玻璃酸酶的仿生親和純化方法

2023-05-05 02:35:01

玻璃酸酶的仿生親和純化方法
【專利摘要】本發明涉及一種玻璃酸酶仿生親和純化方法，包括下列步驟：(1)基礎層析介質與三氯三氮嗪反應活化後，分別與2-氨基對苯二甲酸以及二鹽酸組胺反應，合成仿生親和分離材料；(2)用製備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶，將含有玻璃酸酶的樣品流過該親和層析柱，玻璃酸酶吸附在親和層析柱上，衝洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然後變換緩衝液條件，將結合的玻璃酸酶洗脫下來。本發明能夠高效率、低成本的大規模生產高酶活的玻璃酸酶。
【專利說明】玻璃酸酶的仿生親和純化方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥領域，具體涉及的是一種生物醫藥【技術領域】的純化方法。特別是一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法。

【背景技術】
[0002]玻璃酸酶(EC3.3.1.35)，又稱透明質酸酶，是一種鹼性糖蛋白，屬內切糖苷酶。能催化玻璃酸、硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C的β-N-乙醯氨基己糖糖苷鍵水解。它在哺乳動物的睪丸裡含量很豐富，能水解透明質酸，使其粘滯性明顯下降，有利於受精時精子進入卵子。也存在於精子、頜下腺、蜂毒、蛇毒、皮膚、脾臟、水蛭及細胞的溶酶體中。臨床用於局部注射，可加速皮下、肌內注射藥液的吸收，促進局麻藥的浸潤，促進手術及創傷後局部水腫或血腫的擴散，也用於腸粘連。我國1965年正式投入生產，從羊睪丸中提取，收入1977版中國藥典。
[0003]玻璃酸酶的穩定性較好，42°C加熱60min活力不損失；100°C加熱5min，活力可保留80%。受熱失活後進行冷卻可恢復部分活力。在pH5以下或pH8以上酶仍較穩定。在低濃度水溶液中輕易失活，但可加入0.2%或0.5%阿拉伯膠或0.2%明膠保護。
[0004]目前玻璃酸酶大多是從哺乳動物睪丸中提取的，通用工藝為睪丸絞成糜漿後，用冰醋酸溶液浸取，然後通過鹽析、吊濾得到粗製品，再經硫酸銨鹽析、透析、去熱源、乾燥等得到玻璃酸酶精品。該工藝步驟繁瑣，周期長，收率低，酶活不高。
[0005]經對現有技術文獻的檢索發現，從動物胰臟中製備玻璃酸酶的方法有多種，多為硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠層析、切向流超濾等，如中國專利103060291A—種玻璃酸酶的提取方法；中國專利103060288A —種從豬睪丸中提取玻璃酸酶的方法；中國專利102851265A一種牛睪丸製備玻璃酸酶的方法；由於採用多步提取純化，導致玻璃酸酶的回收率低，酶活性不高，周期長，尚未有專利報導採用仿生親和層析技術進行玻璃酸酶的純化，因此，有必要開發效率高、成本低、生產步驟更簡便的玻璃酸酶分離材料和和生產工藝。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在於克服現有技術的不足，提供一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法，使其克服玻璃酸酶大規模純化中的缺點，在大規模分離純化時步驟少、成本低、效率高，利用玻璃酸酶專一的親和配位體，可快速、簡便、低成本、大批量純化玻璃酸酶。
[0007]因此本發明的目的在於提供玻璃酸酶特異性的親和配基；
[0008]本發明的另一個目的在於建立玻璃酸酶層析純化方法，保證在大規模分離純化時，高效的提取玻璃酸酶。
[0009]本發明是通過以下技術方案實現的，本發明以基礎層析介質為原料製備仿生親和分離材料，用製備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶。
[0010]本發明包括以下步驟
[0011](I)在基礎層析介質上進行固相合成，製備仿生親和分離材料；
[0012]合成玻璃酸酶專一的親和分離材料，首先以帶氨基的基礎層析介質，或用常規化學方法對基礎層析介質進行衍生化，帶上氨基，與三氯三氮嗪反應活化，然後與2-氨基對苯二甲酸和二鹽酸組胺反應，合成親和分離材料。
[0013](2)用製備的仿生親和分離材料純化玻璃酸酶；
[0014]用上述合成的親和層析介質製備成親和層析柱，將睪丸提取液上清流過該親和層析柱，玻璃酸酶吸附在親和層析柱上，未結合的其它蛋白被洗去，改變換緩衝液條件將結合的玻璃酸酶洗脫下來，得到玻璃酸酶。
[0015]在步驟(I)中，基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N-亞甲基雙丙烯醯胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯醯胺/瓊脂糖複合物珠、纖維素珠和塗有化學活性基團的矽膠中的一種。
[0016]在步驟(2)中，親和介質吸附玻璃酸酶的條件為為PH6-7，離子強度為0.0-0.15M的緩衝液；洗脫條件為PH3，離子強度為0.1M的緩衝液。
[0017]所述的仿生親和分離材料，其結構是通過三氮嗪結構骨架作為間臂固定2-氨基對苯二甲酸及組胺基團。
[0018]所述的玻璃酸酶，其原料為哺乳動物睪丸。
[0019]本發明克服了玻璃酸酶生產技術中的缺點，使玻璃酸酶生產分離達到純化時步驟少，生產成本低，生產效率高的目的。利用玻璃酸酶專一的親和分離材料，可快速、簡便、低成本、大批量純化玻璃酸酶。玻璃酸酶回收率>10%，酶活高達1800U / mg。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:1_氨基-Sepharose-3-氨基對苯二甲酸-5-組胺-2,4,6-三氮嗪純化玻璃酸酶10% SDS-PAGE檢測結果

【具體實施方式】
[0021]下面結合具體實例做進一步的闡述:
[0022]實施例一
[0023]一分離材料製備
[0024]取NH2-Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗漆後，抽乾轉移至反應器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(I?5g)，用飽和NaHCO3調節反應系統的pH在6?7之間，反應3小時後取出，依次用3X 10倍體積的水/丙酮(O:1,1:3,1:1,3:1,1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3，5- _■氣 _2，4,6- 二氣嚷。
[0025]稱取2-氨基對苯二甲酸(3?1g)用去離子水溶解，與1-氨基-Sepharose-3,
5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調節pH在6?7之間，置於溫度50°C中攪拌反應24小時。反應結束後，依次用3倍體積的IM NaCl，10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1-氨基-S印harose-3-氨基對苯二甲酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20%乙醇儲存待用。
[0026]取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6_三氮嗪,然後稱取二鹽酸組胺(3?1g)，用二甲亞碸和去離子水混合溶解，將溶液的pH調至5?8左右，較佳的pH7，倒入反應器與1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6-三氮嗪混合,放於溫度為95°C的恆溫環境下反應60h。反應結束後，取出反應物，用4倍體積的NaCl，3倍體積二甲亞碸洗滌，然後用10倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20%乙醇儲存待用。
[0027]二用親和分離材料純化玻璃酸酶
[0028]將羊睪丸除內外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的鹽酸與醋酸混合酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結束後9800rpm，4°C離心lOmin，然後4°C靜置lh，過濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心後沉澱物中，加入一半體積的冷硫酸再提取一次，重複上述操作，合併兩次上清液。將1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，
6-三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩衝液(1mM,PH7)平衡後，把5mL上述上清液(調pH和電導率與磷酸鹽緩衝液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩衝液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質後，再用1mL甘氨酸緩衝液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測玻璃酸酶的純度，然後根據2010版《中華人民共和國藥典》第二部玻璃酸酶活性測定方法測定玻璃酸酶活性最高可達1800U /
mg ο
[0029]實驗結果及【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1說明，I =Marker從上之下分子量依次為116KD，66.2KD, 45KD, 35KD ；2:洗脫液(pH3，10mM Gly-HCl緩衝體系);3_7:流穿液(pH7，1mM PB緩衝體系)；8:羊睪丸提取液上清
[0031]實施例二
[0032]一分離材料製備
[0033]取NH2_Sepharose (50mL),依次用5倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸懼水充分洗漆後，抽乾轉移至反應器皿中，加入一定量的冰水，在冰水浴中攪拌下加入冷丙酮溶解的三氯三氮嗪(l_5g)，用飽和NaHCO3調節反應系統的pH在6?7之間，反應3小時後取出，依次用3X10倍體積的水/丙酮(O:1，1:3，1:1，3:1，1:0)洗滌，得到1-氨基-S印harose-3，5- _■氣 _2，4,6- 二氣嚷。
[0034]稱取2-氨基對苯二甲酸(3-10g)用去離子水溶解，與1-氨基-S印harose-3，5- 二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，用飽和NaHCO3調節pH在6?7之間，置於溫度50 V中攪拌反應24h。反應結束後，依次用3倍體積的IM NaCl, 10倍體積蒸餾水充分洗滌，得到1_氨基-S印harose-3-氨基對苯二甲酸_5_氯_2，4，6-三氮嗪，用20%乙醇儲存待用。
[0035]取1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4,6_三氮嗪,稱取稱取二鹽酸組胺(3 — 1g)，用二甲亞碸和去離子水混合溶解，將溶液的pH調至5?8左右，較佳的pH7，倒入反應器與1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸_5_氯-2,4, 6_三氮嗪混合,放於溫度為95°C的恆溫環境下反應60h。反應結束後，取出反應物，用4倍體積的NaCl，3體積二甲亞碸洗漆，然後用10倍體積的去離子水洗漆。得到1-氨基Sepharose-3-氨基苯二甲酸-5-組胺_2，4，6-三氮嗪親和分離材料，用20%乙醇儲存待用。
[0036]二用親和分離材料純化玻璃酸酶
[0037]將牛睪丸除內外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的鹽酸與醋酸混合酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結束後9800rpm，4°C離心lOmin，然後4°C靜置lh，過濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心後沉澱物中，加入一半體積的酸液再提取一次，重複上述操作，合併兩次上清液。將1-氨基S印harose-3-氨基苯二甲酸_5_組胺_2，4，6_三氮嗪親和分離材料(ImL),裝入層析柱(1*2.5cm)中。用1mL磷酸鹽緩衝液(10mM,pH7)平衡後，把5mL上述上清液(調pH和電導率與磷酸鹽緩衝液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩衝液(10mM，pH7)洗去未吸附的物質後，再用1mL甘氨酸緩衝液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測玻璃酸酶的純度，然後根據2010版《中華人民共和國藥典》第二部玻璃酸酶活性測定方法測定玻璃酸酶活性最高可達1000U / mg。
[0038]實施例三
[0039]將羊睪丸除內外皮層及副睪丸，絞碎成勻漿狀，按固液比1:1的比例加入冷凍的酸液，4°C攪拌提取4h。浸取結束後9800rpm，4°C離心lOmin，然後4°C靜置lh，過濾除脂；得睪丸提取液上清液。離心後沉澱物中，加入一半體積的冷酸液再提取一次，重複上述操作，合併兩次上清液。將1-氨基3印1^1'0%-3-氨基苯二甲酸-5-組胺-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(ImL)，裝入層析柱(1*2.5em)中。用1mL磷酸鹽緩衝液(10mM，pH6)平衡後，把5mL上述上清液(調pH和電導率與磷酸鹽緩衝液相同)加到柱上。用1mL磷酸鹽緩衝液(10mM，pH6)洗去未吸附的物質後，再用1mL甘氨酸緩衝液(0.1M，pH3)洗脫，收集洗脫組分。用10%的變性還原SDS-PAGE檢測玻璃酸酶的純度，然後根據2010版《中華人民共和國藥典》第二部玻璃酸酶活性測定方法測定玻璃酸酶活性為1000U / mg。
【權利要求】
1.一種玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特徵在於，包括下列步驟: 1)仿生親和分離材料結構是在基礎層析介質上通過三氮嗪骨架作為間臂固定2-氨基對苯二甲酸及二鹽酸組胺； 2)用製備的仿生親和分離材料純化睪丸提取液上清。
2.根據權利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特徵是，步驟(1)中，基礎層析介質是葡聚糖凝膠、交聯的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和I V -亞甲基雙丙烯醯胺的交聯共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯共聚物、聚丙烯醯胺/瓊脂糖複合物珠、纖維素珠和塗有化學活性基團的矽膠中的一種。
3.根據權利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特徵是，在步驟(2)中，親和介質吸附玻璃酸酶的條件為邱6—7，離子強度為0.0-0.15的緩衝液；洗脫條件為邱3—4，離子強度為0.1I的緩衝液。
4.根據權利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特徵是，所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有氨基對苯二甲酸的結構。
5.根據權利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特徵是所述的仿生親和分離材料，其合成的配體中含有三氮嗪；其合成的配體中含有組胺的結構。
6.根據權利要求1所述的玻璃酸酶的仿生親和純化方法，其特徵是，所述的玻璃酸酶，其原料來源為哺乳動物睪丸。
【文檔編號】C12N9/26GK104419689SQ201310369641
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】李榮秀, 馬貴軍, 翟東改, 陽成成 申請人:上海亨臻實業有限公司