功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型的建立方法
2023-05-04 14:02:41
專利名稱：功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型的建立方法
技術領域：
本發明涉及一種動物模型的建立方法，具體是一種功能性消化不良動物模型的建
立方法。
背景技術：
公認的疾病模型的建立方法有慢性應激模型和饑飽失常法。現有技術文獻中(例如「慢性應激模型研究進展」2010年第23卷第2期)公開了慢性應激模型。而饑飽失常法是一種熟知的造模方法，被廣泛單獨使用或與其他手段聯合使用進行造模。功能性胃腸病是指不伴有器質性改變、具有胃腸功能紊亂表現的一類疾病，是臨床常見的疾病。功能性消化不良發病率高且呈上升趨勢。中醫學據其臨床表現應屬「痞滿」」 等範疇。本病多由情志不遂、飲食傷胃、勞倦傷脾、寒溫失調等因素導致脾胃氣機升降失常， 臨床多以七情內傷，致肝失疏洩，木鬱土壅，運化功能減退，中焦痞塞不通，內生痞滿所致， 病位在脾胃，但與肝等多個臟腑有密切的關係。證候是中醫臨床辨證論治的核心，它以中醫基礎理論特別是藏象理論為基礎，又指導著方劑的臨床應用.因此中醫證候的研究，與中醫藏象理論和中藥複方作用機理緊密相關，是關係到中醫理論發展的關鍵問題，探索並建立符合中醫證候特點的動物模型對學科發展有著重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型的建立方法。本發明提供的功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型的建立方法是採用不可預知的慢性應激模型的建立手段與饑飽失常法的手段同時處理動物，從而獲得功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型。所謂不可預知的慢性應激模型，與傳統的慢性應激模型不同，是指選取多種刺激因素對動物進行不可預知的刺激，而傳統的慢性應激模型是採用單一的刺激手段對動物進行刺激。傳統的慢性應激模型使得動物對單一刺激不敏感。具體地，本發明的方法是採用不可預知的慢性應激模型選取多種刺激因素對動物進行不可預知的刺激①食物剝奪M小時；②飲水剝奪合併空瓶刺激12小時；③明暗顛倒M小時；④溼籠飼養M小時；⑤強迫遊泳45°C，5分鐘；⑥倒懸30分鐘；⑦行為束縛 30分鐘；⑧超聲刺激2小時；⑨夾尾1小時。每天隨機選取一種，相鄰兩天的刺激不重複， 在上述造模同時，動物禁食M小時，僅給予蒸餾水，然後給予富脂食物餵養2天，重複上述方法造模14天。病證結合動物模型和疾病模型的最大區別就是除了功能性消化不良的應有病理變化外，同時還出現有肝鬱證的表現，不同於普通疾病模型的病理生理表現，會有神經遞質
3和激素水平的變化。病證結合模型為功能性消化不良相關生物學研發奠定基礎，為新型治療藥物提供理想的動物模型。中醫證候動物模型研究在研究探索中醫證的涵義和生理、病理、病因的實質及為中醫臨床診療提供客觀依據方面取得了一定進展。其作為中醫基礎研究的重要組成部分，定將與中醫臨床研究相互促進，共同提高中醫現代化水平。通過本研究，可以擴大方劑學的研究領域，推進方劑配伍規律的物質基礎研究，為中醫證型的現代研究提供思路與方法學上的參考，為臨床合理用藥提供保障及依據。本研究不僅豐富了中醫動物模型，還為中藥新藥開發和機理研究提供，具有較高的理論價值和較大現實意義。
圖1是模型動物腸道組織病理切片圖，其中A疾病模型組，B病證模型組，C陽性藥物組；圖2各組小鼠腦內DRDl陽性細胞表達(X 400)，其中A正常組，B病證模型組，C 疾病模型組，D陽性藥物組；圖3各組小鼠腦內DRD2陽性細胞表達(X400)，其中A正常組，B病證模型組， C疾病模型組，D陽性藥物組；圖4各組小鼠十二指腸DRDl陽性纖維表達(X200)，其中·Λ正常組，B病證模型組，C疾病模型組，D陽性藥物組；圖5各組小鼠十二指腸DRD2陽性纖維表達(Χ200)，其中·Λ正常組，B病證模型組，C疾病模型組，D陽性藥物組。
具體實施例方式實施例11.目的運用慢性不可預測應激和饑飽失常法複製功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型， 從行為學、功能評價、病理學、胃腸激素和相關神經遞質檢測評價動物模型，並運用藥物進行反證，探討肝脾氣滯證的病理基礎，建立一種國際公認的動物模型。2.材料2.1動物來源Km小鼠，2月齡，清潔級，20_30g，雌雄各半，湖南斯萊克景達實驗動物公司提供， 實驗動物許可證號SCXK (湘)2009-0004。2. 2試劑與藥物四磨湯口服液(湖南漢森製藥股份有限公司)，批號091002183，規格10ml/支。 兔抗小鼠多巴胺受體1單抗(DRDl)、兔抗小鼠多巴胺受體2單抗(DRD》，由武漢博上德生物工程有限公司提供；SP-9000免疫組化染色試劑盒(批號724944A)和液體AEC酶底物試劑盒(批號K96914D)，由北京中杉金橋生物技有限公司提供；水溶性封片劑，由武漢博上德生物工程有限公司提供。小鼠NE ELISA試劑盒(美國ADL公司)，小鼠5-HTELISA試劑盒 (美國RD公司)，胃泌素試劑盒由(北京北方生物技術研究所)。2. 3 儀器
英國Thermo公司E60冰凍切片機；日本Olympus公司BX-51光學顯微鏡及 Image-ProPlus 5. 1 (IPP5. 1)圖像分析系統；上海醫療器械七廠電熱恆溫水浴箱，GL20A高速冷凍離心機(湖南儀器儀表總廠離心機廠)；MK3型酶標儀(芬蘭LABSYSTEMS集團)。3.方法3. 1動物分組與給藥120隻小鼠隨機分為正常組、疾病模型組、病證模型組、陽性對照藥組(病證模型)，陽性對照藥組於造模開始時給予四磨湯，劑量7. 56ml/kg(臨床等效劑量)。3. 2動物造模方法病證模型採用不可預知的慢性應激模型選取多種刺激因素對大鼠進行不可預知的刺激①食物剝奪；②飲水剝奪合併空瓶刺激(12h)；③明暗顛倒；④溼籠飼養(24h)；⑤強迫遊泳(45°C,5min)；⑥倒懸(30min)；⑦行為束縛(30min)；⑧超聲刺激 (2h)；⑨夾尾(Ih)。每天隨機選取一種，相鄰兩天的刺激不重複，造模14天。饑飽失常法 在上述造模同時，動物禁食M小時，僅給予蒸餾水，然後給予富脂食物餵養2天，重複上述方法。疾病動物模型單純採用饑飽失常法造模，同上。3. 3製備營養性半固體糊取羧甲基纖維素納IOg溶於250mL蒸餾水中，分別加入奶粉16g、糖Sg、澱粉Sg、活性炭末2g，攪拌均勻，配製成300mL的黑色半固體糊狀物，冰箱冷藏，用時恢復至室溫。3. 4組織處理於動物造模模前和造模後處死動物。動物麻醉後經心臟灌注多聚甲醛固定後取血清，或相應組織冰凍切片。3. 5指標檢測3. 5. 1外觀觀察觀察並記錄造模中各組小鼠的情緒、體重、毛髮色澤、飲食、大小便等外觀行為方面的變化；3. 5. 2行為學評價分別於第0、7、14d進行open-field-test試驗，觀察各組大鼠的5min內水平爬行格數和直立次數。3. 5. 3胃腸運動觀察各選取10隻動物做胃排空和腸道推進實驗。造模第13d，小鼠禁食(自由飲水) 後末次給藥，給藥後lh，每隻小鼠灌胃給予半固體糊0. 8mL，20min後 10%水合氯醛麻醉。打開腹腔，結紮幽門和賁門，取出胃，用濾紙擦乾後稱全重，然後沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內容物後擦乾，稱淨重，以胃全重和胃淨重之差為胃內殘留物質量，計算胃內殘留物佔所灌半固體糊質量百分比為胃內殘留率。同時迅速取出小腸，測量黑色半固體糊前沿至幽門距離(小腸推進長度)和幽門至回盲部距離(小腸總長度)，按下列公式計算推進百分率。推進率(％)=黑色半固體糊推進長度/小腸總長度X 100%。3. 5. 4病理學觀察觀察胃腸組織的病理形態學，判別是否有器質性病變。3. 5. 5血清學檢測麻醉後心臟取血ImL直接置於預冷的試管內，4°C離心(3000r/ min)15min，取血清置-34°C冰箱保存。測定按胃泌素放免試劑盒說明進行。Elisa法檢測胃動素表達。3. 5. 6激素水平的檢測ELISA法檢測血清NE和5_HT的表達。3. 5. 7神經遞質的檢測免疫組織化學法檢測小鼠DopamineLDopamind的水平。
3. 6數據處理所有數據以均數士標準差表示，應用SPSS16. 0統計軟體包對數據進行統計分析， 多組比較用方差分析和q檢驗。4.結果與分析4. 1動物一般情況觀察實驗期間，正常組小鼠的外觀等未見異常。與正常組小鼠相比，隨著造模天數的增加，疾病模型組小鼠毛髮變得不光澤，情緒無明顯變化，飲食減少，體重增長減慢；病證模型組小鼠毛髮由順整變為不澤、枯亂；行為狀態由活潑變為少動、扎堆、不活躍；情緒由穩定變為易怒繼而低落；飲食逐漸減少；睡眠由良好變為易醒、倦臥；大便由正常變為稍幹。藥物組小鼠情況較病證模型組好，但比正常組稍差。結果提示符合造模可導致小鼠性情煩躁， 進食減少，體重下降，而單純疾病模型未出現肝鬱表現，陽性藥物可對抗符合造模這一過程，結果見表1。表1小鼠體重情況比較(x+s)
權利要求
1.功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型的建立方法，其特徵在於是採用不可預知的慢性應激模型的建立手段與饑飽失常法的手段同時處理動物，從而獲得功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型；所謂不可預知的慢性應激模型，是指選取多種刺激因素對動物進行不可預知的刺激。
2.根據權利要求1所述的功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型的建立方法，其特徵在於所述的不可預知的慢性應激模型的建立手段是選取下列多種刺激因素之一對動物進行不可預知的刺激①食物剝奪M小時；②飲水剝奪合併空瓶刺激12小時；③明暗顛倒對小時；④溼籠飼養M小時；⑤強迫遊泳45°C，5分鐘；⑥倒懸30分鐘；⑦行為束縛30分鐘；⑧ 超聲刺激2小時；⑨夾尾1小時。每天隨機選取一種，相鄰兩天的刺激不重複，在上述造模同時，動物禁食M小時，僅給予蒸餾水，然後給予富脂食物餵養2天，重複上述方法造模14 天。
全文摘要
本發明涉及一種動物模型的建立方法，具體是一種功能性消化不良動物模型的建立方法。它是採用不可預知的慢性應激模型的建立手段與饑飽失常法的手段同時處理動物，從而獲得功能性消化不良肝脾氣滯證動物模型；所謂不可預知的慢性應激模型，是指選取多種刺激因素對動物進行不可預知的刺激。病證結合模型為功能性消化不良相關生物學研發奠定基礎，為新型治療藥物提供理想的動物模型。
文檔編號A01K67/02GK102177871SQ20111003506
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月9日 優先權日2011年2月9日
發明者劉柏炎, 易健, 蔡光先 申請人:湖南中醫藥大學