發酵生產l-乳酸的方法及該方法所用的菌株的製作方法

2023-05-05 05:16:31 1

專利名稱：發酵生產l-乳酸的方法及該方法所用的菌株的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，具體涉及發酵生產L-乳酸的菌株和發酵生產L-乳 酸的方法。
背景技術：
乳酸(α-羥基-丙酸)廣泛存在於人體、動物及微生物代謝之中，也存在於與人 們生活密切相關的多種食品中。乳酸可用於食品、飲料、醫藥塑料、飼料、農藥、日用化工、造 紙及電子工業等領域。在食品、飲料工業上，乳酸用作酸味劑、強化劑、防腐劑，是絕對安全 的添加劑。乳酸衍生物，如乳酸鈣、乳酸鋅、乳酸亞鐵是食品、飲料、保健品的強化劑，乳酸類 乳酸乙酯是多種名酒的主香成分。在醫藥工業中，乳酸及其衍生物(如乳酸鈉)可與氯化 鈉、胺基酸等配伍，生產治療高鉀血症或酸中毒的大輸液，乳酸還被用於羅弗沙星等藥物的 生產。乳酸酯又是良好的有機溶劑，可用於生產醇酸樹脂、油墨和塗料等化工產品。近年來， 國際上以L-乳酸開發的聚乳酸PLA是一種新型聚酯材料，其能勝任其他合成塑料的用途， 而且具有良好的生物可降解性。比起石油化學合成樹脂，其具有獨特優異的性能。目前世界乳酸生產大部分採用發酵法生產，而應用發酵法生產乳酸常用的微生物 僅有兩大類，一類為細菌，多採用乳酸菌(Lactic acid bacteria)；另一類為黴菌，多採用 根黴(Rhizopus)。我國的乳酸發酵工業經過了幾十年的發展，工藝上多數採用米根黴發酵 大米糖化液進行生產。根黴是好氧真菌，營養要求簡單，可以直接以澱粉為碳源，理論轉化 率為75%。由於生產設備簡陋，發酵工藝粗放，電耗、水耗和能耗均較高，而且發酵的轉化率 偏低，成本難以同國外進口的同類產品競爭。特別是近年來，隨著國內糧食和煤炭等重要工 業原料價格的大幅度上漲，乳酸行業的成本也隨之上升，使許多乳酸企業的生產難以為繼。近年來，採用細菌發酵生產乳酸技術受到重視。常用的菌種有德氏乳桿菌和鼠李 糖乳桿菌。乳酸菌屬於化能異養型微生物，可以在兼性厭氧條件下發酵，設備投資和動力 消耗顯著降低。乳酸發酵的理論轉化率可達100%。一般乳酸細菌最適發酵溫度在37 420C，提高發酵溫度後，其產量會大幅度減少。在乳酸生產中，提高乳酸菌的發酵溫度可以 大大減少工廠生產中冷卻水的消耗，降低發酵成本；同時，提高發酵溫度可以減少雜菌汙染 的機會，提高乳酸的純度，減少倒罐機率等，所以如何改良細菌的高溫耐受性逐漸引起了許 多國內外研究者的關注。另外，乳酸發酵生產中，高濃度的葡萄糖和乳酸對乳酸菌的生長和乳酸合成都有 強烈的抑制作用，是影響乳酸發酵單位產量的技術瓶頸。如果能通過菌種的選育，實現高葡 萄糖濃度、高乳酸濃度的發酵，就可以提高乳酸發酵的強度，達到提高乳酸生產率的目的。全局轉錄機制工禾呈(Global transcription machinery engineering，gTME)技術 是通過基因工程方法改造全局轉錄調控因子使整個轉錄調控過程發生變化從而改變或提 高目標基因的轉錄及表達。此項技術近年來在細胞代謝工程方面已得到成功應用。其中， Hal Alper等在2006年就採用突變TATA結合蛋白的方法在真核生物中篩選到耐受高乙醇 和葡萄糖濃度的菌株。隨後的2007年Hal Alper又採用gTME技術突變編碼σ 7°的rpoD基因，轉化大腸桿菌後篩選得到耐受高乙醇、高代謝通量、多樣化細胞表型的菌株。另外，劉 紅梅等利用全局轉錄工程(gTME)方法將全局轉錄因子sptl5隨機突變並克隆表達，構建突 變庫。最終篩選得到能夠很好的利用木糖並共發酵木糖和葡萄糖的菌株。因此，gTME技術 可以在微生物代謝途徑的基因組層面上定向進化或同時改變多個相關基因群，使細胞在整 體水平上適應某些物質的代謝或利用。

發明內容
本發明的目的是提供一種發酵生產L-乳酸的方法，使其具有高產L-乳酸的特點。本發明還提供一種L-乳酸發酵生產菌，使其具有耐高溫高糖和高產的特點。本發明還提供這種耐高溫高糖的高產L-乳酸生產菌的構建方法。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種發酵生產L-乳酸的方法，是在培養基中通過微生物發酵來 生產L-乳酸，所述的微生物是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094，所述的培養基為含高糖的培養基，該含高糖的培養基的成分為葡萄糖 100-150g/L、酵母粉5-20g/L。本發明發酵生產L-乳酸方法的發酵過程是在50°C _55°C之 間進行。本發明提供的通過鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCCN0 M2010094發酵來生產L-乳酸的具體方法包括以下步驟a.活化菌株配製MRS培養基，調節MRS培養基pH值為6. 0-7.0，於121°C滅菌 30min ；將保存的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094 菌株 接種至IOOmL的MRS培養基，於42°C、150rpm搖床中培養過夜，得到活化菌株；b.種子製備將活化菌株按5-10% (ν/ν)接種量接種於MRS培養基中，將其置於 42°C、150rpm搖床中培養16h，完成種子製備；c.發酵配製高糖發酵培養基，將配製好的高糖發酵培養基於121°C滅菌30min 後冷卻到50-55°C ；再將製備好的種子按5-10% (ν/ν)接種量接種於高糖發酵培養基，於 500C _55°C攪拌轉速IOOrpm下發酵，發酵過程中以6mol/L的NaOH作為中和劑將發酵液中 PH控制在5. 5-6. 5之間；d.補料在發酵24h後，不斷補充葡萄糖使發酵體系中的糖含量維持在100_150g/ L,持續補糖24h，然後停止補糖，繼續發酵24至30h至殘糖降低到lg/L以下後停止發酵，得 L-乳酸。在本發明一個實施例中，MRS培養基的組織成分是蛋白腖10g/L，牛肉膏IOg/ L,酵母粉5g/L，K2HP04 2g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5g/L，葡萄糖20g/L,吐溫801mL, MgS04 ·7Η20 0. 58g/L，MnS04. 4H20 0. 25g/L ；調節 MRS 培養基 pH值的具體方法是以 6mol/ L的NaOH調MRS培養基pH值至pH6. 8。本發明提供的發酵生產L-乳酸的方法，乳酸終產量達到220g/L，轉化率達到 90%。本發明提供的L-乳酸發酵生產菌，是通過利用全局轉錄工程(gTME)方法將細菌 RNA聚合酶的σ因子隨機突變，構建突變庫，將突變基因連接到表達載體pBBRlMCS-5上，轉 化鼠李糖乳桿菌中表達，經培養基初篩獲得的耐高溫、高糖和高乳酸濃度的高產L-乳酸重組菌株。該菌株已經於2010年4月20日保藏於中國典型培養物保藏中心(中國，武漢)， 保藏號為 CCTCC NO :M2010094，名稱為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) HR03。本發明所提供的L-乳酸發酵生產菌的構建方法，包括以下步驟(1) σ因子的編碼序列的擴增根據genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，設計一對引物，以Lactobacillus rhamnosus總DNA為模板，PCR擴增得到σ 因子的編碼序列。(2) σ因子上遊控制序列的擴增根據genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，設計一對引物，以Lactobacillus rhamnosus總DNA為模板，PCR擴增得到σ 因子上遊控制序列。(3) ο因子完整的表達序列的構建根據σ因子編碼序列和其上遊控制序列，設計一對融合引物，以上述步驟(1)和 (2)獲得的片段為模板，進行融合PCR，得到σ因子和其上遊控制序列的融合基因片段，然 後將此融合基因連接到PGEM-T載體上進行保存和測序。(4) σ因子表達序列中隨機突變的引入根據σ因子編碼序列和其上遊控制序列，設計一對帶酶切位點的引物，以融合基 因為模板，進行易錯PCR擴增。(5) σ因子表達載體的構建將易錯PCR產物回收後和載體pBBRlMCS-5同時進行雙酶切，然後用T4連接酶 將雙酶切後的融合基因和PBBR1MCS-5載體連接。將隨機突變的σ因子表達序列插入 pBBRlMCS-5載體的多克隆位點，構成σ因子表達載體。(6) σ因子表達載體導入鼠李糖乳桿菌將正常的乳酸桿菌接種至MRS液體培養基中靜置培養12小時後，向其中加入氨苄 青黴素，靜置培養3小時後。將上述培養液離心後棄上清。將上述乳酸桿菌細胞沉澱用PEB 溶液清洗，重複兩次。最後用預冷的PEB溶液和50%的甘油混勻後分裝，即得到乳酸桿菌的 感受態細胞液。將連接產物加入乳酸桿菌的感受態細胞溶液中，轉移到電極杯中冰浴後進 行電轉化。然後用高滲MRS培養基恆溫培養5個小時。然後吸取培養液塗布到含慶大黴素 的固體培養基上培養，篩選轉化子。(7)耐高溫、高糖的高產乳酸菌的篩選將轉化子分別劃線至葡萄糖濃度為150 200g/L、乳酸濃度為50 100g/L的培 養基上，培養基中均加入65ug/ml的慶大黴素。放置42°C進行篩選轉化陽性菌株。再劃線 至高糖平板上50°C-55°C，進行再篩選。將篩選得到的轉化子提取質粒。用限制性內切酶進 行雙酶切驗證，再以經過酶切驗證後的質粒為模板，以F-BamHLR-HindIII為引物進行PCR 驗證。


圖1為σ因子的編碼序列的PCR電泳圖。圖2為σ因子上遊控制序列的PCR電泳圖。
圖3為σ因子的編碼序列和σ因子上遊控制序列的融合PCR電泳圖。圖4為融合PCR產物連接PGEM-T載體轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞後PCR驗 證。圖5為σ因子表達序列易錯PCR電泳6為σ因子表達序列易錯PCR產物BamHI、HindIII雙酶切電泳圖。圖7為載體PBBR1MCS-5經BamHI、HindIII雙酶切後電泳圖。圖8為在高糖、高乳酸、含慶大黴素的MRS固體平板上，55°C高溫篩選得到的轉化 子圖。以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述。
具體實施例方式實施例1(1) σ因子的編碼序列的擴增；根據genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，利用OLIGO 6. 0引物設計軟體設計如下一對引物LRsigma-up :5， -ATGGCTGATAAAAAAACAGCAAC-3，LRsigma-down :5』 -TTATTCAAGAAAATCCTTAAGCTGC-3』在50 μ L的反應體系中，上述兩條引物的濃度均為^!!!(^/^!^(!^？各？。 !^^/ μ L ；Mg2+15pmol/y L ；Lactobacillus rhamnosus 基因組 DNA 模板 IOpmol ；Pfu DNA 聚合 酶 2. 5U。PCR 擴增條件為95°C 5min ;94°C lmin，57°C lmin，72 °C 2min，進行 30 個循環； 72°C IOmin。將PCR產物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三 版，2002年版)，結果顯示得到一條約1251bp的特異片段，與預期擴增的目的片段大小吻 合。PCR產物的回收採用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能博彩 生物技術科技有限公司)。回收後的片段-20°C保存備用。(2) σ因子上遊控制序列的擴增；根據genbank公布的鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus HN001contig00032 基因組序列，設計如下一對引物Psigma-up :5， -ACTTGCTTTTCTTGATTCATCAGGCT-3，Psigma-down :5』 -TCCGGCGATATCAGCTCACT-3』在50 μ L的反應體系中，上述兩條引物的濃度均為^!!!(^/^!^(!^？各？。 !^^/ μ L ；Mg2+15pmol/y L ；Lactobacillus rhamnosus 基因組 DNA 模板 IOpmol ；Pfu DNA 聚合 酶 2. 5U。PCR 擴增條件為95°C 5min ;94°C lmin, 52 °C lmin, 72 °C lmin，進行 30 個循環； 72°C IOmin。將PCR產物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三 版，2002年版)，結果顯示得到一條約185bp的特異片段，與預期擴增的目的片段大小吻合。 PCR產物的回收採用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能博彩生物 技術科技有限公司)。回收後的片段-20°C保存備用。(3) σ因子完整的表達序列的構建；
根據σ因子編碼序列和其上遊控制序列，設計一對融合引物如下Psigma-RH :5 』 -GTTGCTGTTTTTTTATCAGCCATTCCGGCGATATCAGCTCACT-3 』 LRs i gma-RH 5』 -AGTGAGCTGATATCGCCGGAATGGCTGATAAAAAAACAGC AAC-3』以上述步驟(1)獲得的片段為模板，以LRsigma-RH和LRsigma-down為引物進行 PCR得到sigma factor的中間融合基因片段，記為LRsigma-RH_M。在50 μ L反應體系中上 述兩條引物的濃度均為lpmol/μ L ；dNTP 20pmol/yL ；Mg2+15pmol/μ L ；步驟(1)獲得的片 段為模板 IOpmol ；Pfu DNA聚合酶 2. 5U。PCR擴增條件為:95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin, 72°C 2min，進行 30 個循環；72°C IOmin0以上述步驟⑵獲得的片段為模板，以Psigma-up和Psigma-RH為引物進行PCR 得到sigma factor promoter的中間融合基因片段，記為Psigma-RH-M。在50 μ L反應體 系中上述兩條引物的濃度均為lpmol/μ L ；dNTP各20ρπιο1/μ L ；Mg2+15pmol/μ L ；步驟(2) 獲得的片段為模板IOpmol ；Pfu DNA聚合酶2. 5U。PCR擴增條件為95°C 5min ；94°C lmin, 53°C lmin，72°C lmin，進行 30 個循環；72°C IOmin0在不添加引物的情況下先以Psigma-RH、LRsigma-RH互為引物進行預PCR得到中 間產物。在50 μ L反應體系中:LRsigma-RH-M和Psigma-RH-M的濃度均為IOpmol ；dNTP 20pmol/y L ；Mg2+15pmol/μ L ；Pfu DNA聚合酶2. 5U。PCR擴增條件為94°C lmin，58°C lmin, 72 °C 5min.共15個循環。以此中間產物為模板，採用如下程序PCR程序進行進一步的融合PCR得到融合基 因。在50 μ L反應體系中引物Psig-UP和LRsigma-down的濃度均為lpmol/μ L ;dNTP 20pmol/y L ；Mg2+15pmol/μ L ；中間產物的片段為模板10 μ L ；Taq DNA聚合酶5U。PCR擴增 條件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C 2min，進行 30 個循環；72°C IOmin0然後將此融合基因連接到pGEM-T載體上進行保存和測序。連接體系如下PCR 產物 IOyLpGEM-T0. 5 μ LT4Buffer 7 μ LT4Ligase 0. 5 μ L4°C過夜連接反應，反應結束後65°C保溫10分鐘，以滅活T4連接酶。將連接產物轉化DH5ci感受態細胞，37°C，150轉搖床上溫育培養1小時，然後取 100 μ L溫育液塗布含20ug/ml氨苄青黴素的LB平板上，14小時候可得到陽性克隆。挑取 陽性克隆到含有100ug/ml氨苄青黴素的1. 5ml離心管中37°C，150轉培養約7小時，管中 可見菌體，取菌液進行菌液PCR程序鑑定陽性克隆。在50yL反應體系中引物Psig-up和 LRsigma-down 濃度均為 lpmol/μ L ；dNTP 20pmol/ μ L ；Mg2+15pmol/ μ L ；1 μ L 菌液為模板； Pfu DNA 聚合酶 2. 5U。PCR 擴增條件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin, 72°C 2min，進行 30個循環；72°C IOmin0結果顯示陽性轉化子為100%。將菌液PCR驗證的陽性轉化子繼續培養至OD值約為1. 2，將該菌液送到上海桑尼 生物科技有限公司進行測序。該編碼序列具有如序列表SEQ ID No. 1所示的序列，與報導 的σ因子的編碼序列的一致性大於99%。(4) σ因子表達序列中隨機突變的引入；根據σ因子編碼序列和其上遊控制序列，設計一對帶酶切位點的引物如下
F-BamHI :5，GGCGGATCCACTTGCTTTTCTTGATTCAT 3，R-HindIII :5，CAGAAGCTTTTATTCAAGAAAATCCTT3』採用易錯PCR試劑盒(購自吉林藍罡生物科技有限公司)引入突變。在50yL的 反應體系中，上述兩條引物的濃度均為lpmol/μ L ;ER dNTP 20pmol/y L ； 10XERBufferl 10μ L ；IOXER Buffer2 10 μ L ；融合基因為模板 IOpmol/μ L ;Taq DNA 聚合酶 5U。PCR 擴 增條件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C lmin，進行 35 個循環；72°C IOmin0將PCR產物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三 版，2002年版)，結果顯示得到一條約1454bp的特異片段，與預期擴增的目的片段大小吻 合。PCR產物的回收採用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能博彩 生物技術科技有限公司)。(5) σ因子表達載體的構建；將易錯PCR產物回收後和載體pBBRlMCS-5同時進行雙酶切，根據易錯PCR擴增基 因所用的引物兩端的酶切位點為BamHI、HindIII，該PCR用限制性內切酶BamHI、HindIII 進行酶切，產生粘性末端的DNA片段，為下一步的互補粘性末端連接做準備，具體步驟
PCR產物酶切反應體系(50 μ L) PCR回收產物 25 μ L BamHI0. 6 μ L
HindIII1. 2μ L
Buffer BamHI 5 μ L H2O18. 2 μ L
載體pBBRlMCS-5酶切反應體系(50 μ L) pBBRlMCS-5 25 μ L
0.6μ L
1.2μ L 5 μ L
_18. 2μ L
37°C反應過夜。酶切後的DNA溶液於65°C保溫20分鐘，使內切酶BamHI、HindIII 失活。酶切產物的回收採用3s柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒(購自上海申能 博彩生物技術科技有限公司)。 然後用T4連接酶將雙酶切後的融合基因和pBBRlMCS-5載體連接，將隨機突變的 σ因子表達序列插入pBBRlMCS-5載體的多克隆位點，構成σ因子表達載體。具體步驟 經過相同雙酶切並且純化的PCR產物和載體pBBRlMCS-5的酶連接體系為(12 μ L)
BamHI HindIII Buffer BamHI H9O
PCR產物 pBBRlMCS-5 載體 PEG4000
T4Ligase Buffer T4Ligase
5. 5 μ L 2μ L,
0.8μ L
1.2μ L, 0· 5 μ L0
16°C過夜連接反應，反應結束後65°C保溫10分鐘，以滅活T4DNA連接酶c (6) σ因子表達載體導入鼠李糖乳桿菌；
8
將正常的乳酸桿菌稀釋後塗布MRS固體培養基，24小時後挑取單菌落到20mlMRS 液體培養基中培養20小時。按照2%的比例取菌液接種到IOOmlMRS液體培養基中靜置 培養12小時，向其中加入終濃度為25ug/ml的氨苄青黴素，繼續靜置培養3小時至OD值 =0. 5-0. 8。將上述培養液分裝至50ml離心管中，4°C，7000轉/分鐘離心10分鐘，棄上 清。將上述乳酸桿菌細胞沉澱每管用0. 5ml的4°C預冷的PEB溶液(蔗糖272mmol/L、 MgCl2O. 5mmol/L、KH2PO4O. 5mmol/L)清洗，在4°C，6500轉/分鐘離心5分鐘，重複兩次。最 後每管用Iml預冷的PEB溶液，2ml 50%的甘油混勻後60 μ L/管進行分裝，即得到乳酸杆 菌的感受態細胞液，_80°C保存備用。將連接產物加入乳酸桿菌的感受態細胞溶液中，冰浴10分鐘。再轉移到預冷的電 極杯中，冰浴2分鐘。將電極杯置於電轉化儀(Eppendorf AG22331N0. 430830095)中，採 用2000V電壓電擊乳酸桿菌細胞溶液，時間為4ms。然後向上述電極杯中加入Iml 4°C預冷 的高滲MRS培養基。混勻後轉移到離心管中37°C的恆溫培養箱中培養5小時。然後，4°C、 1000轉離心30秒，去除部分上清，後吸取100 μ L的培養液到含65ug/ml的慶大黴素固體培 養基上塗布均勻後，42°C培養24小時篩選轉化子。(7)耐高溫、高糖的高產乳酸菌的篩選用牙籤挑取篩選得到的轉化子分別劃線至葡萄糖濃度為180g/L、乳酸濃度為 90g/L的培養基上，培養基中均加入65ug/ml的慶大黴素。放置42°C進行篩選。將篩選到 的菌株再劃線至高糖平板上50°C _55°C，進行再篩選。將篩選得到的轉化子採用AxyPr印 質粒小量試劑盒(購自愛思進生物技術有限公司)小量提取質粒。用限制性內切酶BamHI、 HindIII進行雙酶切驗證，再以經過酶切驗證後的質粒為模板，以F-BamHI、R-HindIII為 引物進行PCR驗證，在50 μ L反應體系中引物F-BamHI、R-HindIII濃度均為lpmol/ μ L ； dNTP 各 20pmol/ μ L ；Mg2+15pmol/μ L ；質粒 DNA 為模板；Pfu DNA 聚合酶 2. 5U。PCR 擴增條 件為95°C 5min ；94°C lmin，58°C lmin，72°C 2min，進行 30 個循環；72°C IOmin0 將 PCR 產 物用0.9%的瓊脂糖凝膠電泳(J.薩姆布魯克，分子克隆實驗指南第三版，2002年版)，結果 顯示得到一條約1454bp的特異片段，與預期擴增的目的片段大小吻合。說明已經成功獲得 含有重組表達質粒的工程菌。實施例2本發明耐高溫、高糖的高產乳酸菌株的乳酸發酵a.活化菌株配製MRS培養基，MRS培養基的組織成分是蛋白腖10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母粉5g/L，K2HP042g/L,檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉5g/L，葡萄糖20g/L，吐溫801mL， MgS04 · 7H20 0. 58g/L, MnS04. 4H20 0. 25g/L ；以 6mol/L 的 NaOH 調 MRS 培養基 pH 值至 pH6. 8，於 121°C 滅菌 30min ；將保存的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCC NO :M2010094菌株接種至IOOmL的MRS培養基，於42°C、150rpm搖床中培養過夜，得 到活化菌株；b.種子製備將活化菌株按5-10% (ν/ν)接種量接種於MRS培養基中，將其置於 42°C、150rpm搖床中培養16h，完成種子製備；c.發酵配製發酵培養基，將配製好的發酵培養基於121°C滅菌30min後冷卻到 50-550C ；再將製備好的種子按5-10% (ν/ν)接種量接種於發酵培養基，於50°C _55°C攪 拌轉速IOOrpm下發酵，發酵過程中以6mol/L的NaOH作為中和劑將發酵液中pH控制在 5. 5-6. 5 之間；頁 d.補料在發酵24h後，不斷補充葡萄糖使發酵體系中的糖含量維持在100-150g/ L,持續補糖24h,然後停止補糖，繼續發酵24至30h至殘糖降低到lg/L以下後停止發酵，得 L-乳酸。測定L-乳酸產量。乳酸終產量達到220g/L，轉化率達到90%。
權利要求
一種發酵生產L-乳酸的方法，該方法是在培養基中通過微生物發酵來生產L-乳酸，其特徵在於，所述的微生物是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCCNOM2010094。
2.根據權利要求1所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，所述的培養基為含高 糖的培養基。
3.根據權利要求2所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，所述的含高糖的培養 基的成分為葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。
4.根據權利要求1所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，所述的發酵過程在 50 0C -55 °C之間進行。
5.根據權利要求1所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，通過鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094 發酵來生產 L-乳酸具體方法包括以 下步驟a.活化菌株配製MRS培養基，調節MRS培養基pH值為6.0-7.0，於121 °C滅菌30min ； 將保存的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NO :M2010094菌株接種至 IOOmL的MRS培養基，於42°C、150rpm搖床中培養過夜，得到活化菌株；b.種子製備將活化菌株按5-10%(ν/ν)接種量接種於MRS培養基中，將其置於42°C、 150rpm搖床中培養16h，完成種子製備；c.發酵配製發酵培養基，將配製好的發酵培養基於121°C滅菌30min後冷卻到 50-550C ；再將製備好的種子按5-10% (ν/ν)接種量接種於發酵培養基，於50°C _55°C攪 拌轉速IOOrpm下發酵，發酵過程中以6mol/L的NaOH作為中和劑將發酵液中pH控制在 5. 5-6. 5 之間；d.補料在發酵24h後，不斷補充葡萄糖使發酵體系中的糖含量維持在100-150g/L， 持續補糖24h，然後停止補糖，繼續發酵24至30h至殘糖降低到lg/L以下後停止發酵，得 L-乳酸。
6.一種L-乳酸發酵生產菌，其特徵在於，該菌是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03 CCTCC NO :M2010094。
7.根據權利要求5所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，所述的MRS培養基的 組織成分是蛋白腖10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，K2HP042g/L，檸檬酸銨2g/L，乙酸鈉 5g/L,葡萄糖 20g/L，吐溫 801mL, MgSO4 · 7H20 0. 58g/L, MnSO4. 4H20 0. 25g/L。
8.根據權利要求5所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，步驟a中調節MRS培 養基PH值的具體方法是以6mol/L的NaOH調MRS培養基pH值至pH6. 8。
9.根據權利要求5所述的發酵生產L-乳酸的方法，其特徵在於，所述的發酵培養基的 成分為葡萄糖100-150g/L、酵母粉5-20g/L。全文摘要
本發明提供了一種L-乳酸發酵生產菌和通過該生產菌發酵生產L-乳酸的方法，本發明提供的L-乳酸發酵生產菌是鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)HR03CCTCC NOM2010094，具有耐高溫高糖的特性，可以大幅度提高L-乳酸的產量。
文檔編號C12P7/56GK101880696SQ20101022649
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月14日 優先權日2010年7月14日
發明者餘龍江, 盧正東, 張力, 曾翔, 魯明波 申請人:華中科技大學