一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法
2023-05-04 09:40:11 1
一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法
【專利摘要】本發明以細胞內3』,5』-環腺苷酸（cAMP）水平的變化作為檢測指標，採用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法測定利拉魯肽生物學活性。通過培養大鼠胰島瘤細胞RIN-m5F，分別加入稀釋後的利拉魯肽對照品溶液和供試品溶液，用試劑盒檢測刺激後細胞內cAMP水平變化，用多功能酶標儀的超靈敏化學發光檢測模塊讀取相對化學發光單位（RLU），然後利用統計軟體擬合實驗數據，通過公式計算供試品的生物學活性。該方法能簡便、快速、準確地檢測利拉魯肽生物學活性的變化，其準確性和重複性符合生物製品生物學活性測定方法的要求。
【專利說明】一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種利拉魯肽生物學活性的測定方法。
發明背景
[0002]糖尿病在世界範圍內日益嚴重威脅人類健康。胰高血糖素樣肽-l(glucagon-likepeptide-1),簡稱GLP-1，是腸道L細胞分泌的一種多肽類激素，具有促進胰島素分泌、促進胰島β細胞增殖和分化的功能。它通過刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空發揮降血糖的作用。由於它對胰島素的刺激具有葡萄糖依賴性，因此不引發低血糖症狀。
[0003]天然GLP-1因半衰期短(僅I?2分鐘)不適合臨床應用。利拉魯肽與GLP-1有97%的同源性，在臨床上用於成人2型糖尿病患者控制血糖。其分子結構與天然人GLP-1分子的不同之處是:第34位的賴氨酸被精氨酸取代，第26位的賴氨酸上增加了一個由穀氨酸介導的16碳脂肪酸側鏈。利拉魯肽半衰期長達13小時，每日只需皮下注射I次，即可有效控制血糖24小時。
[0004]生物製品的生物學活性是生物製品質量評價的重要指標，因此利拉魯肽的生物學活性測定方法是利拉魯肽質量研究的重點之一。目前利拉魯肽生物學活性欠缺簡便、快速、準確的測定方法。
[0005]利拉魯肽屬於GLP-1類似物，它與細胞膜上GLP-1受體(G蛋白偶聯受體)相互作用後，細胞內腺苷酸環化酶(adenylate cyclase)被激活,導致胞內cAMP水平升高。胞內cAMP水平檢測法被廣泛用於定量測定GLP-1及其類似物的體外生物學活性，屬於細胞基礎的受體結合法。利拉魯肽原研廠為novo nordisk公司。在該公司專利CN97198413.1中為檢測GLP-1衍生物的生物活性，測定了它們在表達人胰腺GLP-1受體的細胞系內刺激cAMP形成的能力，使用了幼倉鼠腎細胞(BHK)和閃爍親近測定法(說明書第61/62頁)。由於表達人胰腺GLP-1受體的幼倉鼠腎細胞難以獲得；而且閃爍親近測定法使用了放射性同位素，對人體有危害，因此需要開發一種操作簡單、安全可靠的利拉魯肽生物活性測定方法。
【發明內容】
[0006]本發明提供了一種利用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法測定利拉魯肽生物學活性的新方法，從而解決了利拉魯肽生物學活性測定的難題。
[0007]目前實驗中，大多數使用的是放射性同位素測定法和cAMP酶聯免疫反應分析法來測定胞內cAMP水平。但是放射性同位素對人體有危害，實驗操作不方便。而cAMP酶聯免疫反應分析法通過ELISA方法測定，該方法步驟繁瑣，整個實驗過程周期較長，而且實驗誤差相對較大，因而結果不是非常理想。
[0008]本申請發明通過大量實驗和對比研究後，第一次創造性地將cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法原理應用於利拉魯肽的生物學活性測定。cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法原理是:裂解細胞釋放出胞內cAMP，cAMP激活蛋白激酶A催化蛋白質磷酸化反應而消耗ATP。ATP的減少反映為化學發光信號的減弱。cAMP水平越高，蛋白激酶A的活性就越高，消耗ATP更多，從而化學發光信號越弱。
[0009]發明人發現相比於cAMP酶聯免疫反應分析法，cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法更為方便，實驗步驟少，試驗結果更為精確，誤差相對較小，因而是一種比較理想的測定胞內cAMP水平的方法。
[0010]因而，本發明建立了一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法，所述方法包括如下步驟:
[0011](I)分別製備利拉魯肽對照品溶液和供試品溶液，設置稀釋濃度梯度；
[0012](2)培養大鼠胰島瘤細胞RIN-H15F後，加入步驟(1)中製備的對照品及供試品溶液刺激細胞；
[0013](3)用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒檢測利拉魯肽刺激後細胞內cAMP水平變化，用酶標儀的化學發光檢測模塊讀取相對化學發光單位(RLU)。
[0014](4)以稀釋倍數或藥物濃度為橫坐標，以相對化學發光單位為縱坐標，利用統計軟體擬合實驗數據，得到利拉魯肽的劑量效應曲線，計算出供試品和對照品的半效稀釋倍數，按照以下公式計算供試品的生物學活性:
[0015]供試品生物學活性
【權利要求】
1.一種利拉魯肽生物學活性的檢測方法，所述方法包括如下步驟: (1)分別製備利拉魯肽對照品溶液和供試品溶液，設置稀釋濃度梯度； (2)培養大鼠胰島瘤細胞RIN-m5F後，加入步驟(1)中製備的對照品及供試品溶液刺激細胞； (3)用cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒檢測利拉魯肽刺激後細胞內cAMP水平變化，用酶標儀的化學發光檢測模塊讀取相對化學發光單位(RLU)； (4)以稀釋倍數或藥物濃度為橫坐標，以相對化學發光單位為縱坐標，利用統計軟體擬合實驗數據，得到利拉魯肽的劑量效應曲線，計算出供試品和對照品的半效稀釋倍數，按照以下公式計算供試品的生物學活性:
供試品生物學活性
2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(1)中，利拉魯肽對照品溶液及供試品溶液根據其初始濃度進行預稀釋，以使預稀釋後得到利拉魯肽對照品和供試品的濃度接近或相同；由利拉魯肽對照品溶液及供試品溶液的初始濃度和最後設定的預稀釋濃度確定利拉魯肽對照品溶液的預稀釋倍數(Dr)和供試品溶液的預稀釋倍數(Ds)。
3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(1)中，預稀釋後的利拉魯肽對照品溶液及供試品溶液的濃度範圍為0.0OOl~lmg/ml。
4.根據權利要求1-3任一項所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(1)中，在預稀釋的基礎上，對利拉魯肽對照品和供試品進行進一步的稀釋，製備得到系列濃度梯度的拉魯肽對照品和供試品，稀釋倍數範圍為I倍至200萬倍，在此範圍內根據實驗情況選擇稀釋的倍數。
5.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(1)中，稀釋溶液為PH範圍7.2-9.5的、濃度為1-1OOmM的緩衝溶液。
6.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(2)中，RIN-m5F細胞的培養可選擇預先鋪在細胞培養板中，置25°C -45°CU% -10%二氧化碳培養箱中靜置培養2-5天。
7.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(2)中，RIN-m5F細胞在細胞培養器中培養後，吸去培養孔中上清，然後加入利拉魯肽藥物刺激細胞，將細胞培養容器在25-45 °C放置1-30分鐘。
8.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(2)中，RIN-m5F細胞的培養可以在步驟(1)所述的利拉魯肽對照品和供試品溶液的配製之前、與其同時或者在其之後；在細胞培養好之後，再選擇加入利拉魯肽樣品進行刺激。
9.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(3衝，cAMP依賴型蛋白激酶A活性分析法試劑盒為Promega公司的cAMP_Glo?Max Assay試劑盒。
10.根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵在於:所述方法步驟(4)中，利用統計軟體進行實驗數據擬合時，利用四參數方程擬合實驗數據，四參數方程的公式可表示為:Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+1CT ((LogEC50_X)*HiIISlope))； 擬合出利拉魯肽劑量效應曲線的四個參數Top，Bottom，LogEC50和HillSlope，可得到供試品和對照品的半效稀釋倍數或半效濃度(EC50)，然後計算供試品的相對活性和生物學活性 。
【文檔編號】G01N21/76GK103884846SQ201410079787
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月6日 優先權日:2014年3月6日
【發明者】盧旻衎, 周亮, 曹陽, 戎亞雯, 吉鵬飛, 馬國昌 申請人:杭州九源基因工程有限公司