一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法
2023-05-04 23:18:06
一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種高穩定性飼用液體複合酶的製備工藝，首先利用液體深層工業發酵方法產出發酵液，然後分別對單酶進行精製與純化，製成的均一、穩定、澄清、透明的單酶液可長時間保存，待需要時根據需求將單酶進行任意比例的復配得到穩定的成品酶液。本發明採用先製備穩定的單酶液待需要時進行任意比例的復配的方法，工藝先進，設備簡單，操作靈活，復配前的單酶液純度高穩定性好，可進行長時間的儲存，復配後的成品酶穩定性極高，酶液中的蛋白性質接近，解決了現有工藝生產中設備和材料投入成本高、成品酶穩定性低、極易發生沉澱、易受雜質酶影響導致貯存期間酶活大量損失及不能靈活進行任意比例的復配的問題。
【專利說明】一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種高純度高穩定性飼用液體複合酶的製備方法。
【背景技術】
[0002]酶是一種活性蛋白質，對外部環境很敏感，在高溫、高壓下極易變性失活，目前，外援酶在家禽家畜飼料中的添加應用發展較快，現有加酶飼料中顆粒飼料佔有較大比重。在顆粒飼料的生產過程中，需要在高溫高壓蒸汽下調製後擠壓制粒之後進入冷卻系統，顆粒進入冷卻系統之前的料溫可達到78~90°C，高溫導致飼料自身的內源酶和外添加酶的活性受到不同程度的損失。為降低酶活損失，通常採用酶的穩定化技術和後噴塗技術，後噴塗技術作為一項新型的飼料加工工藝，可以有效的保護酶以及和酶性質相似的熱敏性組分的有效性。因此，利用液體酶進行的後噴塗技術得到良好的推廣應用，液體酶的製備成為現有研究熱點。[0003]傳統液體複合酶的製備技術中一般採用固體發酵法，將固體發酵曲料經傳統常規工藝進行壓榨過濾後，對得到的濾清液進行簡單處理即作為液體複合酶成品，由於各酶種的生產工藝、生產條件及菌種差異等極易產生沉澱，複合酶穩定性較低，使用這種液體複合酶製劑進行噴塗時，不僅會導致噴霧系統堵塞，損壞噴塗設備，而且還對自動化生產造成不便；同時，一般先將單酶混合後再進行簡單純化，提純工藝簡單，雜質酶無法去除，且單酶的比例不易控制，不能靈活按照需要進行任意比例的復配。
【發明內容】
[0004]本發明目的在於提供一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，解決現有飼用液體複合酶製備中採用固體發酵法得到發酵曲料、由曲料得到濾清液的處理過程簡單原始、成品複合酶穩定性較低易沉澱、使用時易導致噴霧系統堵塞損壞噴塗設備、不僅對自動化生產造成不便還造成酶活浪費的問題；還解決現有多種單酶混合後再處理的工藝製作過程中成品酶的酶種組成配比不可調節、生產和貯存期間酶活大量損失的問題；還解決現有技術設備和材料投入成本高的技術問題。
[0005]為解決上述技術問題，本發明採取的技術方案如下:
一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於具體包括下列步驟:
A、選用高產單酶的工程菌株，進行大規模液體深層工業發酵，產出單酶含量較高的發酵液；
B、將液體發酵產出的單酶發酵液過碟片離心機，得到單酶清液；
C、將單酶清液過陶瓷膜，截留殘留菌體以及比酶分子大的顆粒，收集清液得到單酶陶清液；
D、將單酶陶清液過有機膜，截留酶分子，排出小分子的雜蛋白、無機鹽和一部分水，同時使酶液濃縮，得到單酶濃縮酶液；E、在所得單酶濃縮酶液中加離子水進行稀釋，得到單酶稀釋酶液；
F、在所得到的單酶稀釋酶液中加入沉降劑、穩定劑和防腐劑，並調節pH至4.4~5.5，置於玻璃鋼罐體中進行自然沉降；
G、通過玻璃鋼罐體側壁上的清液放料口取出沉降好的單酶清液；
H、按照步驟A~G的方法製備其他單酶清液；
1、在去離子水中加入穩定劑、防腐劑，並調節pH至4.4~5.5，得到稀釋液；
J、將步驟H中沉降好的多種單酶清液和步驟I中製備的稀釋液進行均勻混合，至此，液體複合酶製備完成。
[0006]作為本發明的優選技術方案，本專利中提到的酶種範圍即所述步驟A或H中的單酶為NSP (非澱粉多糖)單酶，如木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等，也可為植酸酶。[0007]作為本發明的優選技術方案，所述步驟C中陶瓷膜的孔徑範圍為0.05~0.1 μ m。
[0008]作為本發明的進一步優選技術方案，所述步驟D中有機膜截留小分子的分子量為8000 ~10000。
[0009]作為本發明的進一步優選技術方案，所述步驟E中稀釋酶液的最終稀釋濃度為:纖維素酶3000~5000U/g，其餘單酶的酶活3~5萬U/g。
[0010]作為本發明的進一步優選技術方案，所述步驟F中的沉降劑為十二水合硫酸鋁鉀、硫酸鋅，其重量比為稀釋酶液:十二水合硫酸鋁鉀:硫酸鋅=100:0.5~0.6:0.3~0.5。
[0011]作為本發明的進一步優選技術方案，所述步驟F中的穩定劑為山梨糖醇、葡萄糖、硫酸鎂和乙酸鈉，其重量比為稀釋酶液:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸鎂:乙酸鈉=100:8~12:3 ~6:0.8 ~1.3:3 ~6。
[0012]進一步的，所述步驟F中的防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、卡松和氯化鈉，其重量比為稀釋酶液:苯甲酸鈉:山梨酸鉀:卡松:氯化鈉=100:0.1~0.25:0.4~
0.6:0.15-0.25:10 ~14。
[0013]作為本發明的進一步優選技術方案，所述步驟I中的穩定劑為山梨糖醇、葡萄糖、硫酸鎂和乙酸鈉，其重量比為去離子水:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸鎂:乙酸鈉=100:8~12:3 ~6:0.8 ~1.3:3 ~6。
[0014]進一步的，所述步驟I中的防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、卡松和氯化鈉，其重量比為去離子水:苯甲酸鈉:山梨酸鉀:卡松:氯化鈉=100:0.1~0.25:0.4~0.6:0.15~
0.25:10 ~14。
[0015]作為本發明的進一步優選技術方案，所述步驟J中的單酶清液與稀釋液的混合比例根據實際酶活需要自行配比。
[0016]與現有技術相比，本發明提供了一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，首先進行單酶的精製與穩定化處理，然後創造穩定的復配環境將單酶進行任意比例的復配，本發明的技術優勢在於:
1、先進的分離和多層截留工藝
具體為利用液體深層工業發酵方法產出發酵液，經過離心機離心去除大部分的菌體和發酵所產生的固體殘渣，離心後的清液在按順序過陶瓷膜和有機膜，陶瓷膜是截留較大顆粒物質，有機膜是截留酶分子相近的顆粒，排除小顆粒物質和水。經過雙向截留，清液中都是和酶分子相近的蛋白，這樣不僅去除了大量雜蛋白、無機鹽等一些雜質，而且起到了濃縮酶液的作用，同時，該步驟也使不同種類酶液中的蛋白分子特性更相近，為複合酶的穩定性提供了必要條件。
[0017]2、優勢的穩定化配方
本發明採用專用的添加劑配方，具體優勢分別解析如下:
沉降劑:沉降劑中十二水硫酸鋁鉀在水中水解出氫氧化鋁膠體，膠體粒子帶有正電荷，會和一些帶負點的粒子電荷中和形成膠粒，膠粒可以吸附懸浮的不穩定顆粒，從而體積變大，最終沉入水底，此外在弱酸環境中硫酸鋁鉀的水解受到一定的抑制作用，使得沉降更溫和，作用周期更長，並在整個沉降周期中逐步耗盡，硫酸鋅中鋅離子可以和NSP酶類進行特異性結合使之帶微弱的正電荷，在沉降過程中起到保護酶的作用；
穩定劑:穩定劑配方中山梨糖醇和葡萄糖會少量增加液體粘度，增加酶液鈍性從而緩解外接環境變化對酶液的影響，硫酸鎂中的鎂離子可以對NSP酶類的酶活具有激活作用，乙酸鈉為pH穩定劑；
防腐劑:整個工藝並沒有在無菌條件下進行，不可避免混入空氣中的菌類。防腐劑中苯甲酸鈉、山梨酸鉀、卡松和氯化鈉的聯合應用和最優配比使得防腐劑的抗菌譜更廣。
[0018]此外，酶是一種蛋白質具有等電點，當酶液pH由於某些因素造成pH變化，達到某種酶的等電點，就會出現酶凝聚沉澱的現象，所以穩定酶液PH也是重要的環節。 [0019]本發明通過以上的沉降防腐的穩定化技術，使得酶液中的蛋白質酶學性質更相似，從而達到均一、穩定、澄清、透明的、可在後期復配過程中根據實際酶活需要進行任意比例配製的高穩定性飼用液體複合酶。
[0020]3、設備和材料投入成本低
本發明中所涉及的設備和原料均為市場上容易採購的常規廉價產品，使得液體複合酶的生產投入和成本大大降低。
[0021]4、可靈活進行復配
在需要液體複合酶時，可在短時間內把處理好的多種單酶清液按比例復配即可，產品的酶種配比更靈活，生產快速、便捷。
[0022]5、成品穩定性高
本發明製備方法採用單酶單獨處理的方式，單酶處理後可存放2年，液體仍然澄清透明，酶活損失在15%以下；生產出的液體複合酶，在保質期6個月內無沉澱或僅有微量沉澱，酶活損失控制在10%以內。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1是本發明高穩定性飼用液體複合酶的製備流程圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合四個具體實施例對本
【發明內容】
進行進一步的說明。以下實施例僅是對本發明的優選實施方式進行描述，並非對本發明的範圍進行限定，在不脫離本發明設計精神的前提下，本領域普通技術人員對本發明的技術方案做出的各種變形和改進，均應落入本發明權利要求書確定的保護範圍內。本發明所涉及的設備均為本行業常用設備，包括碟片離心機、陶瓷膜、有機膜以及玻璃鋼罐。所用的酶活檢測方法為本行業常用方法，所用原料為飼用級或食品級，所用菌種為行業內常用液體發酵單酶菌種，其所產出的單酶分別為木聚糖酶、纖維素酶、植酸酶、甘露聚糖酶等。
[0025]實施例一
1、如圖1所示，按照製備流程，選用高產單酶的工程菌株進行大規模液體深層工業發酵，液體深層發酵技術為現有成熟技術，此處不再贅述，得到的單酶深層液體發酵的發酵液包括木聚糖酶發酵液、甘露聚糖酶發酵液、纖維素酶發酵液分別過碟片離心機，得到清液過0.10 μ m孔徑陶瓷膜，取陶清液過I萬分子量孔徑有機膜濃縮，木聚糖酶濃縮酶液加去離子水稀釋至50000U/g，甘露聚糖酶濃縮酶液加去離子水稀釋至50000U/g，纖維素酶濃縮酶液加去離子水稀釋至3000U/g。
[0026]2、在稀釋好的酶液中分別按比例加入沉降劑、穩定劑、防腐劑，具體比例為稀釋酶液:十二水合硫酸鋁鉀:硫酸鋅:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸鎂:乙酸鈉:苯甲酸鈉:山梨酸鉀:卡松:氯化鈉=100:0.5:0.4:12:5:1.2:5:0.2:0.6:0.2:14攪拌均勻後，置於玻璃鋼罐內沉降5~7天，從清液放料口放出清液備用。
[0027]3、在去離子水中加入穩定劑、防腐劑，具體比例為去離子水:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸鎂:乙酸鈉:苯甲酸鈉:山梨酸鉀:卡松:氯化鈉=100:12:5:1.2:5:0.2:0.6:0.2:14攪拌均勻後，備用。
[0028]4、配製液體複合酶1000 kg，在成品混合罐中加入沉降後的木聚糖酶液201 kg，甘露聚糖酶液48 kg,纖維素酶200 kg,稀釋液551kg,混合均勻後即得液體複合酶成品，經檢測，木聚糖酶11055U/ml，甘露聚糖酶2440U/ml，纖維素酶65 lU/ml。
[0029]實施例二
工藝方法同實施例一，配製含木聚糖酶、纖維素酶、甘露聚糖酶、植酸酶的四種酶的液體複合酶1000 kg，在成品混合罐中加入沉降後的木聚糖酶液201 kg，甘露聚糖酶液48 kg,纖維素酶333.3 1^，植酸酶100此，稀釋液317.7 kg，混合均勻後即得液體複合酶成品，經檢測，木聚糖酶11834U/ml，甘露聚糖酶2406U/ml，纖維素酶1024U/ml，植酸酶5437U/ml。
[0030]實施例三
為了證明本發明製備出的液體複合酶的穩定性，快速評價其在長期貯存以及運輸過程中的穩定性，本實施例利用化學動力學來量化外來因素如溫度、溼度、壓力、光照等對質變反應的影響，通過控制產品處於一個或多個外在因素高於正常水平的環境中，引起質變的速度加速較短時間內即可判定產品是否變質。振蕩和溫度通常為產品質量衰退的重要因素。採購市場上的液體複合酶和本發明製作的液體複合酶進行加速實驗對比，具體實驗如下:
把100mL液體複合酶裝入500ml的三角瓶中，封住瓶口，置於恆溫搖床中，設定溫度為45°C，迴旋頻率為200rpm，時間24h，檢測實驗前後樣品的酶活水平以及吸光值(546nm)的變化情況，其中，複合酶a為本發明實例一中生產的批次樣品，複合酶b、c、d為在市場上採購的其他複合酶產品，數據見表1:
【權利要求】
1.一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於具體包括下列步驟: 選用高產單酶菌株進行大規模液體深層工業發酵，產出單酶含量較高的發酵液； 將步驟A液體發酵產出的發酵液過碟片離心機，得到單酶的酶清液； 將單酶的酶清液過陶瓷膜，截留殘留菌體和比酶分子大的顆粒，收集清液得到單酶陶清液； 將單酶陶清液過有機膜，截留酶分子，排出小分子的雜蛋白、無機鹽和部分水，使酶液濃縮，得到單酶濃縮酶液； 在所得單酶濃縮酶液中加去離子水進行稀釋，得到單酶的稀釋酶液； 在所得單酶的稀釋酶液中加入沉降劑、穩定劑和防腐劑，並調節pH至4.4~5.5，置於玻璃鋼罐體中進行自然沉降； 通過玻璃鋼罐體側壁上的清液放料口取出沉降好的單酶清液，放置備用； 按照步驟A~G的方法製備出生產飼用液體複合酶所需要的幾種單酶清液； 在去離子水中加入穩定劑、防腐劑，並調節pH至4.4~5.5，得到稀釋液； 將步驟H中沉降好的多種單酶清液和步驟I中製備的稀釋液進行均勻混合，單酶清液與稀釋液的混合比例根據實際酶活和酶種類的需要進行配比，至此，液體複合酶製備完成。
2.根據權利要求1所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟A或H中的單酶為非澱粉多糖單酶或植酸酶。
3.根據權利要求2所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟C中陶瓷膜的孔徑範圍為0.05~0.1 μ m。
4.根據權利要求2所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟D中有機膜截留小分子的分子量為8000~10000。
5.根據權利要求2所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟E中稀釋酶液的最終稀釋濃度為:纖維素酶3000~5000U/g，其他種類單酶的酶活為3~5萬U/g。
6.根據權利要求1所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟F中的沉降劑為十二水合硫酸鋁鉀、硫酸鋅，其添加量為重量比稀釋酶液:十二水合硫酸鋁鉀:硫酸鋅=100:0.5~0.6:0.3~0.5。
7.根據權利要求1所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟F中的穩定劑為山梨糖醇、葡萄糖、硫酸鎂和乙酸鈉，其添加量為重量比稀釋酶液:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸鎂:乙酸鈉=100:8~12:3~6:0.8~1.3:3~6。
8.根據權利要求1所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟F中的防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、卡松和氯化鈉，其添加量為重量比稀釋酶液:苯甲酸鈉:山梨酸鉀:卡松:氯化鈉=100:0.1~0.25:0.4~0.6:0.15-0.25:10~14。
9.根據權利要求1所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟I中的穩定劑為山梨糖醇、葡萄糖、硫酸鎂和乙酸鈉，其添加量為重量比去離子水:山梨糖醇:葡萄糖:硫酸鎂:乙酸鈉=100:8~12:3~6:0.8~1.3:3~6。
10.根據權利要求1~9所述的一種高穩定性飼用液體複合酶的製備方法，其特徵在於:所述步驟I中的防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、卡松和氯化鈉，其添加量為重量比去離子水:苯甲酸鈉:山梨酸鉀:卡松:氯化鈉=100:0.1~0.25:0.4~0.6:0.15~0.25:10~14。
【文檔編號】A23K1/165GK103898084SQ201410165030
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月23日 優先權日:2014年4月23日
【發明者】趙麗芳, 蘇俊兵, 蔡曉龍 申請人:北京昕大洋科技發展有限公司