基因表達的調控的製作方法

2023-05-05 03:44:06

專利名稱：：基因表達的調控的製作方法
技術領域：
：本發明涉及基因表達的調控，具體來說，涉及細胞凋亡介質(apoptoticmediator)的調控中小分子幹擾RNA(siRNA)的應用。
背景技術：
：對照哺乳動物細胞凋亡的途徑是複雜的，根據物種、細胞類型，調控細胞生存的促細胞凋亡和抗細胞凋亡的變更是不同的，這種變更在正常細胞和癌細胞之間也存在(綜述見於Johnstone等人，2002；Reed2002；CoryandAdams，2002)。有利於細胞存活的不平衡促使了腫瘤的發展和對抗癌藥物的抗性。例如，由於核苷酸114-121位的G8片段不穩定，促細胞凋亡的Bax基因經常在DNA錯配修復缺失的腫瘤中發生突變(Ionov等人，1993；Rampino等人，1997；Zhang等人，2000)。當兩個Bax等位基因均發生突變時，產生的Bax缺失則帶來了對例如舒林酸和indomethicin的非甾體抗炎藥物(NSAIDs)的抗性(He等人，1999；Yamamoto等人，1999；Zhang等人，2000)。由於結腸癌的誘因通常與缺失性錯配修復有關(Lynch，1999)，Bax的突變可以解釋對作為化學預防劑給藥的舒林酸的獲得性抗性。實際上，舒林酸促使了Bax-缺失細胞在培養液中的克隆擴充(Zhang等人，2000)，同樣有利於具有遺傳性錯配修復缺失的患者的結腸上皮中Bax-缺失細胞的克隆擴充。然而，Bax-缺失細胞仍然對5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感，5-FU激活p53依賴性細胞凋亡(Bunz等人，1999；Zhang等人，2000)，其是結腸癌的主流療法。人們需要確定影響癌細胞存活的細胞途徑和細胞凋亡介質。這種細胞途徑和細胞凋亡介質代表了有希望的抗癌治療的靶點。當前RNAi原理的模型基於以下觀察，導入的dsRNA和核酸內切酶RNAeIII結合，並被其酶解成21和22個核苷酸的產物。這些小分子幹擾RNA(siRNA)保持與核酸內切酶穩定地結合。產生的dsRNA-蛋白複合物看起來代表了同源mRNA選擇性降解的活性效應子(HamiltonBaulcombe，1999；Zamore等人，2000；Elbashir等人，2001a)。實際上，已經確定21核苷酸的RNA的雙螺旋足以抑制內源基因在哺乳動物細胞中的表達(Elbashir等人，2001b)。在導入同源的siRNA雙螺旋之後，人類上皮細胞中內源性核纖層蛋白A/C表達的選擇性沉默證明了這一點。因此，將siRNA導入哺乳動物細胞足以選擇性地以同源mRNA作為靶點，使其基因的表達沉默。重要的是，觀察長度大於30個核苷酸的dsRNA，siRNA並未誘導非特異性幹擾素反應(Minks等人，1979)。RNA幹擾由雙鏈RNA(dsRNA)觸發，並通過以特定的mRNA轉錄體為靶點降解，促使基因沉默沉默過程因而是轉錄後的，宿主細胞的基因組的完整性得到了保持。在哺乳動物細胞中RNA幹擾是由短的幹擾性RNA(siRNA)雙螺旋引發的(Elbashir等人，2001)。siRNA雙螺旋以同源mRNA為靶點降解，具有優秀的選擇性和很高的持續效力。而且，單劑量的siRNA在幾天之內完成了基因沉默(Elbashir等人，2001；JiangandMilner，2002)，並且避免了對長時間選擇過程的需求，例如建立基因敲除細胞所必需的過程。因此，通過在特定的促細胞凋亡基因缺失的細胞中使抗細胞凋亡基因沉默，RNA幹擾使得細胞凋亡途徑的功能剖析成為可能。
發明內容本發明提供了一種調控細胞凋亡的方法，所述方法包括向細胞中導入一種含有與所述細胞內的mRNA同源的核苷酸序列的RNA構建物，其特徵在於所述的mRNA包括與細胞凋亡的調控有關的基因要素的基因信息。優選地，所述RNA構建物的核苷酸序列和所述mRNA的同源性為至少50％的序列相同，優選至少75％，更優選至少85％，或至少95％相同。所述RNA構建物的核苷酸序列與所述mRNA的同源性最優選為92到95％，97到99％或100％。該RNA構建物的核苷酸序列與相應的mRNA序列中不相同的核苷酸優選不多於4個。該RNA構建物的核苷酸序列與相應的mRNA序列中不相同的核苷酸優選不多於3、2或1個。所述的基因要素優選與細胞凋亡的抑制有關。在本發明的一個優選實施方式中，所述基因要素為Bcl-2。該基因要素優選包含選自下列的核酸分子或其部分(i)圖6表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可與(i)中的任意核酸序列雜交，並具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核酸分子。在本發明的另一個優選實施方式中，所述基因要素為Bcl-xL。該基因要素優選包含選自下列的核酸分子或其部分(i)圖7表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可與(i)中的任意核酸序列雜交，並具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核酸分子。在本發明的另一個優選實施方式中，所述基因要素是細胞凋亡中調控有關的基因的病毒同源物。本文中所用的術語病毒同源物是指結構或功能同源物，其中的病毒基因可能與例如Bcl-2或Bcl-xL的抗細胞凋亡基因有某種程度上的結構同源性。該同源性優選為至少50％的序列相同，更優選至少75％的序列相同，更優選至少85％相同，更優選至少95％的序列相同。另一方面，所述同源物可以是抗細胞凋亡基因的功能同源物，其特徵在於所述的同源物在調控中具有作用，優選在細胞凋亡的抑制中具有作用。已發現Bcl-2的沉默誘導了大量p53依賴性的細胞凋亡，並且這種細胞凋亡在正常細胞生長條件下發生(不藉助於將p53活化為轉錄因子所必需的基因毒性藥物)。本發明涉及Bcl-2調控下p53促細胞凋亡的新功能，因此創建了調控人類結腸上皮細胞中細胞凋亡的組成性Bcl-2/p53體系。進一步使用Bax+/-和Bax-/-細胞的同基因克隆體(isogenicclone)和胱冬蛋白酶2siRNA的實驗，清楚地顯示了Bax和胱冬蛋白酶2均為Bcl-2/p53細胞凋亡途徑中必不可少的介質。(Bax+/-是HCT116衍生的具有Bax基因的細胞系，Bax//-是HCT116衍生的敲除了Bax基因的細胞系)。本發明還提供了一種siRNA構建物，其具有與細胞凋亡的調控有關的基因要素轉錄出的mRNA同源的核苷酸序列。該siRNA構建物在長度上優選為15到25個核苷酸。該siRNA構建物在長度上更優選為19到23個核苷酸。該siRNA構建物優選包含(i)與圖6中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(ii)以上(i)的核酸序列的遺傳碼簡併結果的核苷酸序列。在本發明的一個優選實施方式中，所述的siRNA構建物在嚴格雜交條件下與圖6中的核酸序列雜交。(Sambrook等人，(1989)分子克隆實驗方法(MolecularCloning；ALaboratoryApproach))。該siRNA構建物優選包含與Bcl-2mRNA354-372位核苷酸同源的核苷酸序列。在本發明的另一個實施方式中，該siRNA構建物包含(iii)與圖7中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(iv)以上(i)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核苷酸序列。在本發明的一個優選實施方式中，所述的siRNA構建物在嚴格雜交條件下與圖7中的核酸序列雜交。該siRNA構建物優選包含與Bcl-xL347-366位同源的核苷酸序列。在本發明的另一個優選實施方式中還提供了治療與不恰當的細胞調亡有關的疾病或生理狀況的方法，其包括給予受試者一種RNA構建物，其特徵在於所述的RNA構建物具有與所述受試者的細胞內存在的mRNA同源的核苷酸序列，其特徵在於所述的mRNA包括與細胞調亡的調控有關的基因要素的基因信息。本文所用的術語「不恰當的細胞調亡」是指細胞調亡的水平以不希望的方式失衡的情形，例如，有利於細胞存活，這便促進了腫瘤的發展和對抗癌藥物的抗性。本發明的另一個優選實施方式還提供了這種RNA構建物在細胞內細胞調亡的調控中的使用，其特徵在於所述的RNA構建物具有與細胞內的mRNA同源的核苷酸序列，其特徵在於所述的mRNA包括與細胞調亡的調控有關的基因要素的基因信息。因而本發明提供了一種用作藥物的RNA構建物。本發明還提供了將RNA構建物用於治療與不恰當的細胞調亡相關的疾病或生理狀況的藥物的製造。本發明還提供了將RNA構建物用於誘導細胞調亡的藥物的製造。在本發明的一個實施方式中，與不恰當的細胞調亡有關的疾病或生理狀況是結腸癌。在本發明的另一個實施方式中，與不恰當的細胞調亡有關的疾病或生理狀況是病毒誘導的癌症。在本發明的另一個實施方式中，與不恰當的細胞調亡有關的疾病或生理狀況是結腸癌、白血病、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌、淋巴瘤、肝癌、腎細胞癌、成神經細胞瘤、腺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、子宮平滑肌瘤。現在通過實施例的方式，並參考以下圖表僅對本發明進行說明；圖1說明了所用siRNA的序列，以及HCT116細胞中Bcl-2的表達。Bcl-2siRNA的a和b序列，分別與Bcl-2mRNA核苷酸77-95位和354-372位等同；Bcl-xL的c序列和核苷酸的347-366位等同(產生RNA的方法，見WO03/008573)。使用VectorNTI衍生了具有配對不準確的鹼基對(二聚體)或形成莖-環結構(環)傾向的預測的二級結構。反義RNA對照組使用了Bcl-2反義核苷酸354-372位，和Bcl-xL反義核苷酸347-366位。在本研究中還使用了對照siRNA(JiangandMilner，2002)和核纖層蛋白A/CsiRNA(Elbashir等人，2001)。d-h，使用不同的抗-Bcl-2抗體的HCT116p53+/+和p53-/-細胞溶解物中Bcl-2蛋白的免疫印跡(箭頭指向)d，＝N19，SantaCruz；e，＝C-2，SantaCruz；f，＝Ab-1，Oncogene；該抗體給出與多種細胞蛋白的非特異性交叉反應性(未顯示)；g，＝Ab-2，Oncogene；和h，＝BDPharmingen。該C-2抗體(SantaCruz)用於隨後所有的實驗。i，用所示的對照siRNA轉染後，HCT116p53+/+細胞中不同時刻的p53和p21的免疫印跡。圖2表明Bcl-2中siRNA的沉默誘導了p53依賴性細胞凋亡。培養p53+/+和p53-/-HCT116細胞的同基因克隆體，並用siRNA如前文所述(方法)轉染。轉染效率＝70-80％。a，Bcl-2的免疫印跡(封閉箭頭)，和核纖層蛋白A/C(開放箭頭)。用對照siRNA、Bcl-2siRNA和核纖層蛋白A/CsiRNA的轉染後時間如圖所示。b，p53+/+和p53-/-HCT116細胞在用對照siRNA、Bcl-2siRNA或用核纖層蛋白A/CsiRNA轉染後24小時和48小時的相差圖像。c，通過DNA梯度確認的凋亡細胞。M＝標準參照物；條帶1＝對照siRNA；條帶2＝Bcl-2(a)siRNA；條帶3＝Bcl-2(b)siRNA。轉染後48小時收集細胞進行分析。d，通過FACS分析(方法)檢測的膜聯蛋白-V-陽性的凋亡細胞。如圖所示轉染後24小時和48小時收集細胞。□＝對照siRNA；□＝Bcl-2(a)siRNA；□＝Bcl-2(b)siRNA；□＝Bcl-2(b)反義RNA。在所有隨後的實驗中，採用Bcl-2(b)siRNA來使Bcl-2的表達沉默，通過單獨的用FACS分析的DNA梯度和膜聯蛋白-V標記技術來確認細胞凋亡。e，轉染時間(0小時)以及釋放進入用HCT116p53+/+細胞中的Bcl-2siRNA轉染之後48小時收集的非粘著性細胞胞質溶膠中的細胞色素c的分布。P＝片狀沉澱物部分；C＝胞質部分。圖3HCT116細胞的同基因克隆體中非p53依賴性細胞凋亡。a-c，使用圖1c所示的siRNA序列使抗細胞凋亡基因Bcl-xL的siRNA沉默。a，用對照siRNA或Bcl-xLsiRNA轉染後不同時刻的Bcl-xL蛋白的免疫印跡。b，用對照siRNA或Bcl-xLsiRNA轉染後48小時和72小時的相差圖像。c，膜聯蛋白-V標記和FACS分析檢測的早期凋亡細胞。如上所述48小時和72小時後收集細胞進行分析。□＝對照siRNA；□＝Bcl-xLsiRNA；□＝Bcl-xL反義RNA。d，舒林酸(方法)處理誘導的細胞凋亡。舒林酸處理後24小時和48小時的細胞相差圖像，舒林酸活化了Bax依賴性、非p53依賴性細胞凋亡(Zhang等人，2000)。通過DNA梯度和膜聯蛋白-V標記的細胞的FACS分析確認了細胞凋亡(未顯示)。圖4Bcl-2或Bcl-xL沉默之後的細胞凋亡取決於Bax和胱冬蛋白酶2。a，如上所述用對照siRNA、Bcl-2siRNA或Bcl-xLsiRNA轉染後72小時Bax+/-和Bax-/-HCT116細胞的同基因克隆體的相差圖像。b，膜聯蛋白-V標記和FACS分析檢測的HCT116細胞的同基因克隆體中的凋亡細胞。如上所述用對照siRNA、Bcl-2siRNA或用Bcl-xLsiRNA轉染後72小時收集細胞；＝Bax+/-細胞和＝Bax-/-細胞。c，如上所述用胱冬蛋白酶2siRNA結合Bcl-2siRNA或Bcl-xLsiRNA轉染之後72小時HCT116p53+/+細胞中(圖2和圖3中使用的相同的克隆體)的凋亡細胞。圖5細胞凋亡與Bcl-2表達沉默之後個體人類結腸癌細胞系中的p53狀態相關聯。細胞用Bcl-2siRNA轉染，48小時後測定凋亡細胞(如圖2的和方法所描述的)。□＝表達內源野生型p53的細胞系；□＝p53缺失細胞系。圖6a和6b說明了Bcl-2α和Bcl-2βmRNA和蛋白質的序列。圖7描繪了Bcl-xLmRNA的序列。Bcl-2表達的選擇性沉默使用了HCT116p53+/+和p53-/-細胞的配對同基因克隆體(Bunz等人，1999；Zhang等人，2000)。為了使Bcl-2的表達沉默我們選擇了兩段Bcl-2mRNA靶點序列(圖1ab)。二者在人類和鼠科Bcl-2之間均為100％保守。通過對Bcl-2蛋白進行免疫印跡來監視Bcl-2表達的沉默。應當注意到在先前的對照良好的研究中，在HCT116細胞溶解物的免疫印跡中沒有清楚地檢測到Bcl-2(Zhang等人，2000)。使用相同的抗體(N19，SantaCruz；圖1d)時確認了這一觀察。然而，其它抗體在HCT116細胞中清除地檢測到Bcl-2，重要的是，顯示了p53+/+和p53-/-細胞中的Bcl-2蛋白水平是相等的。與轉染過程相關的必然應激(inevitablestress)在p53+/+細胞中並不足以將p53活化為轉錄因子，這一點從缺乏p53靶蛋白p21的上位調控可以明顯看出(圖1i)。用Bcl-2siRNA轉染24小時之內Bcl-2蛋白處於幾乎檢測不到的水平(圖2a)。有趣的是，僅僅兩個Bcl-2siRNA之一沉默了Bcl-2的表達(Bcl-2(b)；圖2)表明由於某種原因必須通過RNA幹擾保護與非有效siRNA同源的mRNA序列(核苷酸77-95；圖1a)使之不受識別和/或降解。這樣的保護可以由於局部mRNA二級結構或蛋白-mRNA相互作用產生(參見JiangandMilner，2002)。對照轉染包括一段隨機的siRNA序列(對照siRNA，JiangandMilner，2002)和核纖層蛋白A/CsiRNA，先前已顯示其抑制了核纖層蛋白A/C蛋白的表達而不誘導細胞凋亡(Elbashir等人，2001)。Bcl-2的沉默誘導p53依賴性細胞凋亡用Bcl-2siRNA轉染的p53+/+細胞內48小時內觀察到大規模細胞凋亡(Bcl-2(b)；圖2b-d)。Bcl-2反義RNA(反義序列354-372)轉染的細胞的細胞凋亡可忽略不計(圖2d)，這相當於使用對照siRNA轉染時觀察到的情況。這一點確認了p53+/+細胞中Bcl-2siRNA誘導的細胞凋亡應歸因於RNA幹擾。核纖層蛋白A/C的siRNA沉默在p53+/+或p53-/-細胞中均不能導致細胞凋亡(圖2b)。這一點說明了RNA幹擾的過程本身並不足以活化HCT116p53+/+細胞的細胞凋亡。出乎意料的是，p53-/-細胞在Bcl-2表達沉默之後不再經歷細胞凋亡(圖2b-d)。因此我們推斷Bcl-2表達的選擇性沉默誘導了HCT116結腸癌細胞的大規模細胞凋亡，並且這一作用依賴於p53。最近已經表明Bcl-2能夠調控不依賴於線粒體細胞色素c的釋放和Apaf1/胱冬蛋白酶9的活化而被激活的細胞凋亡途徑(Marsden等人，2002)。這便提高了p53可能啟動這種不依賴於細胞色素c的途徑的可能性，因此解釋了觀察到的Bcl-2的沉默之後p53+/+和p53-/-細胞之間在細胞凋亡上的差別(圖2)。然而，對細胞色素c分布的分析清楚地表明細胞色素c釋放進入了經歷了用Bcl-2siRNA處理之後的細胞凋亡的p53+/+細胞的胞質溶膠中(圖2e)。長期暴露於免疫印跡時，線粒體細胞色素c在用Bcl-2siRNA處理後的貼壁p53+/+細胞中的釋放也很明顯，但是在用Bcl-2siRNA處理的p53-/-細胞的平行培養物中卻檢測不到胞質細胞色素c(未顯示)。這些結果顯示，Bcl-2的沉默誘導了通過與從線粒體釋放細胞色素c相關的途徑的p53依賴性細胞凋亡。Bcl-xL的沉默誘導非p53依賴性細胞凋亡非p53依賴性細胞凋亡途徑的完整性接下來由Bcl-xL基因的沉默確認，並再次使用了RNA幹擾。Bcl-xL是一種抗細胞凋亡基因(Boise等人，1993)，結腸上皮細胞中Bcl-xLBax的比例的降低便足以誘導細胞凋亡(Zhang等人，2000)。因此我們預測在p53+/+和p53-/-兩種細胞中Bcl-xL的選擇性沉默都將會到誘導凋亡細胞的死亡。事實證明了這樣一種情況。首先我們確定所選的Bcl-xLsiRNA序列(見圖1c)可有效地降低Bcl-xL蛋白的表達(圖3a)，接下來論證了其誘導細胞凋亡的能力(圖3b-c)。用Bcl-xLsiRNA轉染後24小時和48小時之間Bcl-xL蛋白的水平下降，接下來在p53+/+和p53-/-兩種細胞中均觀察到細胞凋亡。這表明對於結腸上皮細胞中Bcl-xL-調控的細胞凋亡途徑來說，p53並非必需的。通過用已知可激活Bax依賴性細胞凋亡的舒林酸處理細胞，非p53依賴性細胞凋亡的途徑得到了進一步的證實(Zhang等人，2001)。舒林酸在p53+/+和p53-/-兩種細胞中均誘導了細胞凋亡(圖3d；又見Zhang等人，2000)。在所有這些結果的基礎上，我們推斷所觀察到的用Bcl-2siRNA處理的p53-/-細胞中細胞凋亡的缺乏(圖2)不能歸因於Bax的缺失或其它由Bcl-xL抑制的細胞凋亡途徑。這一點與這兩種細胞克隆體的同基因本質一致，並表明p53是Bcl-2沉默誘導的細胞凋亡的選擇性要求。Bax和胱冬蛋白酶2對於Bcl-2或Bcl-xL沉默之後的細胞凋亡所必需的迄今我們的結果顯示了Bcl-2組成性地抑制了在培養液中生長的結腸癌細胞的細胞凋亡，並顯示了在Bcl-2表達沉默之後，細胞凋亡過程需要p53。這一點是新穎的，並帶來了在Bcl-2調控下p53的促細胞凋亡功能。而且，p53的這一促細胞凋亡功能並不需要用例如5-FU的細胞毒性試劑對細胞進行處理。(注意RNA幹擾過程自身並不足以激活p53誘導的細胞凋亡，這一點通過用核纖層蛋白A/CsiRNA處理的p53+/+細胞中細胞凋亡的缺乏得到說明，見上文)。另外，我們顯示了Bcl-xL的沉默以非p53依賴性的方式誘導了細胞凋亡(圖3)。這一點與早期的工作一致，確定了Bax是結腸癌細胞細胞凋亡響應中的主要參與者(Ionov等人2000；Zhang等人，2001；LeBlanc等人，2002)，並且Bcl-xL是其抗細胞凋亡的對應物(當外源性表達時，Zhang等人，2001)。這些觀察結合起來使得我們有理由認為Bcl-2/p53和Bcl-xL/Bax可能代表了對照人類結腸上皮細胞中細胞凋亡的功能配對物。在這一假說中設想了至少兩個假定的細胞凋亡途徑(i)Bcl-2/p53可能定義了一種基本不依賴Bcl-xL/Bax的細胞凋亡途徑；或(i)Bcl-2/p53和Bcl-xL/Bax在細胞凋亡過程中可能對照著相互關聯的轉變。為了區別這兩種可選擇的情況，我們在Bax+/+和Bax-/-HCT116細胞的同基因克隆體中分別地沉默了Bcl-2和Bcl-xL的表達(注意Bax+/-細胞的細胞凋亡響應與Bax+/+細胞相當；Zhang等人，2000)。Bcl-2和Bcl-xL的siRNA沉默在Bax+/-細胞中誘導了大規模細胞凋亡，但是在Bax-/-細胞中未能導致顯著的細胞凋亡(圖4c和d)。這一點清楚地說明了Bax對於Bcl-2調控的和Bcl-xL調控的兩種途徑的細胞凋亡均是必需的。上述結果表明，結腸癌細胞中Bcl-2和Bcl-xL細胞的死亡途徑在對Bax的需求上具有共同性，但是在對p53的需求上有所不同。有可能是被Bcl-2選擇性抑制的促細胞凋亡的途徑的開始需要p53，因此降低了Bcl-沉默之後的細胞凋亡閾值。為了進一步剖析Bcl-2、Bcl-xL、p53和Bax之間的功能關聯，我們接下來提出了是否還涉及胱冬蛋白酶2的問題。當胱冬蛋白酶2siRNA分別與Bcl-2siRNA或Bcl-xLsiRNA共轉染時，Bcl-2或Bcl-xL的沉默誘導的細胞凋亡被阻斷(圖4c；胱冬蛋白酶2siRNA序列，見Lassus等人，2002)。單獨的胱冬蛋白酶2的沉默(圖4c)，或者用反義胱冬蛋白酶2RNA轉染(未顯示)，對細胞生存沒有明顯的影響。所有這些結果表明，Bax和胱冬蛋白酶2二者對於p53+/+結腸癌細胞中Bcl-2或Bcl-xL沉默之後的細胞凋亡均是必需的。這一點與最近的證據一致，其證明胱冬蛋白酶2促使了Bax向線粒體中的轉運，以及接下來由細胞色素c的釋放標記的線粒體膜的滲透性。Bcl-2siRNA對單個結腸癌細胞系中變化的p53狀態的影響上述實驗涉及HCT116細胞的同基因克隆體，因此受基因變異的嚴格制約。為了建立我們的觀察的一般原則，我們沉默了其它人類結腸癌細胞系中的Bcl-2，其DNA錯配修復也缺失，並定義了p53的狀態下(見方法)。在每種情況下，野生型p53的存在與用Bcl-2siRNA轉染後48小時可檢測的細胞凋亡的誘導有關，而p53缺失與細胞凋亡的本底水平有關(圖5)。這些結果確認了我們對p53+/+和p53-/-細胞的同基因克隆體的觀察，與Bcl-2組成性地抑制結腸癌細胞中p53依賴性細胞凋亡的觀點一致。材料和方法細胞系和轉染HCT116克隆體在具有10％FCS的DMEM中培養。所有的細胞克隆體與100單位ml-1青黴素和100μgml-1鏈黴素在5％CO2的空氣中37℃培養。其它人類結腸癌細胞系，也有DNA錯配修復缺陷(見Branch等人，1995)，為Lovo和PKO(p53野生型)；DLD1、LS174T、SW48和HT29(所有的p53突變體)。為了進行轉染，對細胞進行胰蛋白酶消化，並傳代培養到無抗體的6孔培養板(10cm2)中，每孔1.5×105個細胞。根據提供的說明書合成並用HPLC純化(德國MWG)選擇的21核苷酸的RNA，並將其退火為siRNA雙螺旋。傳代培養24小時之後，根據製造商提供的說明書將細胞用裝入脂質體中的siRNA(Oligofectamine，LifeTechnologies)轉染。該方案包括在不含血清的培養基中孵育一小段時間，但是對照組表明這並不足以激活p53反應(見結果部分)。siRNA的濃度為每孔1.5×105個細胞中0.58μg。培養用培養基的最終體積為每孔1.5mL。如結論部分所示，其後不同的時間收集細胞進行分析。HCT116細胞的每一實驗重複四次或更多次。轉染效率通過用包含FITC-葡聚糖的脂質體轉染來確定(JiangandMilner，2002)。反義RNA對照組包括在每一使用Bcl-2(b)、Bcl-xL和胱冬蛋白酶2各自的反義序列的實驗中(見圖1a和正文)。免疫印跡和線粒體細胞色素c的釋放為了進行免疫印跡，對細胞進行胰蛋白酶消化，用PBS洗滌，並移出一等份進行細胞計數。剩餘的細胞用50μL裂解緩衝液(150mMNaCl；0.5％NP40；50mMTrispH8.0)在冰上裂解30分鐘。樣品用4倍強度的Laemlli緩衝液1∶1稀釋。蛋白質用15％的SDS-PAGE溶解，並電印跡到硝化纖維素膜上進行抗體檢測。將分子量標記和純化的重組人類p53包括為標準參照物(未顯示)。使用如下抗體對於Bcl-2＝N19和C-2(SantCruz)；Ab-1和Ab-2(Oncogene；注意Ab-1給出與多種細胞蛋白的非特異性背底；未顯示)；和BD(Pharmingen)(圖1b)。C-2抗體給出了最乾淨的結果，並在隨後的實驗中全部使用它。核纖層蛋白A/C＝抗體636；(SantaCruz)；Bcl-xL＝Bcl-X抗體(Pharmingen；該抗體給出相對較高的非特異性背底)。P53＝DO-1抗體(Oncogene)和胱冬蛋白酶2＝胱冬蛋白酶-2L抗體(F-7；SantaCruz)。結合抗體的顯像由化學發光增強(Roche)。細胞分離(fractionation)和細胞色素c的檢測如Marsden等人(2002，補充材料)所述進行。細胞生長、細胞周期分析和細胞調亡通過細胞計數測定細胞生長曲線。舒林酸誘導的細胞調亡(見圖3)採用了舒林酸sulphide120μM(Calbiochem)。收集細胞，用PBS洗滌，並在-20℃下在90％的乙醇中固定過夜，以進行細胞周期分析。將固定的細胞壓片，用PBS洗滌，再次分散在含0.1μg/ml的碘化丙錠和200U/ml的核糖核酸酶A的PBS中，並用FACS分析。在製造商提供的方案之後使用膜聯蛋白-V-Fluos(Boehringer)來識別調亡細胞。另外根據製造商提供的說明書使用自殺-徑跡(suicide-track)DNA梯度分離試劑盒(Oncogene)，由DNA梯度證實了細胞調亡。討論我們在本研究中使用了同基因細胞克隆體和siRNA，以得到細胞中定義的促細胞調亡與抗細胞調亡基因表達的組合，否則它們在遺傳上是對等的。我們的觀察顯示了一種新的細胞調亡途徑，其中Bcl-2組成性地抑制了p53依賴性細胞調亡。通過用例如5』FU的製劑處理細胞以激活p53，也可以誘導細胞的調亡(Zhang等人，2000及未顯示的結果)。這一點與確定的證據一致，即激活的p53在Bcl-2的上遊起作用，響應基因毒性的壓力(見Strasser等人，1994；和Johnstone等人的綜述，2002；CoryandAdams2002)。為了使我們當前的觀察與本研究的背景協調，我們提出Bcl-2組成性地抑制新的p53的促細胞調亡功能，暴露於基因毒性的壓力下則通過誘導p53的反式激活潛力越過了Bcl-2的抑制。一旦激活為轉錄因子，p53便具有改變Bcl-2與Bcl-xL(下位調控)和Bax(上位調控)的表達比，有利於細胞調亡的能力(見Johnstone等人，2002)。從臨床的觀點來說，這一點對於抗癌治療非常有用，但是帶來了p-53激活劑導致的非特異性細胞毒性和基因毒性的內在風險。本發明顯示，p53具有促細胞凋亡的性質，其雖然被Bcl-2抑制，但顯現出組成性活性。Bcl-2確定為抗結腸癌的治療中有希望的潛在靶點(又見Reed等人，2002)，並證明了Bcl-2對siRNA沉默的可行性。其它表皮腫瘤的存活可能同樣受Bcl-2沉默的影響。隨著RNA幹擾的發展，特定基因的選擇性沉默如今具有現實的可能性，靶向輸送體系方面持續不斷的創造性發展(例如見Hood等人，2002)將會促使RNA幹擾應用於預防和治療癌症。本發明還對具有遺傳性DNA錯配修復缺陷和相關結腸癌誘因的患者提供了重要建議。具體來說，由於已經確定缺失錯配修復使得Bax基因容易發生突變並有利於Bax缺失細胞的克隆擴增，不應在這樣的患者上採用舒林酸作為化學預防劑。本研究中我們證明，Bax是新發現的Bcl-2/p53途徑調控的細胞凋亡中必不可少的介質(見上文)。由此得出結論，對於具有錯配修復缺失的患者，任何Bax-缺失細胞的選擇性壓力可能加劇腫瘤的發生，應當避免。p53的組成性促細胞凋亡功能可能與正常結腸上皮中的頂端細胞凋亡相關聯。假如是這樣的話，結腸上皮腫瘤中細胞凋亡不再發生可能反映了對固有的p53誘導的細胞凋亡的不適當抑制。在這一點上強有力的候選物是組成性阻斷p53誘導的細胞凋亡並促使結腸癌細胞存活的Bcl-2。這種模型與結腸癌的惡性發展中p53突變的晚期發作相一致。它還加強了Bcl-2作為一種新型抗癌製劑的發展的首要靶點。例如Bcl-2的細胞抗細胞凋亡基因的病毒同源物代表了治療病毒誘導的癌症中有希望的靶點。人類Bcl-2表達的沉默確定RNAi機理可用於Bcl-2mRNA序列。已發現僅兩個不同抗-Bcl-2siRNA之一是有效的，這強調了任何基於RNA幹擾的抗病毒治療的發展中，對靶向序列的選擇和確認的重要性。可用於RNAi的包含病毒特異性核苷酸序列的Bcl-2的病毒同源體(v-Bcl-2)將代表著基於RNAi的抗病毒/抗癌治療的有希望的靶點。參考文獻Boise，L.H.等人1993.作為凋亡細胞死亡的主要調控子的Bcl-2相關基因。Cell74，597-608.Branch，P.，Hampson，R.andKarran，P.1995.人類結腸癌細胞系中的DNA錯配結合缺失、DNA損傷耐受性和增變表現型。CancerResearch55，2304-2309.Bunz，F.等人1999.人類癌細胞中p53的破壞改變化療製劑的反應。J.Clin.Invest104，263-269.Cory，S.andAdams，J.M.2002.Bcl2家族細胞生存或死亡開關的調控子。NatureReviewsCancer2，647-656.Elbashir，S.M.等人2001.21核苷酸RNA雙螺旋在培養的哺乳動物細胞中介導RNA幹擾。Nature441，494-498.He，T.C.，Chan，T.A.，Vogelstein，B.Kinzler，K.W.1999.PPARδ是非甾體抗炎藥物的APC-調控靶點。Cell99，335-345.Hood，J.D.等人2000.通過靶定基因向新生血管傳遞的腫瘤退化。Science296，2404-2407.Ionov，Y.，Peinado，M.A.，Malkhosyan，S.，Shibita，D.Perucho，M.1993.遍體細胞中簡單重複序列突變揭示了一種結腸致癌的新機制。Nature363，558-561.Ionov，Y.，Yamamoto，H.，Krajewski，S.，Reed，J.C.Perucho，M.2000.促細胞凋亡基因Bax的突變失活在腫瘤無性進化中具有選擇性優勢。Pro.Natl.Acad.Sci.USA97，10872-10877.Jiang，M.，Milner，J.2002.一種RNA幹擾引物siRNA處理的人類HPV-陽性宮頸癌細胞中病毒基因表達的選擇性沉默。Oncogene216041-6048.Lassus，P.，Optiz-Araya，X.Lazebnik，Y2002.線粒體滲透前壓力誘導的細胞凋亡對胱冬蛋白酶2的需求。Science2971352-1354.Johnstone，R.W.，Ruefli，A.A.Lowe，S.W.2002.細胞凋亡癌遺傳學與化學治療之間的聯結。Cell108153-164.LeBlanc，H.等人2002.腫瘤細胞通過促細胞凋亡Bcl-2同源體Bax的突變滅活對死亡受體誘導的細胞凋亡的抗性。NatureMedicine8，274-281.Lynch，H.T.1999.遺傳性非息肉病結腸癌(HNPCRC)。Cytogenet.CellGenet.86，130-135.Marsden，V.S.等人2002.不依賴於細胞色素c/Apaf-1/胱冬蛋白酶9凋亡體的Bcl-2調控的胱冬蛋白酶活化引發的細胞凋亡。Nature419634-637.Rampino，N.等人1997.微衛星增變表現型結腸癌中BAX基因的體細胞移碼突變。Science275，967-969.Reed，J.C.2002.基於細胞凋亡的治療。Nat.Rev.DrugDiscov.1111-121.Strasser，A.，Harris，A.W.，Jacks，T.Cory，S.1994.DNA損傷能夠通過不依賴p53的可被BCL-2抑制的機制誘導增殖性淋巴細胞中的細胞凋亡.。Cell79329-339.Yamamoto，Y.，Yin，M.J.，Lin，K.M.Gaynor，R.B.1999.舒林酸抑制NF-kappaB途徑的激活。J.Biol.Chem.274，27307-27314.Zhang，L.，Yu，J.，Park，B.H.，Knizler，K.W.Vogelstein，B.2000.BAX在對抗癌試劑的細胞凋亡響應中的作用。Science290989-992.權利要求1.一種調控細胞凋亡的方法，其特徵在於所述的方法包括向細胞中導入含有與所述細胞內的mRNA同源的核苷酸序列的RNA構建物，所述的mRNA包括與細胞凋亡的調控有關的基因要素的基因信息。2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的基因要素與細胞凋亡的抑制有關。3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述的基因要素為Bcl-2。4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述的基因要素包括以下核酸分子或其部分(i)圖6表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可與(i)中的任意核酸序列雜交，並具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核酸分子。5.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述的基因要素為Bcl-xL。6.根據權利要求5所述的方法，其中的基因要素包括以下核酸分子或其部分(i)圖7表示的核酸分子或其功能片段；(ii)可與(i)中的任意核酸序列雜交，並具有siRNA活性的核酸分子；(iii)以上(i)和/或(ii)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核酸分子。7.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於所述的基因要素為與細胞凋亡的調控有關的基因的病毒同源物。8.一種siRNA構建物，其具有與細胞凋亡的調控有關的基因要素轉錄的mRNA同源的核苷酸序列。9.根據權利要求8所述的siRNA構建物，其特徵在於所述的結構在長度上為15到25個核苷酸。10.根據權利要求9所述的siRNA構建物，其特徵在於所述的結構在長度上為19到23個核苷酸。11.根據權利要求8-10中的任何一項所述的siRNA構建物，其包含(i)與圖6中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(ii)以上(i)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核苷酸序列。12.根據權利要求8-11中的任何一項所述的siRNA構建物，其包含與Bcl-2mRNA核苷酸354-372位同源的核苷酸序列。13.根據權利要求8-10中的任何一項所述的siRNA，其包含(i)與圖7中的核酸序列的部分或片段同源的核苷酸序列；(ii)以上(i)的核酸序列遺傳碼簡併的結果的核苷酸序列。14.根據權利要求8-10或13中的任何一項所述的siRNA構建物，包含與Bcl-xL核苷酸347-366位同源的核苷酸序列。15.一種治療與不恰當的細胞調亡有關的疾病或生理狀況的方法，其包括給予受試者RNA構建物，其特徵在於所述的RNA構建物具有與所述受試者的細胞內存在的mRNA同源的核苷酸序列，其特徵在於所述的mRNA包括與細胞調亡的調控有關的基因要素的基因信息。16.權利要求8-14中的任何一項所述的RNA構建物在細胞調亡的調控中的應用，其特徵在於所述的RNA構建物具有與細胞內的mRNA同源的核苷酸序列，其特徵在於所述的mRNA包括與細胞調亡的調控有關的基因要素的基因信息。17.RNA構建物作為藥物的應用。18.RNA構建物在製備誘導細胞調亡的藥物中的應用。19.RNA構建物在製備治療結腸癌的藥物中的應用。20.RNA構建物在製備治療病毒誘導的癌症的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一種調控細胞凋亡的方法。該方法包括向細胞中導入一種包含與所述細胞內的mRNA同源的核苷酸序列的RNA構建物的步驟。細胞內的該mRNA包括與細胞凋亡的調控有關的基因要素的基因信息。本發明還涉及一種具有與細胞凋亡的調控有關的基因要素轉錄的mRNA同源的核苷酸序列的siRNA構建物。文檔編號A61P35/00GK1761681SQ200480007384公開日2006年4月19日申請日期2004年3月17日優先權日2003年3月18日發明者J·米爾納申請人:J·米爾納