一種基因定向克隆用tc載體及其製備和使用方法

2023-05-05 04:46:11

專利名稱：一種基因定向克隆用tc載體及其製備和使用方法
技術領域：
本發明屬於基因工程領域，具體地說是一種便於基因定向克隆的基因工程載體TC載體及其製備以及基因定向克隆的方法。
背景技術：
目前定向克隆技術主要有以下幾種方法(I)通過一種限制性核酸內切酶消化載體，也用這種酶(或同尾酶)消化外源基因片段，然後將載體與外源基因片段通過T4 DNA連接酶催化連接，重組克隆包含方向不定(兩種方向)的外源基因片段。藉助於限制性核酸內切酶消化或其他方法從無定向克隆中篩選外源片段方向符合目的要求的克隆。這種方法缺點是載體兩個末端自我連接嚴重，後期篩選過程工作量大，並且存在較大不確定性，很可 能會得不到所需方向克隆；(2)通過兩種不同的限制性核酸內切酶消化載體，也用這兩種酶消化外源基因片段，然後將載體與外源基因片段通過T4 DNA連接酶催化連接，重組載體即為定向克隆。該方法缺點是步驟繁瑣，工作量大，有時會很難找到合適的限性核酸內切酶位點而確定實驗方案；(3)在(I)的基礎上，增加外源基因片段與載體之間連接處的特殊序列，使正反向克隆中某向克隆具有或不具有某稀有限制性核酸內切酶的識別、切割位點，因而可以藉助於該稀有限制性核酸內切酶篩選方向克隆的篩選。這種改進只是在一定程度上減少了( I)方法後期篩選工作量，而對其他缺點(存在較大不確定性，很可能會得不到所需方向克隆)無任何改進。總之，現有技術存在步驟繁瑣、結果不確定或者難於制定實驗方案等缺點。

發明內容
本發明提出一種基因定向克隆的載體(可以為質粒、噬菌體、病毒及其衍生載體等)及其製備和使用方法，從而大大方便外源基因片段定向克隆於目標載體(如細菌、酵母、植物以及動物表達載體等)，克服了現有技術存在的缺陷。本發明先將目的載體製備成具有「載體的兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基」特徵的TC載體，然後只要把目的基因按照本發明所提出的PCR方法進行擴增，即可將該擴增產物直接定向連接於TC載體。對於從通用目的載體出發進行的重組載體的構建工作而言，該方法由於減少了操作步驟和實驗試劑的消耗，使效率得到提高的同時，實驗成本也大大降低。本發明所提供的基因定向克隆用的TC載體是
在該線狀載體的兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基(稱之為「TC載體」)。本發明所提供的TC載體的製備方法，它包括以下步驟
a、填充序列的引物設計
選擇一段序列已知DNA序列，該DNA片段長度範圍100 2000bp (該DNA頻段用作目標載體改造的「填充序列」，所存在於的載體稱為供體載體)，針對該序列設計一對PCR擴增引物，該引物一方面與供體載體模板具有特異結合的序列，同時各有一個I I或各有一個EamW^1、Mbo W、Hph1.Bmr l.Hpy AV和必￠/ I中的一種的識別位點；由此得到引物I和引物2 ;
b、在引物I和引物2引發下，以供體載體作DNA模板進行PCR擴增，得到PCR產物，即填充序列；
C、將該填充序列克隆到目標載體，形成前TC載體(TC載體的前體)。由於引物I和引物2兩端的內切酶識別位點的簡併鹼基經過選擇，使之被克隆於目標載體形成前TC載體後，用與a)相應的I或者fe 1105 I,Mbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和必￠/ I中的一種酶切該前TC載體，所得到的載體片段即為符合TC載體特徵的載體分子兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基。—種基因定向克隆用TC載體的製備方法，其特徵在於它包括以下步驟
a、填充序列的引物設計
選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度範圍100 2000bp (該DNA片段用作改造目標載體的「填充序列」，該DNA片段序列所存在的載體稱為供體載體。);針對該序列設計一對PCR擴增引物，該引物一方面與作為模板的供體載體具有特異結合的序列，同時各有一個 Xcm I 或各有一個萬<3 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、HpyI 中的一種內切
酶的識別位點；由此得到引物I和引物2 ；
b、在引物I和引物2引發下，以供體載體作DNA模板進行PCR擴增，得到PCR產物，即填充序列；
C、將該填充序列克隆到目標載體，從而形成前TC載體，即TC載體的前體分子；
通過對引物I和引物2兩端的I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、處f AV和Ahd I中的一種的識別位點的簡併鹼基的選擇，使得前TC載體經Zos I或feM105 I, MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和處c/ I中的一種內切酶酶切後，回收載體片段即可得到一個線性載體，其兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基，即權利要求1所述TC載體。本發明所提供的基於上述TC載體進行的定向克隆基因的方法，它包括以下步驟
a、填充序列的引物設計
選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度範圍100 2000bp，用作改造目標載體的「填充序列」。針對該序列設計一對引物，該引物一方面與目標載體的DNA模板具有特異結合的構造，同時兩條引物兩5』端各有一個Zos I或各有一個及 1105 UMo II,Hph1、Bmr1、Hpy AV和AM I中的一種的識別位點；由此得到引物I和引物2 ；
b、用引物I和引物2對供體載體進行擴增，得到PCR產物充當填充序列；
C、將該填充序列克隆到目標載體，形成前TC載體，即TC載體的前體分子；通過對引物
I和引物2 兩端的 Jc I 或萬 Hph1、Bmr1、HpyI 中的一種
的識別位點的簡併鹼基的選擇，使得前TC載體經Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,Bmr
I,Hpy AV和AM I中的一種內切酶酶切後，再回收載體片段即可得到一個線性載體，其兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基，即權利要求1所述TC載體；
d、設計待定向克隆基因的一對特異PCR引物，該引物對中一條引物5』端為C鹼基，且另一條引物5』端為G或A或T鹼基(正向還是反向引物5』端加C將決定DNA序列定向克隆的方向)；
e、在d步所設計的引物引發下，用Taq酶(或其他與Taq酶具有相同末端轉移酶活性的耐熱DNA聚合酶)PCR擴增待克隆基因。得到的擴增產物中，將有一個3』端突出一個A鹼基、另一個3』端突出一個G鹼基的產物，恰與上述TC載體兩3』末端匹配。將該擴增產物和TC載體連接即可得到克隆方向確定的重組DNA分子。


圖1是本發明基因定向克隆用TC載體的結構示意圖。圖2是前TC載體結構示意圖。
圖3是本發明原理圖。
圖4是本發明具體實施方式
中的原核表達載體pET17b的質粒圖譜。圖5是本發明具體實施方式
中的細胞表達載體pcDNA6/V5_His A質粒圖譜。圖6是本發明具體實施方式
中的植物表達載體PCAMBIA1391質粒圖譜。圖7是本發明具體實施方式
中定向克隆質粒的鑑定圖譜。以下結合附圖對本發明做進一步的說明。一、TC載體的製備
① 填充序列的引物設計
選擇一段已知DNA序列(長度範圍100 2000bp，此處用作目標載體改造用的「填充序列」的模板，所存在於的載體稱為供體載體)，針對該序列設計一對PCR擴增引物，該引物一方面與供體載體模板具有特異結合的序列，同時5』各有一個Zos I或各有一個及 11051、Mbo W、Hph I,Bmr I,Hpy AV和I中的一種的識別位點；由此得到引物I和引物2。用該對引物PCR擴增供體載體，將所得到的PCR產物克隆於目標載體形成TC載體的前體(即前 TC 載體)。t^Xcm I 或者及迎11051、Mbo U、Hph !,Bmr1、Hpy kN 琳 AhdI中的一種內切酶酶切，通過對識別鹼基序列中的簡併的選擇，使酶切後得到的載體片段符合本發明所述TC載體特徵的3』端突出鹼基該線狀TC載體兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基。為方便克隆，可在引物5』端添加內切酶識別位點及其末端酶切保護鹼基，這對引物能擴增出的DNA序列要求一般不小於lOObp、不大於2000bp。上述引物1、引物2的設計可按本領域通用方法進行。引物中Zos I (或feM105UMbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和燦c/ I中的一種)識別位點的簡併鹼基的選擇可參考下面例子(以Xos I為例)
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I ^ s1...XXNMTCXiy
J Acm I1.,; W,IJ 3.(KrrKKXX AN\^\Ar(^*
I為Xcm I識別切割位點的一般形式，2、3針對簡併鹼基進行了鹼基選擇，使之酶切之後產生特殊的3』端突出鹼基(序列中，「N」代表A、T、G、C鹼基中的任意一種，「 I 」代表酶切斷磷酸二酯鍵處)，非酶切突出位置簡併鹼基可選擇任意鹼基。②將填充序列克隆到目標載體
用經上述設計的引物1、引物2擴增出填充序列，之後利用通常的克隆技術克隆到目標載體。具體涉及的實驗技術有=PCR擴增、限制內切酶酶切、連接、DNA凝膠電泳產物回收及細菌轉化方法等(可參照《分子克隆實驗指南》分子生物學實驗手冊進行)。以下給出部分可參考的實驗程序
(A)PCR反應
權利要求
1.一種基因定向克隆用TC載體，其特徵在於，該載體兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基。
2.一種基因定向克隆用TC載體的製備方法，其特徵在於它包括以下步驟 a、填充序列的引物設計 選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度範圍100 2000bp ;針對該序列設計一對PCR擴增引物，該引物一方面與作為模板的供體載體具有特異結合的序列，同時各有一YXcm I 或各有一個1051、Mbo W、Hph !,Bmr1、Hpy AV 和必i/ I 中的一種內切酶的識別位點；由此得到引物I和引物2 ； b、在引物I和引物2引發下，以供體載體作DNA模板進行PCR擴增，得到PCR產物，即填充序列； C、將該填充序列克隆到目標載體，從而形成前TC載體，即TC載體的前體分子； 通過對引物I和引物2兩端的Zc I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、處f AV和Ahd I中的一種的識別位點的簡併鹼基的選擇，使得前TC載體經Zos I或feM105 !,MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和處c/ I中的一種內切酶酶切後，回收載體片段即可得到一個線性載體，其兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基，即權利要求1所述TC載體。
3.一種基於TC載體定向克隆基因的方法，其特徵在於它包括以下步驟 a、填充序列的引物設計 選擇一段序列已知DNA片段，該DNA片段長度範圍100 2000bp，用作改造目標載體的「填充序列」，針對該序列設計一對引物，該引物一方面與供體載體的DNA模板具有特異結合的構造，同時兩條引物兩5』端各有一今Xcm I或各有一個萬<3 11051、Mbo W、Hph1、Binr1、Hpy AV和必i/ I中的一種的識別位點；由此得到引物I和引物2 ; b、用引物I和引物2對供體載體進行擴增，得到的PCR產物充當填充序列； C、將該填充序列克隆到目標載體，形成前TC載體，即TC載體的前體分子；通過對引物I和引物 2 兩端的 Jc I 或萬 Hph1、Bmr1、Hpy AV 和 JAtZ I 中的一種的識別位點的簡併鹼基的選擇，使得前TC載體經Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,BmrI,Hpy AV和AM I中的一種內切酶酶切後，回收載體片段即可得到一個線性載體，其兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基，即符合權利要求1特徵的TC載體； d、設計待定向克隆基因的一對特異PCR引物，該引物對中一條引物5』端為C鹼基，且另一條引物5』端為G或A或T喊基； e、在d步所設計的引物引發下，用Taq酶(或其他與Taq酶具有類似末端轉移酶活性的DNA聚合酶)PCR擴增待克隆基因得到擴增產物，其中一個3』端突出一個A鹼基、另一個3』端突出一個G鹼基的PCR擴增產物，恰與上述TC載體兩3』末端匹配，將該擴增產物和TC載體通過T4 DNA連接酶催化連接即可得到克隆方向確定的重組DNA分子。
全文摘要
本發明公開了一種基因定向克隆用TC載體及其製備和使用方法，該載體兩個末端的3』端各突出一個鹼基，其中一個3』端突出鹼基為C鹼基，另一個3』端突出鹼基為T鹼基。其製備方法包括a、填充序列的引物設計，由此得到引物1和引物2；b、在引物1和引物2引發下，以供體載體作DNA模板進行PCR擴增，得到PCR產物，即填充序列；c、將該填充序列克隆到目標載體，從而形成前TC載體；d、內切酶酶切該前TC載體並回收載體片段就可得到TC載體。其使用方法包括a、製備TC載體；b、設計一對待定向克隆基因的PCR引物；c、用這對引物和Taq酶擴增待定向克隆基因並將產物連接於TC載體即可獲得定向克隆重組載體。本發明提高了從通用目的載體出發進行的重組載體的構建的工作效率，可減低實驗成本。
文檔編號C12N15/64GK102994535SQ201210436709
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者李繼剛, 李秀敏, 楊忠祥, 夏潔函 申請人:河北大學