie Leu Glu Gly Asp Pro 875 880 885
Phe Leu Lys Gin Gly Leu Val Leu Arg Asn Pro Tyr lie Thr Thr 890 895 900
Leu Asn Val Phe Gin Ala Tyr Thr Leu Lys Arg lie Arg Asp Pro 905 910 915
Asn Phe Lys Val Thr Pro Gin Pro Pro Leu Ser Lys Glu Phe Ala 920 925 930
Asp Glu Asn Lys Pro Ala Gly Leu Val Lys Leu Asn Pro Ala Ser 935 940 945
Glu Tyr Pro Pro Gly Leu Glu Asp Thr Leu lie Leu Thr Met Lys 950 955 960
Gly lie Ala Ala Gly Met Gin Asn Thr Gly 965 970
2權利要求
1、一種玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特徵在於該基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQ ID No1所示的核苷酸序列；(2)編碼SEQ ID No2所示的蛋白質序列的核苷酸序列。
2、 根據權利要求1所述的基因，其特徵在於該基因為序列表中的SEQID No: l所示的核苷酸序列。
3、 根據權利要求1所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特徵在於所述基因的引物序列如下，PI: 5'-GCAGATCTGCTCCAACCATCTCGCTTCCGTG曙3'和 P2: 5'隱GGCACGTGGCCGCCTAGCCAGTGTTCTGCAT-3'。
4、 根據權利要求1所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，其特徵 在於所述基因的克隆載體為pMD19-pepc，真核表達載體為p3301-pepc，宿主 菌為E.coli感受態細胞DH5a。
5、 一種玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其特徵在於該羧化酶具有權 利要求1所述核苷酸序列編碼的胺基酸序列。
6、 一種權利要求5所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其特徵在於 該羧化酶具有SEQ ID No: 2所示的胺基酸序列。
7、 權利要求1所述的玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在提高小麥高 光效基因工程育種及生產中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其在小麥生產中的應用。該基因為序列表中的SEQ ID No1所示，基因克隆載體為pMD19-pepc，真核表達載體為p3301-pepc，宿主菌為E.coli感受態細胞DH5α，該羧化酶具有SEQ ID No2所示的胺基酸序列。本發明通過將玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶導入小麥，對轉基因植株的功能分析表明，轉基因植株的淨光合速率較未轉化對照實現了大幅度提高，增幅最大的提高了1.39倍，為目前提高C3作物淨光合速率幅度最大的一項研究。上述結果表明，本發明所涉及的玉米C4型高光效pepc基因可實現小麥等C3作物淨光合速率的大幅度提高，將為小麥等C3農作物高光效轉基因育種提供重要的技術與材料支撐。
文檔編號C12N15/60GK101492689SQ20091006432
公開日2009年7月29日 申請日期2009年3月4日 優先權日2009年3月4日
發明者磊 張, 豔 李, 琳 胡, 許為鋼 申請人:河南省農業科學院