一種用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法

2023-05-04 20:30:36 1

專利名稱：一種用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，該方法操作簡單、高效、精確度高，可以彌補經典的衍生化GC-MS的無法檢測揮發、半揮發次生代謝物的不足。
背景技術：
菸草作為重要的模式作物及經濟作物，人們對其化學組成有了很多了解。但是，大多數研究僅限於對調製後菸葉的了解，而人們對於新鮮菸葉，包括不同生長周期、不同部位菸葉的化學組成了解仍舊十分有限。次生代謝物主要是指分子量在1000以下的小分子代謝物，與植物基體抗性、信號傳導、生長發育、植物的花色、香氣等現象相關。因此，了解不同時期、處於不同生長周期的菸葉的代謝物組成及含量本身具有重大意義，而且是開展基因組學、蛋白質組學、轉錄組學研究的化學平臺。儘管近幾年國內外已經開始開展關於菸葉次生代謝物的研究工作，但是數量有限，且大都基於調製後菸葉。目前，對於菸葉及其它模式植物此生代謝物的檢測方法仍以衍生化GC-MS方法為主，這是由於其檢測範圍可涵蓋大多數次生代謝物，且GC-MS方法可進行譜庫檢索，便於對次生代謝物進行定性分析。然而，衍生化GC-MS需要對提取液進行完全乾燥，因此會導致揮發、半揮發次生代謝物完全損失，影響測試結果。鑑於衍生化GC-MS檢測範圍未能涵蓋揮發、半揮發次生代謝物，建立一種測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的GC-MS檢測方法是十分有必要的。而且，據調研目前並無相關報導。

發明內容
本發明的目的正是針對上述現有技術狀況而提供一種簡單、高效的檢測新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的
一種用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，快速採集新鮮菸葉並用液氮現場進行速凍，採用冷凍乾燥方法除去水分後對菸葉進行粉碎，用甲醇-氯仿混合溶劑超聲提取煙粉中次生代謝物，離心後，吸取上清液濃縮，濃縮後的樣品溶液直接採用GC-MS 進行分析。具體步驟如下
(1)菸葉的採集、處理、乾燥、粉碎快速採摘煙株指定部位菸葉，用液氮迅速冷凍以終止生命過程，冷凍乾燥24h以除去菸葉水分，乾燥過的菸葉粉碎至40-60目，放於-20°c冰箱保存；(2)提取次生代謝物稱量50-250mg的煙粉，加入內標溶液、6-8ml甲醇-氯仿萃取溶劑進行超聲提取，提取液經高速離心後，取4-6ml上清液進行濃縮，濃縮液經0. 45 μ m微孔濾膜過濾後直接用GC-MS分析；
(3)檢測採用GC-MS進行檢測分析，色譜條件如下
色譜柱DB-35ms (30mX0. 25mmX0. 25 μ m)； 載氣，He;流速 1. Oml/min ；進樣口溫度290 °C ；進樣量1 μ L ；分流比為5:1 ；升溫程序 60°C保持％iin，然後以5°C /min的升溫速度升到280°C，保持10 min, MS參數採用全掃描模式；採集質量數範圍40-350。本發明中，在步驟(1)的處理過程中要迅速去處菸葉主脈，用錫箔紙包裹葉片部分，標記後放入液氮中終止菸葉生命過程，並放於-80°c低溫冰箱冷凍保存，在菸葉從冰箱取出至冷凍乾燥開始之前，必須用乾冰包埋，進行轉移。所述萃取溶劑為3 2或4 1的甲醇-氯仿溶液，加入量為6_8ml，萃取時間為 20-40min。內標溶液為配在萃取溶劑中的氘代尼古丁溶液，濃度為200yg/ml，加入量為 100 μ 1。步驟(2)中的濃縮方式採用旋蒸或真空離心濃縮。採用GC-MS進行檢測分析時，所用色譜柱前接1. Om長的0. 25mm內徑的空管毛細
管作為預柱，預柱需每周定期更換。本發明的突出優點是發展了適用於新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的提取方法。並且方法簡單、有效且重現性好，可以彌補經典的衍生化GC-MS的無法檢測揮發、半揮發次生代謝物的不足。


圖1為本發明的測定步驟流程圖。圖2為本發明所得GC-MS全掃描色譜圖。
具體實施例方式本發明以下結合實施例作進一步描述，但並不限制本發明。實施例1
採集實驗室6片旺長期的新鮮菸葉(品種為紅花大金元)，快速去除主幹並用錫箔紙包裹，用液氮速凍。從液氮取出錫箔紙包，輕輕拍碎，立即用冷凍乾燥機冷凍24h取出水分，並磨碎至40-60目。稱取200mg煙粉於IOml離心管，加入100 μ 1氘代尼古丁內標溶液，5. 9ml 的甲醇-氯仿(3 2)溶液，超聲提取30min，10000r/min下離心lOmin。吸取4. Oml上清液於5ml離心管中，35°C下用真空離心濃縮儀濃縮到1. Oml體積左右。濃縮後的樣品溶液經 0. 45 μ m微孔濾膜過濾後直接用GC-MS分析。色譜條件如下
色譜柱DB-35ms (30mX0. 25讓X0. 25 μ m)；載氣，He ；流速1. Oml/min ；進樣口溫度240°C;進樣量lyL ；分流比為5:1 ；升溫程序60°C保持％iin，然後以5°C /min的升溫速度升到280°C，保持10 min。MS參數採用全掃描模式；採集質量數範圍40_350。所得GC-MS全掃描色譜圖見圖2。 實施例2
採集貴州遵義地區品種為NC297的3片成熟期菸葉，快速去除主幹並用錫箔紙包裹，用液氮速凍。將錫箔紙包從液氮中取出，包埋在乾冰中，航空快遞至實驗室，放於-80°C冰箱。 從冰箱中取出錫箔紙包，輕輕拍碎，立即用冷凍乾燥機冷凍24h去除水分，磨碎至40-60目。 分別稱取50mg、lOOmg、150mg、200mg、250mg煙粉於IOml離心管，加入100 μ 1氘代尼古丁內標溶液，5.9 ml的甲醇-氯仿(3 :2)溶液，超聲提取30min，10000r/min下離心IOmin,取 4. Oml上清液於另5ml離心管，35 0C下用真空離心濃縮儀濃縮到1. Oml體積左右。濃縮後的樣品溶液經0. 45 μ m微孔濾膜過濾後直接用GC-MS分析。色譜條件如實施例1.
選取代表性揮發、半揮發目標分析物，計算色譜峰面積，以「峰面積/內標面積」為y軸， 稱取煙粉重量為χ軸進行線性擬合，擬合係數列於表1中。擬合係數均在0. 999之上，證明該方法對揮發、半揮發次生代謝物具有良好的定量特性。
權利要求
1.一種用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於快速採集新鮮菸葉並用液氮現場進行速凍，採用冷凍乾燥方法除去水分後對菸葉進行粉碎，用甲醇-氯仿混合溶劑超聲提取煙粉中次生代謝物，離心後，吸取上清液低溫下懸蒸或離心濃縮，濃縮後的樣品溶液直接採用GC-MS進行分析。
2.根據權利要求1所述的用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於具體步驟如下(1)菸葉的採集、處理、乾燥、粉碎快速採摘煙株指定部位菸葉，用液氮迅速冷凍以終止生命過程，冷凍乾燥24h以除去菸葉水分，乾燥過的菸葉粉碎至40-60目，放於-20°C冰箱保存；(2)提取次生代謝物稱量50-250mg的煙粉，加入內標溶液、6-8ml甲醇-氯仿萃取溶劑進行超聲提取，提取液經高速離心後，取4-6ml上清液進行濃縮，濃縮液經0. 45 μ m微孔濾膜過濾後直接用GC-MS分析；(3)檢測採用GC-MS進行檢測分析，色譜條件如下色譜柱DB-35ms (30mX0. 25mmX0. 25 μ m)； 載氣，He ；流速 1. Oml/min ；進樣口溫度290 °C ；進樣量1 μ L ；分流比為5 1 ；升溫程序 60°C保持％iin，然後以5°C /min的升溫速度升到280°C，保持10 min,MS參數採用全掃描模式；採集質量數範圍40-350。
3.根據權利要求2所述的用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於在步驟(1)的處理過程中要迅速去處菸葉主脈，用錫箔紙包裹葉片部分，標記後放入液氮中終止菸葉生命過程，並放於-80 0C低溫冰箱冷凍保存，在菸葉從冰箱取出至冷凍乾燥開始之前，必須用乾冰包埋，進行轉移。
4.根據權利要求2所述的用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於萃取溶劑為3 2或4 1的甲醇-氯仿溶液，加入量為6-8ml，萃取時間為 20-40min。
5.根據權利要求2所述的用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於內標溶液為配在萃取溶劑中的氘代尼古丁溶液，濃度為200 μ g/ml，加入量為 100 μ 1。
6.根據權利要求2所述的用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於步驟(2)中的濃縮方式採用旋蒸或真空離心濃縮。
7.根據權利要求2所述的用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於採用GC-MS進行檢測分析時，所用色譜柱前接1. Om長的0. 25mm內徑的空管毛細管作為預柱。
全文摘要
一種用於測定新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的方法，其特徵在於快速採集新鮮菸葉並用液氮現場進行速凍，採用冷凍乾燥方法除去水分後對菸葉進行粉碎，用甲醇-氯仿混合溶劑超聲提取煙粉中次生代謝物，離心後，吸取上清液低溫下懸蒸或離心濃縮，濃縮後的樣品溶液直接採用GC-MS進行分析。本發明的突出優點是發展了適用於新鮮菸葉中揮發、半揮發次生代謝物的提取方法。並且方法簡單、有效且重現性好，可以彌補經典的衍生化GC-MS的無法檢測揮發、半揮發次生代謝物的不足。
文檔編號G01N30/06GK102565233SQ20121001565
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月18日 優先權日2012年1月18日
發明者劉克建, 劉惠民, 夏巧玲, 張麗, 楊軍, 王曉瑜, 秦亞瓊, 謝復煒, 賈雲禎 申請人:中國菸草總公司鄭州菸草研究院