珍珠質基質蛋白及其編碼基因與克隆方法和應用的製作方法
2023-05-05 02:16:06
專利名稱：珍珠質基質蛋白及其編碼基因與克隆方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種珍珠質基質蛋白與編碼基因及其克隆方法和應用。
一種珍珠質基質蛋白，具有序列表中序列2的胺基酸序列或將序列2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白質。
所述蛋白序列的碳端還連接有序列表中序列3的信號肽。
一種體外表達上述珍珠質基質蛋白的方法，包括以下步驟1)根據編碼權利要求1所述蛋白的基因序列的兩端設計引物，在引物的兩端分別加上BamHI和XhoI酶切位點；2)通過PCR方法在含有目的基因的克隆中擴增該基因，使產物兩端也加上酶切位點；3)利用設計的酶切位點將目的基因插入表達載體；4)轉化大腸桿菌；5)表達、分離、純化目的蛋白。
一種編碼珍珠質基質蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交的DNA序列。
其中，所說的嚴格條件是指在通常採用的雜交體系中，雜交溫度在42℃以上。
一種克隆上述珍珠質基質蛋白基因的方法，包括下述步驟
1)構建合浦珠母貝外套膜cDNA文庫；2)通過PCR方法利用簡併引物對cDNA文庫進行篩選；3)對所得到的陽性克隆進行序列分析；本發明分離、鑑定出的珍珠質基質蛋白的編碼基因及其編碼的珍珠質基質蛋白，可以廣泛應用於提高珍珠的產量與質量、珍珠的體外培養、珍珠質作為新型生物材料及製備醫用生物新材料的開發利用等領域。
在飽和碳酸鈣溶液中加入本發明珍珠質基質蛋白，可使碳酸鈣結晶形成有序的文石晶體，而不是天然條件下形成的方解石晶體。由於其獨特的晶體結構和機械強度，所形成的晶體可進一步開發成新型醫用生物材料。
與其它珍珠質基質蛋白配合使用，本發明珍珠質基質蛋白可使碳酸鈣在體外形成珍珠質樣晶體，使珍珠的工業生產成為可能。
隨著生物工程技術的發展，可通過控制本發明珍珠質基質蛋白編碼基因在珍珠貝體內的表達周期，人為控制珍珠形成的時期，從而提高珍珠質量與產量。
實施例2、序列表中的序列2在體外的表達本發明的第二個目的是提供一種體外表達珍珠質基質蛋白的方法，包括以下步驟1)根據編碼成熟蛋白的胺基酸序列的兩端設計引物，在引物的兩端分別加上BamHI和XhoI酶切位點；所設計引物的序列為上遊引物GCGGATCCGGCGGAGATGGTGAC；
下遊因物GCCTCGAGTTATTGCAAAAAAATGAATATC2)通過PCR方法在含有目的基因的克隆中擴增該基因，使產物兩端也加上酶切位點，其中，PCR的條件為50μl反應體系，加入含有目的基因的質粒1μl為模板，兩種引物各50pmol，95℃變性後加入2U Taq DNA聚合酶，95℃變性45sec，54℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環後於72℃延伸10min。
3)利用設計的酶切位點將目的基因插入pGEX-4T表達載體；6)轉化大腸桿菌；7)表達、分離目的蛋白；8)純化目的蛋白。
經分析證實得到的蛋白質為碳端連接有序列表中序列3信號肽的序列2蛋白質。
序列表16032101211362212DNA213合浦珠母貝(Pinctada fucata)2202234001gcacgaggca gataaaaggt cggtgcccaa ccacagtcat gaaacccttt gttacactcg 60caagcttgat cgtcttaatt gcctctgttt ctgccggcgg agatggtgac tatggcaaat 120acggcggtgt cagttacgga cctggcatca accttggagg tggtagtcta agtgccggag 180gaggtgttat cgggcttgga ggcgtcggag gtggtagtct aggtgccgga ggcgtcggcc 240cagttggtgg aattaccata tggactcacc ttttcacctg gatatacctt tttcatggat 300gtttgatatt catttttttg caataaatgg ccgggcacat acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360aa362210221176212PRT213合浦珠母貝(Pinctada fucata)2202234002gly gly asp gly asp tyr gly lys tyr gly gly val ser tyr gly1 5 10 15pro gly ile asn leu gly gly gly ser leu ser ala gly gly gly20 25 30val ile gly leu gly gly val gly gly gly ser leu gly ala gly35 40 45gly val gly pro val gly gly ile thr ile trp thr his leu phe50 55 60thr trp ile tyr leu phe his gly cys leu ile phe ile phe leu65 70 75gln76210321119212PRT213合浦珠母貝(Pinctada fucata)2202234003Met Lys Pro Phe Val Thr Leu Ala Ser Leu Ile Val Leu Ile Ala1 5 10 15Ser Val Ser Ala19
權利要求
1.一種珍珠質基質蛋白，具有序列表中序列2的胺基酸序列或將序列2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的珍珠質基質蛋白，其特徵在於所述蛋白具有序列表中序列2的胺基酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的珍珠質基質蛋白，其特徵在於所述蛋白序列的碳端還連接有序列表中序列3的信號肽。
4.一種體外表達權利要求1所述珍珠質基質蛋白的方法，包括以下步驟1)根據編碼權利要求1所述蛋白的基因序列的兩端設計引物，在引物的兩端分別加上BamHI和XhoI酶切位點；2)通過PCR方法在含有目的基因的克隆中擴增該基因，使產物兩端也加上酶切位點；3)利用設計的酶切位點將目的基因插入表達載體；4)轉化大腸桿菌；5)表達、分離、純化目的蛋白。
5.一種編碼珍珠質基質蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交的DNA序列。
6.根據權利要求5所述的編碼珍珠質基質蛋白的DNA序列，其特徵在於所述序列為序列表中的序列1。
7.一種克隆權利要求5所述基因的方法，包括下述步驟1)構建合浦珠母貝外套膜cDNA文庫；2)通過PCR方法利用簡併引物對cDNA文庫進行篩選；3)對所得到的陽性克隆進行序列分析；
8.權利要求1所述的蛋白質在提高珍珠質量與產量。
9.權利要求1所述的蛋白質在製備體外培養材料中的應用。
10.權利要求1所述的蛋白質在製備醫用生物新材料中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種珍珠質基質蛋白與編碼基因及其克隆方法和應用。一種珍珠質基質蛋白，具有序列表中序列2的胺基酸序列或將序列2的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有序列2蛋白活性的由序列2衍生的蛋白質。所述蛋白序列的碳端還連接有序列表中序列3的信號肽。一種編碼珍珠質基質蛋白的DNA序列，它具有下列序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交的DNA序列。本發明的珍珠質基質蛋白，可以廣泛應用於提高珍珠的產量與質量、珍珠的體外培養、珍珠質作為新型生物材料及製備醫用生物新材料的開發利用等領域。
文檔編號A61K38/17GK1456573SQ0211758
公開日2003年11月19日 申請日期2002年5月9日 優先權日2002年5月9日
發明者張榮慶, 張勇, 謝莉萍, 王洪鐘 申請人:清華大學