優化的甘露聚糖酶基因及其重組植物表達載體和應用的製作方法
2023-05-05 04:47:16
專利名稱:優化的甘露聚糖酶基因及其重組植物表達載體和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及優化的甘露聚糖酶基因以及含有該優化基因的重組植物表達載體，本發明進一步涉及它們在製備表達甘露聚糖酶轉基因植物中的應用，屬於轉基因植物領域。
背景技術：
甘露聚糖是植物半纖維素的主要成份之一，以β -I, 4-D-吡喃甘露糖苷鍵連接而成的線性多糖，分為甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖。在飼料作物(如麥類、豆柏、玉米)中不能被單胃動物分解，是目前大量應用的玉米/豆柏型飼料中主要的抗營養因子。它們能結合大量的水，使採食動物消化道中食糜的體積增大、粘度增加、養分與消化道內源酶的作用降低、營養物質的消化率下降。造成動物生長受阻、飼料轉化率降低，從而使其代謝受到抑制(Liepman AH, et al. , Plant Physiol 143:1881β-甘露聚糖酶(EC3. 2. 1.78):水解β _1，4_D_吡喃甘露糖為主鏈的內切水解酶，作用底物主要是甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、以及半乳葡萄甘露聚糖。主要來源於低等動物、植物、微生物，微生物來源的β_甘露聚糖酶具有活力高、成本低、來源穩定、提取方便等明顯優點，已在實際生產和基礎研究中得到廣泛應用。在飼料行業上的應用，有如下功效降解甘露聚糖為甘露寡糖，降低抗營養作用；甘露寡糖具有免疫原性，刺激和增強免疫反應；調控動物胃腸道微生態環境，促進有益菌生長，抑制有害菌黏附能(McCleary BV, Method Enzymol 160:596現在生產上通常需要添加甘露聚糖酶製劑來改善動物對飼料的利用效率，減輕動物黏性糞便造成的環境汙染問題。已經利用微生物發酵進行飼用甘露聚糖酶的產業化生產，並在飼料工業中廣泛應用。
利用轉基因植物生產飼用酶，其優勢在於1)轉基因植物尤其是轉基因玉米用作飼料原料，可以直接飼喂，而省去目前酶製劑的發酵生產和添加過程；2)生產規模不受限制，成本比較低。農作物的生產、運輸、加工和貯藏等各種基礎設施及技術早已具備，轉基因植物高水平表達生產重組蛋白可以通過大規模種植來完成；3)目前初步的研究發現，在植物，尤其是種子中表達的非澱粉多糖酶具有更好的貯存穩定性和抗逆性；4)安全性好，用微生物發酵生產酶製劑，細胞培養過程中汙染極其普遍，但在植物表達系統中沒有這種汙染。
玉米為「飼料之王」，是中國最主要的能量飼料糧之一，也是畜禽生產肉、蛋、奶的重要來源，其用量佔配合飼料成份的60-70%玉米籽粒作為動物飼料最主要的成分，在作為生物反應器這一層面上，與其它飼料作物相比，轉基因玉米有更好的經濟效益和應用前景。隨著畜牧業的發展和新技術的綜合應用，玉米已成為最重要的糧食、飼料和經濟兼用作物。所以，加強優質、專用和資源高效飼用型玉米新品種的培育和推廣具有十分重要的現實意義。[0007]來源於Bispora sp. MEY-1的甘露聚糖酶具有較優良的酶學性質(Luo H, etal. , Appl Microbiol Biotechnol 82:453-461，2009)。它是目前分離到的比較好的能適用於飼料產業中的酸性甘露聚糖酶，但是該酶在玉米等農作物中表達仍然存在表達效率低、穩定性差等缺陷。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種能夠在玉米等農作物種子中高效表達、穩定性好的優化的甘露聚糖酶基因；
本發明的目的之二是提供含有原始甘露聚糖酶基因或優化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體；
本發明的目的之三是提供一種製備表達甘露聚糖酶轉基因植物的方法。
本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的·
為了提高甘露聚糖酶基因在作物(尤其是玉米)中的表達效率和穩定性，本發明將來源於 Bispora sp. MEY-1 的原始甘露聚糖酶基因(MAN5A_SST)(SEQ ID NO. 2XEU919724)通過密碼子優化以及提高mRNA二級結構穩定性等措施，得到SEQ ID NO. I所示的優化的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)。
本發明的另一目的是提供一種含有原始甘露聚糖酶基因或優化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體，該重組植物表達載體包括啟動子序列、原始甘露聚糖酶基因或優化的甘露聚糖酶基因，信號肽和蛋白體定位序列以及終止子序列。
其中所述的啟動子可以為單子葉植物組成型啟動子，如Ubi啟動子或CaMV35S啟動子，也可以是單子葉植物誘導型啟動子，還可以是單子葉植物組織特異性啟動子；所述的玉米胚特異表達的啟動子和終止子可分別根據GenBank登記號L22344和L22345設計引物，分別擴增得到來自於玉米基因組DNA中玉米胚芽蛋白的啟動子和終止子片段。所述的玉米胚乳特異表達的啟動子和終止子序列可根據文獻(Woo, et al. 2001，Plant cell.Oct. 13(10) :2297-317)來設計引物分離得到。優選的，本發明中所述的啟動子序列是專利申請公開號為CN 101153285A (發明名稱為「一種表達植酸酶的轉基因植物的製備方法」)的中國發明專利申請文件中所公開的SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
所述的優化的甘露聚糖酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示；所述的原始甘露聚糖酶基因的核苷酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
所述的信號肽和蛋白體定位序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A (發明名稱為「一種表達植酸酶的轉基因植物的製備方法」)的中國發明專利申請文件中所公開的SEQ ID N0.9所示的核苷酸序列(引導基因產物分泌和定位的信號肽序列，控制基因產物的定位，該信號肽和蛋白體定位序列可以引導植酸酶定位到細胞的蛋白體中)。
所述的終止子序列可以是專利申請公開號為CN 101153285A (發明名稱為「一種表達植酸酶的轉基因植物的製備方法」)的中國發明專利申請文件中所公開的SEQ IDNO 4或SEQ ID NO :6所示的序列。
本發明的再一目的是提供一種製備表達甘露聚糖酶的轉基因植物的方法，該方法包括以下步驟
(I)構建含有SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示基因的重組植物表達載體；[0020](2)將所構建的重組植物表達載體轉化到受體農作物中，篩選獲得高效表達甘露聚糖酶的轉基因植物。
優選的，步驟(I)中所述的重組植物表達載體的構建方法包括將信號肽和蛋白體定位序列，SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示的甘露聚糖酶基因和終止子序列連接在一起後，可操作的連接到啟動子序列之後。
作為一個具體的實施方案，可以將SEQ ID NO. I所示的基因可操作的與植物表達載體pHP20754連接，即得到能在玉米等植物中高效表達甘露聚糖酶的重組植物表達載體；其中，所述植物表達載體PHP20754的構建方法已在專利申請公開號為CN101153285A (發明名稱為「一種表達植酸酶的轉基因植物的製備方法」)的中國發明專利申請文件中詳細公開。
其中，所述「可操作的連接」是指兩個或更多個元件之間功能性的連接，可操作連接的元件可為鄰接或非鄰接的；所述的植物表達載體可以由Y端非編碼區，SEQID No. I 所示的核苷酸和3'非編碼區組成，其中，所述的5'端非編碼區可以包括啟動子序列、增強子序列或/和翻譯增強序列；所述的啟動子可以是組成性啟動子、誘導型啟動子、組織或器官特異性啟動子；所述的3'非編碼區可以包含終止子序列、mRNA切割序列等。合適的終止子序列可取自根癌農桿菌的Ti-質粒，例如章魚鹼合成酶和胭脂鹼合成酶終止區。
所述的植物重組表達載體轉化受體農作物的方法可為植物工程領域常規轉化方法，如農桿菌轉化法、基因槍法、PEG介導法、種質系統介導法、電擊穿孔法或微注射法，本發明優選為農桿菌轉化法或基因槍法，最優選為基因槍法。
所述的受體農作物優選為油菜、玉米、大豆或小麥，更優選為玉米。
本發明所述的植物外植體優選為玉米幼胚或幼胚誘導的愈傷組織。
為了便於篩選陽性植株同時為了確保安全性的要求，本發明同時選用了植株選擇標記基因的表達載體。將本發明的重組植物表達載體與植物選擇標記基因表達載體共同轉化受體作物，選育得到表達甘露聚糖酶而不含篩選標記基因的轉基因作物。通過共轉化策略，將抗性選擇基因和甘露聚糖酶分別構建於不同的表達載體上。在轉基因植物的後代選育中，可以利用後代分離得到表達甘露聚糖酶且不含篩選標記基因的轉基因植物。
優選的，本發明所述的選擇標記基因表達載體為pHP17042Bar ;所述選擇標記基因表達載體pHP17042Bar的構建方法已在專利申請公開號為CN 101153285A (發明名稱為「一種表達植酸酶的轉基因植物的製備方法」)的中國發明專利申請文件中詳細公開。
本發明將來源於Bispora sp. MEY-I的原始甘露聚糖酶基因(SEQ ID NO. 2)通過優化密碼子、提高mRNA 二級結構穩定性等措施，得到SEQ ID NO. I所示的優化的甘露聚糖酶基因(MAN5AS);本發明進一步構建了含有所述優化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體並將其轉化到玉米中，通過PCR、Southern blot、Western blot等方法篩選得到陽性轉甘露聚糖酶基因植株。所得到的轉甘露聚糖酶基因玉米植物可以在種子中高效表達甘露聚糖酶，轉基因玉米中甘露聚糖酶酶學性質測定表明，優化後的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)能在轉基因玉米中穩定表達及遺傳，優化的甘露聚糖酶MAN5AS酶活顯著高於未經優化的甘露聚糖酶MAN5A-SST。甘露聚糖酶的穩定性實驗結果表明，優化後的甘露聚糖酶基因MAN5AS在玉米中所表達的穩定性較原始的甘露聚糖酶基因MAN5A-SST在玉米中的穩定性有顯著的提聞。[0030]本發明所涉及到的術語定義
除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所了解相同的含義。雖然在本發明的實踐或測試中可使用與本文所述者類似或等效的任何方法、裝置和材料，但現在描述優選方法、裝置和材料。
術語「基因」 「核苷酸」或「多核苷酸」意指單股或雙股形式的脫氧核糖核苷酸、脫氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否則所述術語涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有類似於參考核酸的結合特性並以類似於天然產生的核苷酸的方式進行代謝。除非另外特定限制， 否則所述術語也意指寡核苷酸類似物，其包括PNA (肽核酸)、在反義技術中所用的DNA類似物(硫代磷酸酯、磷醯胺酸酯等等)。除非另外指定，否則特定核酸序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變異體(包括(但不限於)簡併密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。特定而言，可通過產生其中一個或一個以上所選(或所有)密碼子的第3位經混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現簡併密碼子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J. Biol.Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell. Probes8:91-98(1994))。
術語「表達」指外源基因在宿主細胞中的轉錄和/或翻譯。
術語「轉化」指將外源基因引入到宿主細胞中的方法。
圖I原始的甘露聚糖酶基因(MAN5A-SST)的有關GC含量、CFD等信息。
圖2優化後的甘露聚糖酶基因(MAN5AS)的有關GC含量、CFD等信息。
圖3甘露聚糖酶基因密碼子優化前後的mRNA的二維結構。
圖4甘露聚糖酶植物重組表達載體示意圖。
圖5pHP20754_MAN5AS 表達盒示意圖。
圖6轉基因植株(BCl代)PCR檢測結果；A)1，Ikb分子量標準；2_10，轉基因植株；11，陽性對照；12，陰性對照。B)內參基因act in PCR檢測結果。
圖7轉基因事件22玉米植株的Southern-blot結果；I, Ikb分子量標準；
2-4HindIII酶切；7圖8轉基因玉米表達甘露聚糖的Western blot分析；A)SDS_PAGE結果，1-3轉基因植株；2分子量標準，4陰性對照，5陽性對照；B)對應的Western blot結果；C)組織特異性Western blot檢驗，I :分子量標準，2-3 :植株T042-5及EndoH處理，4-5 :植株T041-20及EndoH處理，6 :陰性對照，7 :陽性對照，8_10 :分別為陽性植株的根莖葉。
圖9轉基因玉米表達甘露聚糖酶的性質分析。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。[0045]實驗材料
I、載體合成的基因MAN4AS保存於pUC57MCS上。植物表達載體為中國專利申請公開號為CN 101153285A的專利申請公布文件中所公開的植物表達載體pHP20754 ;選擇標記基因表達載體也為公開號為CN 101153285A的專利申請公布文件中所公開的選擇標記基因表達載體pHP17042Bar。
2、試劑盒膠回收試劑盒購自Takara及Promega公司；質粒提取試劑盒購自北京博邁德科技發展有限公司。
3、化學試劑甘露聚糖及角豆膠購自於Sigma公司。
4、基因槍購自於 BIO-RAD 的 SPEX Geno/Grinder 201OHigh-throughput tissuehomogenizer
5、抗血清由中國科學院遺傳所實驗動物中心完成；鹼性磷酸酶標記羊抗兔IgG購自於北京中原公司；BCIP/NBT試劑盒購自於北京莊盟國際生物基因科技有限公司。
6、本發明中所涉及到的引物及其序列見表I :
表I
權利要求
1.優化的甘露聚糖酶基因，其特徵在於其核苷酸序列為SEQID NO. I所示。
2.含有權利要求
I所述優化的甘露聚糖酶基因的重組表達載體；優選的，所述重組表達載體是重組植物表達載體。
3.—種重組植物表達載體，其特徵在於，包括啟動子序列、原始的甘露聚糖酶基因或權利要求
I所述的優化的甘露聚糖酶基因，信號肽和蛋白體定位序列以及終止子序列。
4.按照權利要求
3所述的重組植物表達載體，其特徵在於所述的啟動子為單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。
5.一種構建權利要求
3或4所述重組植物表達載體的方法，包括將信號肽和蛋白體定位序列，原始的甘露聚糖酶基因或權利要求
I所述的優化的甘露聚糖酶基因和終止子序列連接在一起後，可 呆作的連接到啟動子序列之後。
6.一種製備表達甘露聚糖酶的轉基因植物的方法，該方法包括以下步驟 (1)構建含有原始甘露聚糖酶基因或權利要求
I所述優化的甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體； (2)將所構建的重組植物表達載體轉化到受體農作物中，篩選獲得表達甘露聚糖酶的轉基因植物。
7.按照權利要求
6所述的方法，其特徵在於所述的重組植物表達載體的構建方法包括將信號肽和蛋白體定位序列，原始的甘露聚糖酶基因或權利要求
I所述的優化的甘露聚糖酶基因和終止子序列連接在一起後，可操作的連接到啟動子序列之後；所述的啟動子為單子葉植物組成型啟動子、單子葉植物誘導型啟動子或單子葉植物組織特異性啟動子。
8.按照權利要求
6所述的方法,其特徵在於將所構建的重組植物表達載體與植物選擇標記基因表達載體共同轉化受體作物，選育得到表達甘露聚糖酶而不含篩選標記基因的轉基因作物。
9.按照權利要求
8所述的方法，其特徵在於所述的選擇標記基因表達載體為pHP17042Bar。
10.按照權利要求
6或8所述的方法，其特徵在於所述的受體農作物為玉米、油菜、大豆或小麥。
專利摘要
本發明公開了優化的甘露聚糖酶基因及其重組植物表達載體和應用。本發明將甘露聚糖酶基因通過密碼子優化以及提高mRNA二級結構穩定性等措施得到SEQ ID NO.1所示的優化甘露聚糖酶基因；本發明進一步構建了含有原始甘露聚糖酶基因或優化甘露聚糖酶基因的重組植物表達載體並將其轉化到玉米中篩選得到種子中高效表達甘露聚糖酶的轉甘露聚糖酶基因玉米植株；酶學性質測定表明，優化的甘露聚糖酶基因能在玉米中穩定、高效的表達及遺傳，所表達的甘露聚糖酶酶活以及穩定性顯著高於原始甘露聚糖基因在玉米中所表達的甘露聚糖酶的酶活及穩定性。
文檔編號C12N15/56GKCN102888419SQ201210431932
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月1日
發明者姚斌, 楊培龍, 孟昆, 張宇宏, 徐曉露, 袁建華, 陳茹梅, 孟慶長, 張偉 申請人:中國農業科學院飼料研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan