提高葡糖澱粉酶pH最適點、底物專一性和熱穩定性的蛋白質工程方法

2023-05-04 22:58:46 3

專利名稱：：提高葡糖澱粉酶pH最適點、底物專一性和熱穩定性的蛋白質工程方法
技術領域：
：本發明領域涉及產生真菌葡糖澱粉酶突變的方法，使葡糖澱粉酶能更好地選擇性產生葡萄糖而不是α-1,6鍵合的雙糖異麥芽糖，使葡糖澱粉酶熱穩定性更好，pH最適點增高，並且比野生型酶產生的葡萄糖量更多。
背景技術：
：葡糖澱粉酶(EC3.2.1.3)是一種糖酶。發現於1951年，是一種外水解酶，它從麥芽寡糖的非還原性末端上切下D-葡萄糖，攻擊α-(1,4)-糖苷鍵，還以非常慢的速度攻擊α-(1,6)-糖苷鍵。它是切割具有α或β構型的O-糖苷鍵的一百多種糖酶(EC.3.2.1)中的一種。這些酶在功能和結構上的關係表現為在葡糖澱粉酶和幾種α-澱粉酶、α-葡糖苷酶和轉葡聚糖基酶(transglucanosylase)之間至少存在三個序列同源的不連續區[Svensson,1988]，並有攻擊不溶性底物的糖酶的類似功能域結構[Knowles等，1987；Svensson等，1989]。泡盛麴黴(Aspergillusawamori)葡糖澱粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶；EC3.2.1.3)是最重要的葡糖澱粉酶中的一種。葡糖澱粉酶在工業上主要用於加工生產高果糖穀物增甜劑，該加工方法包括1)用α澱粉酶將澱粉水解成中等長度的麥芽糖寡糖(糊精)；2)用葡糖澱粉酶將糊精水解成葡萄糖；以及3)用葡萄糖異構酶將葡萄糖轉變成果糖。穀物增甜劑佔領了美國增甜劑50％以上的市場，而用於製備該增甜劑的三種酶位列產量最高酶之中。另外葡糖澱粉酶生產的葡萄糖可結晶或用於發酵生產有機產品(如檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸、穀氨酸或飲料和燃料用的乙醇)。整個美國穀物產量中約有12％的穀物是用葡糖澱粉酶加工的。雖然葡糖澱粉酶已經成功地使用多年，但是如果它能夠生產更多的葡萄糖而不是雙糖，如果它更穩定，如果它能和葡萄糖異構酶一起在同一容器中使用的話，那麼它將是更具吸引力的產品。葡糖澱粉酶並不能從糊精生成100％葡萄糖，因為它產生了各種雙糖和三糖，尤其是異麥芽糖和異麥芽三糖[Nikolov等，1989]。在高底物濃度時形成這些產生，是由於葡糖澱粉酶能夠形成α-(1,6)-糖苷鍵。葡糖澱粉酶並不象α-澱粉酶或是葡萄糖異構酶那樣穩定。GA的最適pH(pH4-4.5)低於α-澱粉酶(pH5.5-6.5)和葡萄糖異構酶(pH7-8)的最適pH。因此，葡糖澱粉酶的水解反應必須與其它酶反應分開進行，在不同的容器中、較低的溫度下進行，這使得生產成本較高。絲狀真菌黑麴黴(Aspergillusniger)的葡糖澱粉酶是應用最廣的葡糖澱粉酶，它的生化性質已經經過深入地分析。發現這種酶主要有兩種形式GAⅠ(616個胺基酸(以下稱為AA))和GAⅡ(512AA)。它們之間的不同之處在於GAⅠ中有吸附天然澱粉顆粒所需的104個胺基酸的C端結構域[Svensson等，1982；Svensson等，1989]。兩種形式均有催化性結構域(AA1-440)，其後是富含Ser/Thr、高度O-糖基化區域(AA441-512)[Gunnarsson等，1984]。催化區的前30個殘基包括在該酶的三維結構中[Aleshin等，1994；1996；Stoffer等，1995]；它們象帶子那樣卷繞催化結構域。與形成底物結合位點環狀結構相對應的催化性結構域的四個不同區域中，在各種真菌葡糖澱粉酶中有著同源性很強的胺基酸序列[Itoh等，1987]。在黑麴黴葡糖澱粉酶中，這些區域是AA35-59、AA104-134、AA162-196和AA300-320。第二和第三區域部分或完全地覆蓋了與α-澱粉酶同源的三個區域(Svensson,1988)。另外，其粗製澱粉結合結構域(AA512-616)與幾種澱粉降解酶的相似結構域有很高的同源性[Svensson等，1989]。動力學分析表明，底物結合位點由多達7個亞位點組成[Savel′ev等，1982]，在亞位點1和2之間發生水解。水解的pKa為2.75和5.55[Savel′ev和Firsov,1982]，提示亞位點1和2處的羧酸殘基提供了水解的催化性酸和鹼。化學修飾試驗顯示，三個高度保守的殘基Asp176、Glu179和Glu180被保護起來，它們在活性位點內，這提示它們中的一個或多個可能是催化性殘基[Svensson等，1990]。化學修飾試驗也表明，高度保守的殘基Trp120是必需的，它位於亞位點4內[Clarke和svensson,1984].Trp120與米曲酶(Aspergillusoyzae)α-澱粉酶的Trp83同源[Clarke和Svensson,1984],Trp83也位於該酶的活性位點中[Matsuura等，1984]。定點誘變研究表明Glu179是催化性酸殘基，而Glu400是催化性鹼殘基[Frandse等，1994；Harris等，1993；Sierks等，1990]。已經對黑麴黴[Svensson等，1983；Boel等，1984]和泡盛麴黴[Nunberg等，1984]的葡糖澱粉酶進行了克隆和測序，它們有相同的一級結構。Innis等和最近Cole等已經開發了用於在酵母中表達葡糖澱粉酶的載體(分別為pGAC9和pPM18)，使之能方便地操縱和測試葡糖澱粉酶突變體。發明概述本發明提供一種真菌葡糖澱粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；EC3.2.1)，突變Asn20Cys與Ala27Cys兩者之間連接形成二硫鍵使得酶的熱滅活性減低(熱穩定性增加)、異麥芽糖形成減少。通過摻入突變Asn20Cys和Ala27Cys的連接和表13中的至少一個突變，GA還具有累積的熱穩定性。包含Ser30Pro、Gly137Ala以及Asn20Cys與Ala27Cys連接的工程化GA，具有更高的熱穩定性。通過包含突變Asn20Cys與Ala27Cys的連接和表13中的至少兩個突變，GA還具有累積的熱穩定性。本發明還提供一種異麥芽糖形成減少的真菌葡糖澱粉酶，它包含Asn20Cys與Ala27Cys突變的連接(S-S突變)以及選自表14的至少一種突變。在一個實例中，工程化GA中包含了突變Ala27Cys與Asn20Cys的連接和311-314環狀結構突變(也稱為300Loop)。在另一個較佳的實例中，異麥芽糖形成減少的工程化葡糖澱粉酶包含Asn20Cys與Ala27Cys連接突變、Ser30Pro和Gly137Ala。本發明也提供一種工程化真菌葡糖澱粉酶，它包含311-314Loop突變，該突變使異麥芽糖形成減少。在另一個實例中製備了一種真菌葡糖澱粉酶，它包含311-314Loop突變和表14中的至少一種突變，該附加突變提供了減少異麥芽糖形成的累積效果。本發明提供一種真菌葡糖澱粉酶，它包含Ser411Ala突變，該突變提高了pH最適點並減少了異麥芽糖的形成。在一個實例中，Ser411Ala突變與表15中的至少一種突變組合，從而累積地提高了pH最適點。在一個實例中，Ser411Ala突變與表14中的至少一個突變組合，從而累積地減少了異麥芽糖的形成。在另一個實例中，工程化真菌葡糖澱粉酶包含了突變Ser411Ala和一對突變Asn20Cys和Ala27Cys,Asn20Cys和Ala27Cys兩者之間連接形成了二硫鍵，這些突變提高了酶的熱穩定性，提高了pH最適點，並減少了異麥芽糖的形成。在還有一個實例中，通過工程改造獲得一種真菌葡糖澱粉酶，它包含Ser411Ala突變、Asn20Cys和Ala27Cys連接的突變對(突變對的兩個成員間形成了二硫鍵)，以及311-314Loop突變，從而提高了酶的熱穩定性、pH最適點，並減少了異麥芽糖的形成。本發明提供一種通過設計突變，減少GA對α-(1,6)-糖苷鍵親和力來獲得異麥芽糖形成減少的真菌葡糖澱粉酶的方法。本發明還提供一種獲得熱滅活性減低的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法是通過設計突變來減少酶的去摺疊構象熵，和/或提高α螺旋的穩定性、增加二硫鍵、氫鍵、靜電作用、疏水作用、範德瓦爾斯作用和堆積緻密度(packingcompactness)。本發明也提供一種pH最適點提高的真菌葡糖澱粉酶，包括改變其在催化性鹼Glu400微環境中的極性、電荷分布和氫鍵連接。本發明還提供製備攜帶有至少兩個累積附加突變的基因工程化葡糖澱粉酶的方法。各個突變用定點誘變產生。篩選這些單個突變，選出那些表現出提高pH最適點、降低不可逆熱滅活反應速度或減少異麥芽糖形成的突變。然後進行定點誘變，以生成攜帶有至少兩個分開的所選突變的酶。最後，對工程化酶進行篩選，篩選出那些攜帶對熱穩定化或減少異麥芽糖形成有累積疊加作用的突變的酶(這些效果由製得的攜帶有至少兩個分開的所選突變的酶提供)。或者，篩選工程化酶中兩個突變對pH最適點、熱穩定性和/或異麥芽糖形成減少有累積疊加效果，這些效果由製得的攜帶有至少兩個分離的所選突變的酶提供。本發明還提供適用於每種突變以及突變組合的載體以及載體轉化的宿主細胞。附圖描述在參閱了以下與附圖相關的詳細描述後，很容易評價並能更好地了解本發明的其它優點。圖1顯示野生型(●)以及實施例1中脯氨酸取代的突變體GA:S30P(■)、D345P(_)、E408P(◇)的溫度與kd之間的關係。圖2顯示野生型(○)、A27C(●)、N20C(_)、A27C/N20C(_)、A471C/T72C(□)、A27C/N20C/G137A(■)、A27C/N20C/S436P(◇)和G137A/S436P(◆)葡糖澱粉酶在pH4.5緩衝液中測定時，溫度對一級熱滅活速度係數的影響。圖3顯示野生型(○)、A27C/N20C(●)、A471C/T72C(_)和A29C/N20C/G137A(_)葡糖澱粉酶在pH4.5、0.05M乙酸鈉中以4％麥芽糖為底物、於60-76℃的初始反應速度。圖4顯示溫度對野生型和突變型GA活性的影響。誤差條代表三次試驗的標準差野生型(●)、S30P/G137A(□)、S-S/S30P/G137A(▲)。圖5A-C顯示溫度對野生型和突變型GA的不可逆熱滅活速度係數的影響。圖5A野生型(●)、S30P(■)、G137A(△)、S30P/G137A(□)；圖5B野生型(●)、S30P(■)、S-S(六角形)、S-S/S30P(中間空心的圓圈)；圖5C野生型(●)、S30P/G137A(□)、S-S/S30P(中間空心的圓圈)、S-S/S30P/G137A(▲)。圖6A-B顯示野生型(●)、S30P/G137A(□)和S-S/S30P/G137A(▲)對28％(w/v)MaltrinM100的糖化作用。圖7顯示，在55℃，用野生型(◆)和突變型葡糖澱粉酶300Loop(■)、S30P/G137A(▲)、S-S(●)、S30P/G137A/300Loop(×)、S-S/300Loop(△)糖化30％DE10麥芽糖糊精的情況，每個反應中的酶濃度為166.67μg/mL。圖8顯示，在55℃，野生型(●)以及突變型葡糖澱粉酶Y116W(■)、Y175F(▲)、R241K(_)、S411A(◆)、S411G(六角形)對0.05M乙酸鈉緩衝液(pH4.4，含有0.02％疊氮鈉)中的30％(w/v)D-葡萄糖進行葡萄糖縮合12天產生異麥芽糖的情況。圖9顯示，在55℃，野生型(●)以及突變型葡糖澱粉酶Y116W(■)、Y175F(▲)、R241K(_)、S411A(◆)、S411G(六角形)對0.05M乙酸鈉緩衝液(pH4.4，含有0.02％疊氮鈉)中的28％(w/v)DE10麥芽糖糊精水解12天產生葡萄糖的情況。圖10顯示在不同pH值下野生型(●)和S411A(■)葡糖澱粉酶在DE10麥芽糖糊精水解時的葡萄糖產生初始速度。在36℃、與25mM檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液(指定的pH，含有0.02％疊氮鈉)中的28％(w/v)麥芽糖糊精進行水解4天。較佳實施例詳述本發明提供在真菌類葡糖澱粉酶中增加熱穩定性、提高pH最適點和減少異麥芽糖形成的突變，該葡糖澱粉酶可提供比野生型葡糖澱粉酶更高的葡萄糖產量。在真菌類中，葡糖澱粉酶的預計結構和已知序列是高度保守的[Coutino等，1994]。儘管採用的是典型的泡盛麴黴葡糖澱粉酶(1,4-α-D-葡聚糖葡萄糖水解酶；EC3.2.1.3；本文稱為GA；SEQIDNO:1)，但是也可採用包括麴黴屬在內的任何其它真菌葡糖澱粉酶。本文葡糖澱粉酶胺基酸的編號是根據典型的泡盛麴黴序列而定。對於不同的真菌種類，測得的等價胺基酸殘基號碼是不同的，這是該領域已知的[Coutino等，1994]。本發明提供了一種真菌葡糖澱粉酶，系通過工程化改造包含了Asn20Cys與Ala27Cys連接的突變對(兩者之間形成一個二硫鍵，該突變縮寫為Asn20Cys/Ala27Cys或S-S))，從而使該酶的熱滅活性降低(熱穩定性增加)，異麥芽糖的形成減少。使熱滅活性降低的其它突變歸納列在表13中。在該酶中包含至少兩個突變(例如包含突變Ser30Pro和Gly137Ala)也為GA提供了累積的熱穩定性。另一個例子是用酶中的Asn20Cys/Ala27Cys工程改造成S-S，或使Gly137Ala與S-S配對。另外，表13中提出的各突變的組合，尤其是S-S與Ser30Pro的連接，也提供了累積的熱穩定性。通常進行兩個突變的組合，但也可構建三個突變。例如，一個工程化GA包含三個突變Ser30Pro、Gly137Ala和Asn20Cys/Ala27Cys，從而提供了更高的熱穩定性。「Asn20Cys與Ala27Cys連接」是指一對突變，它簡稱為「S-S」或Asn20Cys/Ala27Cys，在這兩者之間如本文實施例所述的那樣形成了一個二硫鍵。通常這被認為是一個突變，因為兩者均是形成二硫鍵所必需的。「累積」通常指兩個或多個突變，對待測酶活性參數的疊加(或近似附加)作用。本發明也提供一種異麥芽糖形成減少、葡萄糖產量增加的真菌葡糖澱粉酶，它包含Asn20Cys/Ala27Cys突變(S-S突變)和至少一種選自表14的突變。在一個實例中，GA中包含Asn20Cys/Ala27Cys突變和311-314Loop(300Loop)突變。在另一個較佳的實例中，異麥芽糖形成減少的工程化葡糖澱粉酶包含Asn20Cys/Ala27Cys突變以及Ser30Pro和Gly137Ala突變。在一個實例中，構建了311-314Loop突變的葡糖澱粉酶，以減少異麥芽糖的形成。「311-314Loop突變」指插入性GA突變，從序列Tyr311-Tyr312-Ash313-Gly314變為Tyr311-Asn-Gly-Asn-Gly-Asn-Ser-Gln-Gly314(311-314Loop；SEQIDNO:2)。本發明提供一種真菌葡糖澱粉酶，它包含Ser411Ala突變，該突變使得pH最適點增加，異麥芽糖的形成減少。在一個實例中，Ser411Ala突變與表15中至少一個突變組合，該組合突變累積地提高了pH最適點。在另一個實例中，Ser411Ala突變與表14中的至少一個突變組合，這些突變累積地減少了異麥芽糖的形成。在另一個實例中，工程化真菌葡糖澱粉酶包含一個Ser411Ala突變和Asn20Cys/Ala27Cys突變對，該突變對在Asn20Cys和Ala27Cys之間形成一個二硫鍵，這些突變增加了熱穩定性，提高了pH最適點，並且減少了異麥芽糖的形成。在還有一個實例中，真菌葡糖澱粉酶包含Ser411Ala突變、311-314Loop突變和Asn20Cys與Ala27Cys連接的突變對，該突變對的兩個成員間形成一個二硫鍵，這些突變組合增加了熱穩定性、提高了pH最適點，並且減少了異麥芽糖的形成。突變這樣來表示被替換的胺基酸，其後是殘基編號，再後是替換的胺基酸。胺基酸縮寫成三個字母或一個字母的代碼。突變用本領域已知的定點誘變來產生。序列和殘基編號來自野生型(WT)或非突變型酶。如下文和實施例中所述的那樣進行生化分析。實施例提供了對各個突變進行性質分析的分析示範，而且還提供測定突變組合是否有累積效果的分析示範。「熱穩定性增加(或熱滅活性降低)」指在65-77.5℃下突變體不可逆滅活的速度低於野生型。本發明提供了一種獲得熱滅活性降低的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法通過設計突變以使酶在65-77.5℃的不可逆熱滅活速度低於野生型。通過設計突變來減少酶的去摺疊構象熵，和/或提高α螺旋的穩定性、增加二硫鍵、氫鍵、靜電作用、疏水作用、範德瓦爾斯相互作用和堆積緻密度，設計葡糖澱粉酶的熱滅活性降低，從而達到該目的。已經對蛋白質熱穩定性的基礎機理，以及影響可逆和不可逆熱滅活的因素進行了深入的研究[Argos等，1979；Klibanov,1983；Wasserman,1984；Ahern和Klibanov,1985]。涉及蛋白質在高溫下穩定的因素包括1)二硫鍵；2)非共價鍵如鹽橋、氫鍵和疏水作用；以及3)構象剛性[Nosoh和Sekiguchi,1988]。高溫下發生不可逆滅活的原因包括1)凝集作用；2)不正確結構的形成；3)二硫鍵的破壞；4)脫醯氨基作用(尤其是Asn-Gly序列中的Asn)；和5)Asp-X肽鍵的斷裂。很明顯，即使替換一個殘基也可使蛋白質的熱穩定性有很大變化[Matsumura和Aiba,1985]，因為使蛋白質三級結構穩定一般只需要自由能有很少的增加(20-30KJ/mol)[Nosoh和Sekiguchi,1988]。靠基因工程來增加酶的熱穩定性(或降低不可逆熱滅活性)已經在幾個實例中取得成功[Perry和Wetzel,1984；Imanaka等，1986；Ahearn等，1987]。然而，對控制熱穩定性的機理還不完全了解，因此不能準確地預計能促進熱穩定性的胺基酸(AA)替換[Leatherbarrow和Fersht,1986；Nosoh和Sekiguchi,1988；Pakula和Sauer,1989]。而本發明的方法能更準確地預測。「提高pH最適點」是指酶在更高的pH(高於野生型的pH最適點)下有功能。本發明還提供一種設計pH最適點提高的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法是改變酶在催化性鹼Glu400微環境中的極性、電荷分布和氫鍵連接。例如，設計突變體S411G和S411A來消除Ser411和Glu400間的氫鍵(參見實施例8)。「增加選擇性」是指，由於在葡萄糖高濃度下減少了不希望產生的α-(1,6)-鍵合副產物(可逆產物)的形成，從而減少了異麥芽糖的形成[Lee等，1976]。如上所述，GA能水解併合成α-(1,4)和α-(1,6)-糖苷鍵。選擇性增加表明，此酶合成α1,6鍵合產物的速度低於野生型，如同以30％葡萄糖為底物的縮合反應中異麥芽糖形成的水平低於野生型GA所顯示的那樣。另外，在用28％DE10麥芽糖糊精為底物的糖化反應中，提高選擇性會增加葡萄糖產量。本發明提供一種獲得異麥芽糖形成減少的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法通過設計突變來減少GA對α-(1,6)-糖苷鍵的親和力。這些突變被設計在酶的活性位點中，以減少由於葡萄糖縮合而引起的異麥芽糖形成。所設計的這些突變具有降低的異麥芽糖合成能力同時至少部分保留了野生型酶消化α-1,4鍵合底物的能力，從而使異麥芽糖形成與葡萄糖形成之比低於野生型酶。這些突變被安置在並不完全保守(根據同源分析來看)的位置中。動力學研究揭示有5-7個葡糖基結合亞位點，而且催化性位點位於亞位點1和2之間[Hiromi等，1973,Heromi等，1983,Meagher等，1989,Tanaka等，1983]。已明確泡盛麴黴X100(AspergillusawamorivarX100)葡糖澱粉酶催化結構域的三維結構，它與泡盛麴黴和黑麴黴GA相應區域有約95％的同源性[CoutinhoReilly,1994]，它含有13個α螺旋，其中12個成對排列形成α/α桶[Aleshin等，1992,Aleshin等，1994]。活性位點位於桶中央的空穴中。另外，對葡糖澱粉酶的13個胺基酸序列的同源分析表明，5個保守區確定了此活性位點[CoutinhoReilly,1994].GA催化的機理涉及兩個羧基[Hiromi等，1966]，在泡盛麴黴或黑麴黴中它們是Glu179和Glu400[Frandsen等，1994,Harris等，1993,Sierks等，1990]。Glu179使糖苷鍵中的氧質子化，起廣義的酸催化劑作用，而Glu400激活水(Wat500)對碳C-1作親核攻擊，起廣義的鹼催化劑作用[Frandsen等，1994]。葡糖澱粉酶與假四糖(pseudotetrasaccharide)(阿卡波糖和D-葡糖-二氫阿卡波糖)複合的晶體結構顯示，在pH4時對假四糖有兩個不同的結合構象體pH4型和pH6型[Aleshin等，1996,Stoffer等，1995]。與假四糖前兩個糖殘基的結合是相同的，但是與假四糖第三和第四個糖殘基的結合則有很大的不同[Stoffer等，1995]。根據酶在基態和過渡態下與配體形成穩定複合物的能力，確定了酶的底物專一性。酶-配體複合物的穩定性受空間位阻限制、氫鍵、範德瓦爾斯和靜電力、以及疏水接觸的影響[參見Fersht,1985,EnzymeStructureandMechanism，第2版，Freeman,SanFrancisco]。採用定點誘變來構建殘基119和121處的突變，以改變酶和底物間的氫鍵連繫。Ser119的原子OG與假四糖第四個糖殘基的3-OH的氫鍵連繫只發生在pH6型構象體中，而Gly121的醯胺氮與第三個糖殘基的6-OH的氫鍵連繫卻發生在pH4型和pH6型二種構象體中。設計這些突變來改變酶的底物專一性(減少α-1,6縮合反應)，並同時保留野生型酶水解α-1,4鍵合底物的能力。Ser119不是保守的，它可被Ala代替，在其它GA中可被Pro和Glu代替。設計S119E突變型來加強酶和底物第四個糖殘基間的氫鍵，以使pH6型構象體穩定，並為亞位點4附近提供負電荷以增加活性位點中的靜電作用。設計突變型S119G來消除同一氫鍵，使pH6型構象體不穩定。設計突變型S119W來消除同一氫鍵並增加酶和pH6型構象體間的疏水作用。Gly121在所有的葡糖澱粉酶序列中是高度保守的，除梭狀芽胞桿菌屬G005GA外，G005GA有很高的α-1,6活性，其中的Gly被替代成Thr。由於Gly121的φ和ψ角度允許該位置有丙氨酸而不會引起構象扭變，因此設計G121A在位置121處引入β-碳以使第三個糖殘基的6-OH基團離開其氫鍵連接位置。另外，設計雙重突變G121A/S411G來研究兩個底物專一性突變的疊加效果。這裡，S411G顯示能降低異麥芽糖產生初始速度(葡萄糖縮合反應)與葡萄糖產生初始速度(DE10麥芽糖糊精的水解)之比。下面進一步提供用於設計增加酶選擇性的突變的策略的實施例。300Loop突變根據胺基酸序列同源性研究[Countinho和Reilly,1994]，發現根黴菌屬和其它一些真菌家族的GA(與黑麴黴或泡盛麴黴的GA相比)有更長的胺基酸序列，並且在S4保守區形成了更大的環狀結構或空穴。由於單獨的一個突變不可能在鍵的水解或合成專一性上引起顯著的提高，因此設計了一個插入突變型GA(命名為300Loop或311-314Loop(SEQIDNO:2))，插入的7個胺基酸取自根黴菌屬GA，因為根黴菌屬GA是亞位點理論成功應用的第一種酶[Himori等，1973]。設計300Loop突變通過在S4保守區引入較大環狀結構來降低酶對α-(1,6)-糖苷鍵的親和力。Tvr175Phe:Tyr175在第三個保守區內。Tyr175和抑制劑D-葡糖-二氫阿卡波糖第四個殘基間的最近距離為4.06_[Stoffer等，1995]。在其它幾種葡糖澱粉酶中，Tyr175被Phe或Gln代替。將Tyr175變成Phe的目的是為了增加酶和底物間的疏水反應。Gly121Ala:Gly121在所有的葡糖澱粉酶序列中是高度保守的，除梭狀芽胞桿菌屬G005GA外(G005GA有很高的α-1,6活性，其中的Gly被替代成Thr)。由於Gly121的φ和ψ角度允許該位置有丙氨酸而不會引起構象扭變，因此設計G121A在位置121處引入一個β-碳以使第三個糖殘基的6-OH基團離開其氫鍵連接位置。Gly121Ala和S411G(通常稱為G121A/S411G)設計此雙重突變用來研究兩個底物專一性突變的疊加(累積)效果。S411G能降低異麥芽糖產生(葡萄糖縮合反應，見實施例)與葡萄糖產生(麥芽糖糊精10水解)初始速度之比。本發明提供一種工程改造真菌葡糖澱粉酶的突變然後製備攜帶有累積疊加突變的工程化酶的方法。最初的步驟是用定點誘變來產生單個突變，然後如實施例中所述的那樣篩選各個突變。然後選出那些表現出能降低不可逆熱滅活速度、或減少異麥芽糖形成或提高pH最適點的各個突變，以進行組合分析。一般來說，選擇的突變至少具有野生型酶的反應速度。如實施例所述，用定點誘變來組合突變，以確定它們的效果是否能疊加。用來產生酶(攜帶有至少兩個分開的所選突變)定點誘變的方法如本領域已知的那樣進行。然後篩選這些工程化酶對熱穩定化、pH最適點或減少異麥芽糖形成的累積疊加效果。另外，篩選攜帶有累積突變的工程化酶對兩種或多種參數的累積效果。為了對突變體進行生化分析，用超濾、DEAE-Sephadex柱層析以及親和柱層析(將強抑制劑阿卡波糖與載體相連)從15L批次發酵的培養上清中純化GA[Sierks等，1989]。用標準方法(如SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳和窄條帶兩性電解質的等電點聚焦)測定獲得的製備物的純度。用280nm吸光度法或Bradford法來測定蛋白質。用葡萄糖氧化酶/鄰聯茴香胺試驗(Sigma)測定GA活性。選擇性可以用本領域已知的任何方法來測定，但最好是測定30％(w/v)葡萄糖縮合反應(該反應在pH4.4、55℃、0.05M乙酸鈉緩衝液中進行)的異麥芽糖形成初始速度，然後測定30％(w/v)DE10麥芽糖糊精水解反應(該反應在pH4.4、55℃、0.05M乙酸鈉緩衝液中進行)的葡萄糖形成初始速度。根據測得的初始速度，計算出異麥芽糖形成與葡萄糖形成速率之比。熱穩定性可根據本領域已知的那樣進行，但最好是將酶培育在65-77.5℃之間以2.5℃為間隔的選定溫度下，然後在35℃用4％麥芽糖作為底物進行活性分析。當發現有一級衰變時，象野生型GA那樣測定衰變速度係數。根據不同溫度下的速度係數計算出衰變的活化能。pH最適點可如本領域已知的那樣進行測定，但最好是在45℃、在2.2-7.0範圍內的16個pH值下進行，用0.025M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液，以麥芽糖或麥芽糖庚糖作為底物。糖化作用如實施例中所述那樣進行測定。簡而言之，將葡糖澱粉酶和作為底物的DE10麥芽糖糊精置於55℃、pH4.4、0.05M乙酸鈉緩衝液中培育。在0.5-288小時內的不同時間取樣測定葡萄糖的產量。本發明提供載體，該載體包括與本文公開的各種突變序列、突變組合及突變部分的核酸序列操作性聯鎖的表達控制序列。本發明還提供宿主細胞，選自合適的真核和原核細胞，它們用這些載體轉化。載體可由本領域技術人員構建成含有本發明的cDNA，載體應當含有實現其序列所需轉錄必須的所有表達元件。載體中還可包含其它有利特性，例如用來回收不同形式的核酸的機制。這裡提供一些實施例。噬菌粒是這些有益載體中的一個具體例子，因為它們既可用作質粒，又可用作噬菌體載體。其它載體例子包括病毒(如噬菌體、杆狀病毒和逆轉錄病毒)、DNA病毒、粘粒、質粒、脂質體和其它重組載體。載體也可含有用於原核生物或真核生物宿主系統的元件。本領域普通技術人員知道那個宿主系統與特定的載體相容。載體可以用本領域已知的許多方法(磷酸鈣轉染、電穿孔、脂質轉染、原生質體融合、polybrene轉染、彈道DNA傳遞、乙酸鋰或CaCl轉化)中的任何一種來引入細胞或組織中。宿主細胞可以是任何可用載體轉化，並支持酶生產的真核和原核細胞。上述討論為真菌葡糖澱粉酶的熱穩定性和選擇性突變體、設計突變的方法以及篩選突變和含有這些突變的載體的累積效果提供了事實根據。下列非限制性的實施例及其附圖顯示了本發明採用的方法及用途。實施例分子生物學中的通用方法本領域已知的分子生物學標準技術(這裡不作具體描述)通常按下列文獻進行Sambrook等，MolecularCloning:aLaboratoryManual,ColdSpringsHarborLaboratory,NewYork(1989)；Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Rose等，MethodsinYeastGenetics:ALaboratoryCourseManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1990)。聚合酶鏈反應(PCR)一般根據PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)進行。寡核苷酸用本領域已知的方法合成。例如可採用AppliedBiosystems380BDNA合成儀。材料釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)C468(αleu2-3leu2-112his3-11his3-15mal)以及質粒YEpPM18由Cetus所贈。阿卡波糖由MilesLaboratories所贈。所有的限制性酶購自Promega,T4DNA連接酶和pGEM-7Z(+)(一種大腸桿菌噬菌粒載體)也來自Promega。麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)、麥芽七糖(G7)、葡萄糖氧化酶、過氧化酶和α萘酚購自Sigma。異麥芽糖(iG2)購自TCIAmerica。平均聚合度(DP)分別為10、6和4的DE10麥芽糖糊精購自GrainProcessingCorporation。高效薄層層析(HPTLC)板(LHPK矽膠60_,20×10cm)來自Whatman。定點誘變定點誘變根據Kunkel等的方法進行，採用Bio-Rad的Muta-Gene噬菌粒體外誘變試劑盒。將編碼葡糖澱粉酶催化結構域的1.7kbXhoⅠ→BamHⅠDNA片段克隆入Stratagene的pBluescriptⅡKS(+)載體中。各具體實施例中提供了用作誘變引物的寡核苷酸。通過測序確認各個突變的存在，將每個突變的GA基因片段亞克隆入YepPM18[Cole等，1988]中，並用來轉化釀酒酵母菌。酶的生產和純化使酵母在30℃、pH4.5、5.3LSD+His培養基中(在5.0L發酵罐中)生長72小時產生野生型(WT)和突變型酶。在48小時時，補充加入300ml水含100g葡聚糖和22g(NH4)2SO4。生長後，離心培養物，除去酵母細胞，超濾濃縮上清液，用pH4.5、0.5MNaCl/0.1MNaOAc透析，再用阿卡波糖-Sepharose親和層析純化。GA用pH7.6、1.7MTris-Cl洗脫，用水透析，再超濾濃縮，用pH4.5、0.05MNaOAc緩衝液透析。按照Pierce雙金雞寧酸蛋白試驗[Smith等，1985]，用牛血清白蛋白作為標準，測定蛋白質濃度。酶活性測定在50℃，用pH4.5、0.05MNaOAc緩衝液中的4％麥芽糖作為底物測定酶活性。一個國際單位(IU)的酶活性定義為在試驗條件下產生1μmol/min葡萄糖所需酶的量。酶與底物混合後，在42分鐘內每隔7分鐘共取出六份100μl樣品，用40μl、pH7.0、4.0MTris-Cl終止反應，用Sigma的過氧化酶-葡萄糖氧化酶/鄰聯茴香胺葡萄糖試驗試劑盒測定葡萄糖濃度。不可逆熱滅活測定取一式兩份的40μg/ml純化的野生型和突變型酶。在65-80℃內相隔2.5℃的6個或8個溫度下進行滅活。在6個不同的時間點取樣，立即放在冰上並在4℃保藏24小時。如上所述，但在35℃下測定滅活樣品和未經熱滅活的相應樣品的殘餘酶活性。葡糖澱粉酶活性的pH依賴性45℃、在2.2-7.0範圍內的16個不同的pH值下測定葡糖澱粉酶活性的pH依賴性，用0.025M檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液[McIlvane,1921]，以麥芽糖或麥芽糖庚糖作為底物。加入氯化鉀，使檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液的離子強度保持在0.1。在下列底物濃度下測定游離酶和酶-底物複合物的pK值(ⅰ)小於0.2Km，這樣初始速度(ⅴ)與kcat/Km成比例，(ⅱ)大於10Km,這樣初始速度(ⅴ)與kcat成比例[SierksSvensson,1994，參見Whitaker(1994)Principleofenzymologyforthefoodsciences，第二版，MarceelDekker,NY]。用Enzfitter軟體，將隨pH值而變的初始速度代入公式logY=log[c/(1+H/K1+K2/H]中，計算出遊離的酶和酶-底物複合物的兩個催化基團的pK值。Y是在不同pH值下測得的感興趣的參數的觀察值(即kcat/Km或kcat),C是Y的pH不依賴性值(即kcat/Km或kcat的最大值)，H是氫離子濃度，K1和K2是酶催化基團的解離常數。當表觀pK1和pK2的數值相差不到3個pH單位時，通過公式(H+)1+(H+)2=K1+4(H+)opt和(H2)opT=k1k2]]>來調節此pK值[Whitaker,1994]。氫離子在最適pH下的濃度(H+)opt通過PHopt來計算，而PHopt等於表觀pK1和pK2的平均值。當pH值分別等於表觀pK1和pK2時，(H+)1和(H+)2(表觀K1和K2)分別對應於氫離子濃度。DE10麥芽糖糊精的水解(糖化)水解在35℃和/或55℃(按文中所指)用0.05M、pH4.4乙酸鈉緩衝液中作為底物的28％(w/v)DE10麥芽糖糊精進行，緩衝液中加入0.02％疊氮鈉來抑制反應混合物中微生物的生長。野生型和突變型GA的酶濃度均為2.64μM。在不同時間(從0.5至288小時)取樣，將樣品加入相同體積的pH7.0、1MTris-HCl緩衝液中來終止反應，因為Tris是一種已知的葡糖澱粉酶抑制劑[ClarkeSvensson,1984]。用葡萄糖氧化酶方法測定葡萄糖的產量[RabboTerkildsen,1960]。將試驗數據代入公式c=At(1+Bt)，測得葡萄糖產生的初始速度，其中c為產物濃度，t為時間，A(初始速度)和B通過非線性回歸獲得。在55℃，只用70小時前的時間點來進行計算，因為在那時野生型GA的葡萄糖產生已經衰退。葡萄糖縮合反應葡萄糖縮合反應在35℃和55℃下、以30％(w/v)D-葡萄糖為底物，在pH4.4、0.05M乙酸鈉緩衝液中進行12天，緩衝液中加入0.02％疊氮鈉來抑制反應混合物中微生物的生長。野生型和突變型GA的酶濃度均為2.64μM。在不同時間取樣，將樣品加入相同體積的pH7.0、1MTris-HCl緩衝液中來終止反應。根據Robyt等描述的改良方法[Bobyt和Mukerjea,1994]，用高效薄層層析(HPTLC)和圖象光密度儀測定異麥芽糖的產生。將不同稀釋度樣品和6份不同濃度的標準品(含有葡萄糖、麥芽糖和異麥芽糖)各1μl用於HPLTC平板。顯影溶劑系統含有乙腈、乙酸乙酯、1-丙醇和水，其體積比為85∶20∶50∶40。在HPLTC平板上只用升高一度來顯影糖類分離物。顯影后，平板空氣乾燥，將平板浸在含有0.3％(w/v)α-萘酚和5％(v/v)H2SO4的EtOH溶液中，再次空氣乾燥，120℃培育約10分鐘，使糖可視化。用圖象光密度儀(Bio-Rad,ModelGS-670)、分子分析軟體(Bio-Rad)定量測定HPTLC平板上異麥芽糖點的密度。將試驗數據代入公式c=At/(1+Bt)(前文DE10麥芽糖糊精水解中已述)中，獲得異麥芽糖產生的初始速度。實施例1通過脯氨酸取代使泡盛麴黴葡糖澱粉酶穩定下列實施例是用於分析葡糖澱粉酶單個突變的方法和步驟的一個典型例子。為了研究控制泡盛麴黴葡糖澱粉酶熱穩定性的機理，構建了三個脯氨酸取代突變。預計這些突變能通過降低酶的去摺疊構象熵來增加GA穩定性。泡盛麴黴葡糖澱粉酶(α-1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3；GA)是一種催化澱粉及相關寡糖非還原性末端釋放β-葡萄糖的酶。GA用於在商業上將澱粉轉變成富含葡萄糖的糖漿並確定了轉變的速度限制步驟，而含高葡萄糖的糖漿經葡萄糖異構酶轉變成果糖糖漿，或者GA用於發酵生產乙醇。在工業上，GA在55-60℃下使用；在更高溫度下，此酶會迅速地、不可逆地失活。因此，熱穩定性增加的GA突變體在工業上有益於減少反應時間和/或增加固體濃度。以前的研究工作表明，寡聚1,6-葡糖苷酶[Suzuki等，1987]和支鏈澱粉酶[Suzuki等，1991]的天然穩定性與蛋白質中脯氨酸的摩爾百分數呈正相關，並且還提出了蛋白質穩定性的一般規律[Suzuki,1989]。該工作的延伸研究顯示，噬菌體T4溶菌酶[Matthews等，1987]和蠟狀芽胞桿菌ATCC7064寡1,6葡糖苷酶[Watanbe等，1994]可通過將脯氨酸工程改造入所選位點而穩定化，從而減少了蛋白質的去摺疊構象熵。根據結構和進化的考慮，選擇三個位點(Ser30、Asp345和Glu408變為Pro)用脯氨酸代替。用克隆的泡盛麴黴基因來構建這些位點處的突變[Innis等，1985]，並在釀酒酵母菌中表達這些蛋白[Cole等，1988]。通過不同溫度下它們對不可逆熱滅活的抗性，來測定突變型蛋白的穩定性。如本文所示，Ser30變為Pro的突變增加了GA穩定性。然而，出乎意料的是，Glu408變為Pro的突變降低了其穩定性，而Asp345變為Pro的突變沒有顯著改變GA穩定性。定點誘變定點誘變如本文上述的那樣進行。下列寡核苷酸用作誘變引物CAGAGTCCGCGCCCGGCACCCAAGCACCGTC(Ser30→Pro)(SEQIDNO:3)、AAGTCCAGCGACACAGGTGTGACCTCCAACGAC(Asp345→Pro)(SEQIDNO:4)、CGAGCGGAAAGCTGCGGGCCATCAGACTTGTC(Glu408→Pro)(SEQIDNO:5)。脯氨酸取代位點的選擇根據結構已知的泡盛麴黴X100GA幾乎已明確的催化結構域[Aleshin等，1992]，選擇三個取代位點，它們符合下列標準1)Ramachandran(φ,ψ)角度在脯氨酸允許值範圍內[Ramachandran等，1963]。對此，取代位點處φ和ψ角度限定在寬範圍內，φ=-90°到-40°,ψ=120°到180°或φ=-90°到-40°,ψ=-50°到10°。2)殘基應充分暴露在溶劑中，因為認為酶核心中的殘基突變更可能降低酶的催化效率。3)殘基不參加與其它胺基酸的氫鍵形成。另外，根據其它生物GA的序列比較[Coutinho和Reilley,1994b]，只選擇符合上述結構標準和不很保守的殘基用於突變。在Hormoconisgriseavarthermodiea和H.resiaeGamP的GA中，Ser30可匹配脯氨酸，這就使得Ser30被脯氨酸取代有特別的吸引力。結果比活性在50℃、pH4.5時，沒有一種脯氨酸取代的突變顯著改變了野生型和突變型GA的酶比活性。這揭示，這些突變沒有顯著改變活性位點周圍的酶結構，或其與底物的相互作用。不可逆熱穩定性按照試驗步驟中所述，使野生型和突變型GA在pH4.5下受熱滅活。作殘餘活性百分數隨滅活時間的半對數圖，獲得滅活速度係數(kd)。圖1顯示野生型及突變型GA的溫度和Kd之間的關係。根據這些數據，用過渡態理論和熔解溫度(Tm，在此溫度下10分鐘後估計50％的酶被滅活)計算熱滅活的活化能(ΔG′)(表1)。可以看出，Glu408→Pro突變大大降低了GA穩定性，Asp345→Pro突變不明顯改變GA穩定性，而Ser30→Pro突變則增加了GA穩定性。應當注意，儘管表1顯示Asp345→Pro突變型GA顯示AG′和Tm稍有增加，但是這些變化一般不明顯，或者說，Asp345→Pro突變型GA並不比野生型更穩定，因為該突變型酶在兩個相差較大的溫度(65℃和75℃)時的kd基本上與野生型沒有區別(圖1)。在測定脯氨酸取代突變抵抗不可逆熱滅活的能力時，此類突變有不同的熱穩定性。與野生型GA相比，Glu408→Pro降低了GA穩定性，Asp345→Pro不明顯改變GA穩定性，而Ser30→Pro突變則增加了GA穩定性(圖1和表1)。Glu408→Pro使GA不穩定。正如Schimmel和Flory於1968年首次提出並由其他人[MacArthur和Thornton,1991；Hurley等，1992]擴展的那樣，脯氨酸不僅限制了其存在位點處的φ和ψ值，而且還限制了前一殘基的φ和ψ值。這些報導提出，脯氨酸之前Xaa到Pro內所有殘基的(φ,ψ)值應限制在大約φ=-180°到-55°,ψ=55°到180°，或φ=-180°到-55°,ψ=-30°到-70°，但Xaa-Gly除外，φ值範圍仍然適用，但是延伸到包括φ=45°到180°。在公開的泡盛麴黴X100催化性結構域的結構[Aleshin等，1992]中，與泡盛麴黴GA中Glu408匹配的Asp408(φ=-65°,ψ=146°)的φ、ψ值在脯氨酸可接受的範圍內。然而，前一個殘基Gly407(φ=80°,ψ=-5°)的φ、ψ值卻在脯氨酸前面位置的可接受範圍之外。難怪Glu408→Pro會使GA不穩定。另外，X-射線晶體圖揭示，密切相關的泡盛麴黴X100GA2中位置408在β鏈(不適合脯氨酸取代的位點)中。Asp345(φ=-65°,ψ=-26°)和前面的Thr344(φ=-116°,ψ=178°)的φ、ψ角度值均在345位脯氨酸取代允許值範圍內。然而Asp345→Pro突變型GA並沒有表現出與野生型GA明顯不同的穩定性。這特別出乎預料，因為345位處在一個α螺旋的N端；以前的研究顯示，該位置對於脯氨酸取代是特別有利的[Watanabe等，1994]。Ser30(φ=-49°,ψ=130°)之前是Va129(φ=-127°,ψ=46°)，兩者均有可接受的φ和ψ角度值，只是Va129的ψ=46°稍稍低於30位脯氨酸取代的理想值。總之，當在釀酒酵母菌中表達時，Glu408→Pro降低了酶的穩定性，Asp345→Pro不明顯改變GA穩定性，而Ser30→Pro則大大增加了酶的穩定性。當在65℃到77.5℃之間測定時，Ser30→Pro突變型GA表現出顯著降低的不可逆熱滅活速度，酶活性沒有降低。在65℃，呈現熱滅活速度係數比野生型GA降低1.7倍，而熱滅活的活化能比野生型GA增加1.6KJ/mol。實施例2工程改造的二硫鍵下列實施例是分析葡糖澱粉酶單個突變中採用的方法和步驟的典型例子。認為GA熱滅活過程是由形成不正確構象的酶所支配的[Munch和Tritsch,1990]。以前的研究支持這一假設。用定點誘變來消除脫醯胺和肽水解的位點[Chen等，1994a,b]。在pH4.5、低於70℃時，相應的突變Asn182→Ala和Asp257→Glu使不可逆熱滅活速度降低，但在高於70℃時卻使不可逆熱滅活速度增加。因此，GA熱滅活主要是由於「混亂的」結構而不是脫醯胺和肽水解所引起。而且，突變Gly137→Ala、Gly139→Ala和Gly137/139→Ala/Ala降低了螺旋的柔性，在高達75℃時通過減緩不正確結構的形成明顯增加熱穩定性(Chen等，1996)。為了通過防止不正確結構的形成來改進蛋白質的熱穩定性，提出了幾種策略，包括引入共價鍵如二硫鍵(Perry和Wetzel,1984；Wetzel,1987；Matsumura等，1989,Clarke和Fersht,1993)。在泡盛麴黴GA中，總共有9個半胱氨酸殘基，其中8個形成了二硫鍵配對並假設增強了GA的摺疊和穩定性，它們是殘基210和213、262和270、222和449[Aleshin等，1992]以及509和604[Williamson等，1992b]。在本實施例中，在GA中引入了附加的二硫鍵，以研究其對熱穩定性和催化活性的影響。構建兩個工程二硫鍵突變，命名為A27C/N20C(簡寫為S-S)和A471C/T72C。A27C/N20C形成的新二硫鍵將螺旋1的C端(Asn20)和Ala27殘基所在的轉角連接起來，而A471C/T72C將螺旋3的N-端和30個殘基的高度O-糖基化帶區的末端橋連在一起。二硫鍵在發酵後自發形成，它們對GA的熱穩定性和催化活性有不同的作用。定點誘變如上所述進行定點誘變。所用的寡核苷酸引物是5′-CGTACTGCCATCCTGTGTAACATCGGGGCGGA-3′(N20C,AAT→TGT)(SEQIDNO:6)、5′ATCGGGGCGGACGGTTGTTGGGTGTCGGGCGCG-3′(A27C,GCT→TGT)(SEQIDNO:7)、5′-CGAAATGGAGATTGCAGTCTC-3′(T72C,ACC→TGC)(SEQIDNO:8)、5′-GAGTATCGTGTGTACTGGCGGCACC-3′(A471C,GCT→TGT)(SEQIDNO:9)，有下劃線的字母表示核苷酸突變。SDS-PAGE和巰基滴定(thio-titration)按照Garfin的方法，用0.75mm厚的10％聚丙烯醯胺凝膠進行SDS-PAGE。對於巰基滴定，將濃度為2mg/ml的GA在變性溶液中煮沸10分鐘變性，該變性溶液含有2％SDS、0.08M磷酸鈉(pH8.0)、0.5mg/mlEDTA[Habeeb,1972]，含或不含50mMDTT[Pollitt和Zalkin,1983]。用Centricon30濃縮器(Amicon,MA,USA)濃縮變性的GA(還原的或未還原的)，將還原的GA上樣於Bio-spin30層析柱(Bio-Rad,CA,USA)，該樣品預先用變性溶液平衡以除去DTT。所得溶液以及未還原的變性GA樣品分成兩部分。一部分用於蛋白質濃度測定；另一部分用於巰基還原測定，方法是將該部分與含4mg/mlDTNB的變性溶液以30∶1的體積比混合，然後在室溫下培育15分鐘，測定412nm下吸光度，一個摩爾吸收值為13600M-1cm-1[Habeeb,1972]。GA活性試驗如上所述，在酶動力學研究中用麥芽糖作為底物。如前所述[Chen等，1994b]，在35℃、pH4.5下濃度範圍在0.2Km至4Km間。用ENZFITTER程序分析動力學參數。在殘餘酶活性試驗中，條件與酶動力學研究中的條件一樣，只是用一個濃度的麥芽糖(4％)作為底物。在50℃、pH4.5下以4％麥芽糖為底物進行比活性測定。一個國際單位(IU)定義為在試驗條件下每分鐘產生1μmol葡萄糖所需的酶量。為了比較野生型和突變型GA催化活性的最適溫度，用4％麥芽糖作為底物，在pH4.5、不同的溫度下測定活性。不可逆熱滅活如上所述，在65℃至75℃內以2.5℃為間隔的5個不同溫度下，在0.0SMNaOAC緩衝液(pH4.5)中培育40μg/ml的純化野生型或突變型GA蛋白。在6個不同的時間點取出等份培育的酶，在冰上速冷，4℃保藏24小時，再進行殘餘活性測定。GA的不可逆熱滅活遵循一級動力學[Chen等，1994b]。如前所述測定熱滅活速度係數kd[chen等1994b]。突變殘基的計算機模型和三維觀察參照安裝在DEC3100工作站中的SSBOND程序(Hazes和Dijkastra,1988)，用泡盛麴黴X100GA的晶體結構[Aleshin等，1992](Brookhaven蛋白質資料庫中的lgly)來製作形成二硫鍵的泡盛麴黴GA的候選殘基模型。突變位點的選擇選擇殘基Asn20、Ala27和Thr72、Ala471用半胱氨酸代替。在用SSBOND程序分析了泡盛麴黴X100GA[Aleshin等，1992]的晶體結構後，發現有132對殘基能有效地作為二硫鍵的位點。假定甘氨酸是該位點柔性所需要的，因此排除含有甘氨酸的殘基對。同樣，也除去涉及氫鍵和靜電作用的殘基。根據幾何分析，選擇殘基20與27的配對以及72和471的配對作為形成二硫鍵的候選位點。相關GA間的胺基酸序列比較顯示，在粗糙鏈孢酶(Neurosporacrassa)[Coutinho和Reilly,1994b]中位置20和27間有一個二硫鍵，提示在泡盛麴黴GA的位置20和27之間引入二硫鍵不會引起不利的相互作用。另外，20/27二硫鍵會將螺旋1的C-端與參與底物結合的GA保守的S1片段連接在一起[Coutinho和Reilly,1994a]，形成一個環狀結構，該環與對催化非常關鍵的含有Trp120(參與底物結合的一個殘基[Sierks等，1989])的另一個環靠近。因此，預計建議的20/27二硫鍵通過保持催化及底物結合的正確構象而使GA穩定。另一候選的二硫鍵配對在位置471和72之間。該二硫鍵會將螺旋3的N-端和30個殘基(440-470)的富含O-糖基化的帶區連接起來形成一個環狀結構。該二硫鍵還在催化結構域和O-糖基化連接體(linker)之間形成一個附加鍵。已經證明，該O-糖基化連接體對於GA的熱穩定性非常重要，它限制了GA去摺疊肽所需的構象空間[Semimaru等，1995和Williamson等，1992]。由於這個連接，該二硫鍵對GA的熱穩定性有整體影響。泡盛麴黴X100GA[Aleshin等，1992]中Thr72的側鏈-OH基團與Asp73的主鏈N原子形成氫鍵。然而，發現在泡盛麴黴GA中，殘基73的Asp被絲氨酸代替。泡盛麴黴GA的殘基72和73之間可能不存在氫鍵，因此用Cys代替Thr72不會干擾該作用。顯然，氫鍵對GA來說並不重要，因為在其它GA中，Thr72被Ala、Lys或Val代替[Coutinho和Reilly,1994b]。工程二硫鍵的自發形成在GA純化後，通過下列兩種方式發現自發形成工程二硫鍵。第一，在非還原的條件下進行SAS-PAGE時，突變型A471C/T72C的移動比野生型快，提示附加的二硫鍵形成了一個阻礙遷移的新環狀結構。通過突變型cDNA的DNA測序和MALDI分析，排除了該種情況時形成截短的酶的可能性。MALDI數據顯示，該突變型GA的分子量與野生型GA相同。突變A27C/N20C的遷移率與野生型GA相同，這可能是由於工程二硫鍵形成的附加環太小(7個殘基)不能影響遷移率的緣故。第二，巰基滴定證明了這個新的二硫鍵。通過比較還原劑DTT處理前後的游離巰基數，推斷出突變型和野生型GA中的二硫鍵總數(列在表2中)。根據還原劑DTT存在下的[SH]/分子之比，野生型、A27C/N20C和A417C/T72CGA的游離巰基分別為8.6、10.9和10.4(表2)。缺乏DTT時，總數分別為0.9、0.9和1.3(表2)。這提示野生型、A27C/N20C和A471C/T72C中二硫鍵數目分別是4、5和5。因此，引入的半胱氨酸殘基形成了二硫鍵而不是維持游離巰基。酶活性和催化的最適溫度如表3所示，與野生型相比，在35℃和50℃時雙重突變A27C/N20C和A471C/T72C的酶性能沒有改變，而單個突變明顯降低了活性。A27C/N20C和A471C/T72C突變體50℃時的比活性和35℃時的動力學參數，與野生型GA非常接近(表3)。單突變A27C的Km稍有增加，但是kcat值與野生型GA相同，因此，其kcat/Km比值降低約30％。突變N20C有相同的Km，但是kcat和kcat/Km之比均降低，50℃時比活性減少50％以上。GA的不可逆熱滅活研究了65℃、67.5℃、70℃、72.5℃和77.5℃時野生型和突變型GA的不可逆熱滅活情況，其一級不可逆熱滅活係數kd見圖2。突變A27C、A27C/N20C和A471C/T72C在所測溫度範圍內的Kd值小於野生型GA，這意味著其活性的衰退比野生型更慢，而突變體N20C在除75℃外的所有溫度下Kd值均大於野生型，這意味著N20C比野生型衰退得更快。表4顯示根據過渡態理論計算得到的野生型和突變型GA在65℃和75℃時的活化焓(Δ)、熵(Δ)和去摺疊自由能(Δ)。N20C和A27C/N20C的焓分別減少42和24KJ/mol，而A27C和A471C/T72C的焓沒有發生顯著改變。突變體N20C和A27C/N20C的熵分別減少115KJ/mol和75KJ/mol，而突變體A27C和A47lC/T72C的熵顯示出沒有顯著變化。突變體A27C和A47lC/T72C在65℃和75℃時的Δ稍稍高於野生型GA(＜0.5KJ/m01)，而A27C/N20C在65℃和75℃時的Δ分別比野生型高1.5KJ/mol和2.2KJ/mol。突變體N20C在65℃和75℃時的Δ分別比野生型GA少3.0KJ/mol和1.8KJ/mol。因此，與野生型GA相比，工程二硫鍵突變體A27C/N20C顯著地提高了GA熱穩定性，而單個突變體則使熱穩定性稍有增加(A27C)或稍有降低(N20C)。其他二硫鍵突變體的熱穩定性與野生型GA相同。實施例3突變A27C/N20C與其它突變的組合在以前的研究中，申請人已經構建了熱穩定性突變體G137A[chen等，1996]和S436P(Li等，1996)，這些突變體有組合併附加改善熱穩定性的潛力。在本實施例中，將這些突變相互組合併與A27C/N20C(S-S；實施例2)組合，測試它們對熱穩定性和GA活性的效果(累積/疊加效果)。酶活性和催化最適溫度與野生型GA相比，組合突變體A27C/N20C/G137A和A27C/N20C/S436P的比活性增加，而突變體Gl37A/S436P的比活性與野生型GA相似。雙重突變體A27C/N20C和A471C/T72C以及組合突變體A27C/N20C/G137改變了催化的最適溫度。在60℃至74℃溫度下相對活性試驗(表3)顯示，野生型、突變體A27C/N20C以及A47lC/T72C分別在71℃、72℃和72.5℃有最高的活性。在60℃到67.5℃下，突變型和野生型GA有非常相似的活性。然而，當溫度超過70℃時，它們的相對活性有很大的不同。突變體A27C/N20C和A27C/N20C/G137A的活性在70℃到76℃時始終高於野生型(峰值在72.5℃)，而突變體A471C/T72C在70℃到71℃以及73℃到74℃時的活性低於野生型，但在72℃(是其最適溫度)時高於野生型。因此，突變體GAA27C/N20C、A47lC/T72C以及組合突變體A27C/N20C/G137A的最適溫度比野生型GA高1.5℃。GA的不可逆熱滅活性在65℃、67.5℃、70℃、72.5℃和77.5℃下研究了野生型和突變型GA的不可逆熱滅活情況，其一級不可逆熱滅活係數kd見圖2。突變體A27C、A27C/N20C和A47lC/T72C、A27C/N20C/G137A、A27C/N20C/S436P和G137A/S436P在所測溫度範圍內的kd值小於野生型GA，這意味著其活性衰退比野生型慢，而突變體N20C在除75℃外的所有溫度下的kd值均高於野生型，這意味著N20C的活性衰退比野生型快。表4示出了根據過渡態理論計算得到的野生型和突變型GA在65℃和75℃時的活化焓(Δ)、熵(Δ)和解摺疊自由能(Δ)。螺旋柔性突變體G137A在與S436P或A27C/N20C組合時顯示出有附加的熱穩定性。S436P和A27C/N20C的組合沒有顯示出附加作用。實施例4組合突變對的進一步研究為了進一步研究各個穩定化突變，是否能累積地使泡盛麴黴葡糖澱粉酶(GA)穩定，構建了含有熱穩定化突變組合的突變型酶。以前的研究顯示，下列突變使GA穩定(表現為缺乏糖類被滅活時，不可逆熱滅活速度降低)Ser30→Pro(S30P；實施例1)、Glyl37→Ala(G137A)、以及Asn20→Cys/Ala27→Cys(在殘基20和27之間產生一個二硫鍵，為方便起見稱為S-S；實施例2)。為了研究各個穩定化突變是否能累積地使GA穩定，用這三種突變製得其它組合的突變型酶。定點誘變用上文列出的S-S/S30P寡核苷酸和一個單鏈DNA模板構建了S-S/S30P/G137A組合突變體，該模板衍生自pBluescriptⅡKS(+)載體，它具有編碼GA催化性結構域的1.7kbXhoI→BamHⅠDNA片段，該片段中已經含有賦予S30P和G137A胺基酸取代的突變。通過測序確認各個突變的存在，將每個突變的GA基因片段亞複製人YEpPM18中[Cole等，1988]，轉化入釀酒酵母菌。巰基分析將一式兩份10nmol野生型、S-S/S30P和S-S/S30P/G137A突變體GA培育在0.2mM5,5′-二硫二(2-硝基苯甲酸)、6MGdnHCl和50mMTris(pH8)中[Fierobe等，1996]。根據用0-30μM半胱氨酸建立的標準曲線計算巰基濃度。不可逆熱滅活使一式兩份的野生型和突變型GA在65℃至80℃之間相隔2.5℃的6個或7個溫度下熱滅活。4℃保藏24小時後，35℃分析滅活樣品的殘餘活性，以及相應的未滅活樣品的活性[Chen等，1996]。糖化分析用攪拌加熱模塊(stirringheatingblock)進行糖化，一式兩份，並用密封小瓶防止蒸發。用pH4.5、0.05MNaOAc中的28％(w/v)MaltrinDE10麥芽糖糊精作為底物，測定8μg/ml的野生型和突變型GA。在不同的時間取樣，以pH4.5、0.05MNaoAc適當稀釋，將100μl稀釋樣品加入40μl4.0Mtris-Cl,pH7.0中來終止反應。用葡萄糖氧化酶/鄰聯茴香胺試驗測定葡萄糖濃度[Banks和Greenwood,1971]。結果酶活性表5顯示了在50℃、pH4.5、以麥芽糖為底物時野生型和突變型GA的比活性。沒有一種突變體GA表現出酶活性減少，而S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突變體在50℃時比野生型活性略高。為進一步研究這一觀察結果，在35℃到68℃之間的不同溫度下測定這些突變型酶的活性(表4)。S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突變體GA在所有的測定溫度下均比野生型更具活性。巰基分析確認Asn20→Cys/Ala27→Cys突變體GA中位置20和27之間有二硫鍵形成(實施例2)。表6顯示對S-S/S30P和S-S/S30P/G137A組合突變體的巰基分析結果。泡盛麴黴GA在位置320處有一個游離的半胱氨酸。組合突變體GA顯示出每分子的巰基含量略高於野生型，這反映出位置20和27之間距全部形成二硫鍵還差一些。但是，如果二硫鍵完全沒有形成的話，則[SH]/蛋白質預計會由於加入的兩個游離半胱氨酸殘基而增加大約3倍。因此，我們得出結論，實際的二硫鍵形成為其全部形成理論值的70-80％。不可逆熱滅活使野生型和突變型GA在pH4.5、65℃至80℃之間經受熱滅活。製作殘餘活性對滅活時間的半對數圖，獲得滅活速度係數(kd)。圖5顯示溫度對於野生型和突變型GA的kd的影響。可以看出，組合的突變體明顯比單個突變型酶更穩定。另外，通過熱滅活曲線的外推計算出10分鐘後50％的酶被滅活的溫度(Tm)，用過渡態理論計算熱滅活的活化能(Δ)。表7顯示組合突變型GA的Δ和Tm相對於野生型GA的變化(ΔΔ)。這些數據清楚地證明了，將單個穩定化突變組合起來可以累積地使酶穩定化。糖化分析圖6顯示，在55℃和65℃對野生型、S30P/G137A和S-S/S30P/G137AGA的糖化分析結果，採用工業用DE10麥芽糖糊精底物MaltrinM100(28％w/v)(來自GrainProcessingCorporation)。28％w/vDE10麥芽糖糊精完全轉變成葡萄糖會產生1.7lM的葡萄糖糖漿，然而，我們實驗室以前的糖化分析已經證明，野生型GA在55℃下會產生大約90％的理論最大葡萄糖產量(未顯示)。在55℃下沒有發現野生型和突變型酶的葡萄糖產生有明顯不同，但是，在65℃時突變型GA比野生型多生產8-10％，雖然兩種測試的酶均不能產生象55℃時那樣多的葡萄糖，可能是由於反應溫度升高有熱滅活的緣故。總之，這些數據顯示，在分析65℃-80℃之間抗不可逆熱滅活的能力時，S30P/G137A雙重突變型酶比任一種單突變GA更穩定。S-S/S30P組合的突變型GA也比S30P或S-S突變型GA穩定。S-S/S30P/G137A組合突變體是構建的GA變種中最穩定的，尤其是超過70℃在沒有單糖或多糖的緩衝系統中被滅活時。糖化分析顯示，在升高的溫度下，突變型酶的效率比野生型GA更好。重要的是，50℃分析時沒有一種組合突變型GA表現出酶活性減低。討論突變位點如實施例2所述，突變Asn20→Cys和Ala27→Cys在α螺旋l的C端和α螺旋l與2間的延伸環之間形成一個二硫鍵。設計S30P和G137A以減少酶的去摺疊構象熵來使酶穩定，它們分別是一系列脯氨酸取代(Xaa→Pro)和Gly→Ala突變中最具穩定化作用的。Ser30位於α螺旋1和2之間延伸環狀結構上Ⅱ型β轉角的第二個位置，而Gly137位於第四個α螺旋的中部。應當特別注意S30P的立置和形成突變的二硫鍵。位置20和27之間形成的二硫鍵；與位置30非常接近。形成突變的二硫鍵和S30P均能使GA穩定的事實提示，酶的這個區域對於不可逆熱滅活非常關鍵，它可能代表了對於熱滅活來說很重要的局部去摺疊區域。而且，以前的研究者和提出，在一級序列中脯氨酸周圍的四個胺基酸內不應工程改造加入二硫鍵[Balaji等，1989]。本實施例證明了這一規律並不是絕對的，因為巰基分析顯示S-S/S30P和S-/S30P/G137A組合突變體中形成了二硫鍵，而熱滅活研究顯示突變的穩定化效果是累積的。累積的穩定化作用申請人以前的研究工作示，將兩個穩定化突變組合起來不一定能使GA穩定[Chen等，1996]。然而，目前的研究(通過測定抗不可逆熱滅活的能力)證明，將穩定化突變組合(甚至是在蛋白質中彼此相距非常近的突變)起來能夠累積地使GA穩定。S30P/G137突變體表現出在低溫(65℃-70℃)時高於疊加穩定化作用，但在高溫(77.5℃-80℃)時低於疊加穩定化作用(圖5F和表7)。80℃,S30P/G137A組合突變體的滅活速度與S30P單突變型蛋白幾乎相同。說明這兩個區域對於低溫熱滅活均非常重要，但在高溫時滅活由其它過程控制。令人有些驚奇的是，將S30P與二硫鍵形成突變組合起來導致累積穩定化作用。這不僅僅是因為工程二硫鍵離工程脯氨酸非常近(如上所述)，而且還因為兩者尋靶蛋白質的同一區域(即α螺旋1和2之間的延伸環)。原先預計二硫鍵或S30P可使該區域最大程度地穩定，以及該部位的進一步穩定不會再使酶功能更加穩定。如同圖5B所見，事實並不是這樣。突變的組合在65℃-80℃之間所有溫度下均導致了差不多的疊加穩定化作用，S-S/S30P/G137A組合突變體在低溫(65℃-70℃)時並不比S30P/G137AGA更穩定，但卻在較高溫度(75℃-80℃)時稍微更穩定(圖5C和表7)。令人感興趣的是，S-S/S30PGA在高溫時比S30P/G137A更穩定。因此，這顯示出引入的二硫鍵高溫時使GA穩定特別有效。實施例5工業應用為了確定熱穩定化突變S30P/G137A和S-S/S30P/G137A能否在工業條件下增強GA性能，用野生型和突變型酶進行高溫糖化(圖6)。糖化分析結果顯示，突變型酶在65℃時的性能優於野生型；但在55℃時卻不，這可能因它們的穩定性增加而致。結論在65℃-80℃之間分析，不可逆熱滅活速度比任一單突變酶都低的事實，證明了S30P/G137A雙重突變體使GA累積地穩定化。同樣，S-S/S30P組合突變體也證明有累積的穩定化作用。S-S/S30P/G137A組合突變體比任何一個「雙重」突變體都更穩定，尤其在溫度超過70℃時。在35℃-68℃之間進行測定時，S-S/S30P組合突變體的活性與野生型相同，而S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突變體的酶活性增加10-20％。當S30P/G137A和S-S/S30P/G137A突變體GA在65℃、1.71M葡萄糖存在下滅活時，其熱滅活速度相對於野生型大約減少了3倍。另外，55℃糖化工業用底物MaltinM100時，這些突變型GA和野生型之間葡萄糖產量沒見差別，而在65℃時S30P/G137A和S-S/S30P/G137AGA生產了比野生型多8-10％的葡萄糖。實施例6提高選擇性的突變底物與GA亞位點1和2處帶電荷殘基間的相互作用在底物專一性方面起著至關重要的作用，因為催化位點位於這些位點之間。因此，設計突變，並分析以確定這些區域中能提高酶反應專一性的突變所在的殘基位置。此外，還設計了幾個具有熱穩定性以及能提高pH最適點的突變，篩選其選擇性。定點誘變定點誘變如本文上述的那樣進行。在IowaStateUniversityNucleicAcidFacility合成下列誘變性寡核苷酸引物5′-GGTCTCGGTGAGCCCAGGTTCAATGTCGAT-3′(Lys108→Arg；SEQIDNO:10),5′-GGTCTCGGTGAGCCCATGTTCAATGTCGAT-3′(Lys108→Met；SEQIDNO:11),5′-GAGGACACGTACTGGAACGGCAACCCG-3′(Tyr312→Trp；SEQIDNO:12)和5′-TACCCTGAGGACACGTACAACGGCAACGGCAACTCGCAGGGCAACCCGTGGTTCCTGTGC-3′(311-314Loop；SEQIDNO:13)，下劃線字母表示改變或加入的核苷酸。結果酶的動力學如表11所示，在pH4.4、0.05M乙酸鹽緩衝液中45℃水解G2至G7以及iG2的動力學參數kcat和Km列在表8中。311-314Loop突變體對所有α-(1,4)-鍵合底物的kcat值為50-80％，而對iG2隻有30％，對所有底物的Km值為50-75％。而Gly137→Ala/Ser30→ProGA對所有底物的kcat值通常比野生型GA高10-30％。Gly137→Ala/Ser30→ProGA對所有α-(1,4)-鍵合底物的Km值約為一半到兩倍，而對iG2則基本上達到野生型水平。工程改造成攜帶有三重突變(S-S/Gly137→Ala/Ser30→Pro)的GA對所有底物的kcat值通常在80-120％之間，而對所有底物的Km值為野生型GA的30-80％。S-SGA對於所有底物的kcat值為85-100％,Km值通常為90-110％。然而，S-SGA對於G5和G6的Km值為140％和190％。Tyr→312Trp突變、組合的Ser30→Pro/Gly137→Ala雙重突變、組合的S-S/Ser30→Pro/Gly137→Ala三重突變以及S-S工程化的GA的kcat/Km值分別為75-105％、60-110％、60-110％和60-120％。311-314LoopGA對所有α-(1,4)-鍵合底物的催化效率為85-120％，而對於iG2卻只有野生型GA的50％。表8顯示了野生型和突變型GA對G2至iG2的催化效率之比。具有311-314Loop突變和Lys108→Arg突變的工程化GA對α-(1,4)-和α-(1,6)-鍵合底物分別具有最高(240％)和最低(20％)的催化效率。具有Tyr312→Trp和S-S突變的工程化GA對於該比值分別顯示有50％和20％的增長。所有其它突變體的該比值較低，這表明α-(1,4)-水解能力相對於α-(1,6)-水解能力比野生型GA差。麥芽寡糖水解具有311-314Loop突變或S-S突變的工程化GA有最高的葡萄糖平均產量(圖7)。311-314LoopGA有最低的葡萄糖生產初始速度(35℃、45℃和55℃分別為野生型GA的64％、61％和82％)，這是因為比活性只有野生型GA的60％(數據未顯示)。葡萄糖濃度在達到最大值後降低，因為它轉變成寡糖。葡萄糖縮合反應分析在35℃、45℃和55℃時30％(w/v)葡萄糖縮合反應中的IG2濃度曲線。在所有三個溫度下，具有Lys108Arg突變的工程化GA有最高的iG2平衡濃度，而具有311-314Loop突變和S-S突變的GA有最低的iG2平衡濃度。Tyr312→Trp、Ser30→Pro/Gly137→Ala和S-S/Ser30→Pro/Gly137→AlaGA表現出與野生型GA基本相同的iG2平衡濃度。對於所有其它測試的工程化的熱穩定GA，即Ser436→Pro,S-S/Ser436→Pro,S-S/Gly137→Ala和Gly137→Ala/Ser436→Pro，它們達到的iG2平衡濃度均高於野生型GA。表9顯示在30％(w/v)葡萄糖縮合反應中iG2形成的初始速度。在所有三個測試的反應溫度下，S-S和311-314Loop突變型GA有最低的初始速度。在所有被測試的突變型GA中Lys108→Arg突變型GA在所有三個反應溫度下有最高的初始速度。除了Ser30→Pro/Gly137→Ala和S-S/Ser30→Pro/Gly137→Ala以外，所有測試的熱穩定GA在35℃具有比野生型GA高得多的初始速度，但是在55℃時，它們降低到只稍稍高於或是幾乎等於野生型GA的速度。就α-(1,6)-鍵的合成相對於α-(1,4)-鍵的水解的專一性研究計算30％(w/v)葡萄糖縮合反應中iG2產生初始速度與30％DE10麥芽糖糊精水解中葡萄糖形成初始速度之比，以評價酶就α-(1,6)-鍵合產物的合成相對於α-(1,6)-鍵合底物水解的選擇性。這些iG2/葡萄糖比值以及野生型和突變型GA的相對比值顯示在表9中。在野生型和所有突變型GA中、在所有反應溫度下K108R和S-S突變體分別表現出最高和最低的相對比值。因此，K108R對於α-(1,6)-鍵的專一性比α-(1,4)-鍵更高，而S-SGA對α-(1,4)-鍵比α-(1,6)-鍵更具親和力。311-314LoopGA在這三個溫度下也顯示出非常低的相對比值。實施例7疊加選擇性突變分析用本文上述的方法篩選疊加突變的選擇性，如表10、圖8和9中所示。酶的動力學觀察45℃、pH4.4下α-1,6-鍵合的異麥芽糖和α-1,4-鍵合的麥芽寡糊精(DP2-7)水解的動力學參數(kcat和Km)(列在表10中)。突變體Y175F具有活性。kcat和Km值分別為野生型的83-141％和106-171％(對於不同的測試底物)，催化效率為野生型的69-102％。突變型R241K也具有活性。突變體S411G具有高活性。其kcat和Km值分別為野生型的93-129％和83-203％(對於不同的測試底物)，催化效率為野生型的55-122％。突變體S411A有近似於野生型的催化效率比。突變體Y116W、R241K和S411G的催化效率比低於野生型GA。DE10麥芽糖糊精水解在55℃下，具有突變S411A的工程化GA在216小時時達到約95％的最高葡萄糖產量，相比較，野生型的產量大約90％(圖9)。除S411A以外所有的GA均能迅速達到它們的最高葡萄糖產量。S411A的葡萄糖產量隨時間延長緩慢增長。55℃下葡萄糖生產的初始速度是35℃時的5-8倍。葡萄糖縮合反應用葡萄糖縮合反應來研究野生型和突變型GA在葡萄糖高濃度下合成異麥芽糖的能力(圖8)。在DE10麥芽糖糊精的水解中採用相同濃度(2.64μM)的葡糖澱粉酶。在55℃，儘管野生型、R241K和Y175F的異麥芽糖產生初始速度不同，但是這三個突變型GA在最後時間點時異麥芽糖產生達到的濃度卻幾乎相同(圖8)，這說明異麥芽糖的產生接近平衡態。S411A和S411G的異麥芽糖產生遠遠低於野生型，而且幾乎是其在35℃時的線性。出乎意料的是，Y116W的異麥芽糖產生有不同(更低)於野生型的平衡態。55℃時的異麥芽糖產生初始速度比35℃時大5-7倍。R241K在55℃時的異麥芽糖產生初始速度低於野生型，而其從35到55℃的異麥芽糖產生初始速度增幅(約5倍)也低於野生型的增幅(約7倍)。Y116W、Y175F、S411A和S411G從35℃到55℃的異麥芽糖產生初始速度的增幅分別約為7、6和5倍。選擇性計算異麥芽糖產生初始速度(取自葡萄糖縮合反應)與葡萄糖產生初始速度(取自DE10麥芽糖糊精水解)之比，以評價α-1,6-鍵合產物的合成相對於α-1,4-鍵合底物的選擇性。該比值代表在標準化DE10麥芽糖糊精水解活性水平下GA合成異麥芽糖的能力。突變體Y175F、S411A和S411G的異麥芽糖產生初始速度與葡萄糖產生初始速度之比在35℃時分別比野生型低12％、35％和56％，而在55℃時分別比野生型低24％、60％和62％。R241K在35℃和55℃時的比值均與野生型非常接近。實施例8提供pH優化的突變用本文上述的方法篩選附加突變S411G、S411A、S411C、S411H、S411D以提高的pH最適點(如圖10、表11和12所示)。酶動力學表11中給出了α-1,4-鍵合的麥芽糖和麥芽七糖、α-1,6-鍵合的異麥芽糖在45℃、pH4.4下水解的動力學參數kcat和Km。突變體S411G葡糖澱粉酶比野生型更具活性，在測試的底物上，kcat和Km分別增加了13-30％和11-59％。催化效率(kcat/Km)為野生型的71-116％。突變體S411A保留了65-74％的野生型催化效率，其kcat稍有減少，而Km稍有增加。突變體S411C保留了54-73％的野生型催化效率，其kcat和Km值均減少。由於突變體S411H和S411D的kcat大幅度減少而Km增加，因此它們只有6-12％的野生型催化效率，故沒有測定其異麥芽糖水解的動力學參數。只有突變體S411H和S411D的麥芽糖和麥芽七糖水解的過渡態能量有較大的增量Δ(ΔG)(5.5-7.5kJ/mol)。過渡態能量較大的增量表明，將組氨酸或天冬氨酸引入位置411處會使過渡態中GA與底物的結合變得很不穩定。GA活性的pH依賴性根據在低濃度(小於0.2Km)和高濃度(高於10Km)麥芽糖下獲得的初始速度，計算野生型和突變型葡糖澱粉酶在不同pH值下水解麥芽糖的動力學參數kcat/Km和kcat。根據pH對麥芽糖水解的kcat/Km和kcat的影響來測定游離酶以及酶-底物複合物的pK值(表12)。儘管野生型GA在所有測試的pH值下催化效率(kcat/Km)高於所有突變型葡糖澱粉酶，但是突變體S411G和S411A在一些pH值下的kcat值高於野生型。非複合的和麥芽糖-複合的S411H和S411D表現出比野生型更窄的帶狀曲線。測定pH對野生型、S411G和S411AGA水解麥芽七糖的影響，以進一步用長度較長的底物(long-lengthsubstrabe)來研究酶-底物複合物的pK值和最適pH的變化。令人驚奇的是，不僅僅是S411G，而且S411A在最適pH下的活性也高於野生型。野生型GA的游離酶、麥芽糖-複合形式以及麥芽七糖-複合形式的pK1值(催化鹼的電離)分別為2.77、2.11和2.6。野生型GA的游離酶、麥芽糖-複合形式以及麥芽七糖-複合形式的pK2值(催化酸的電離)分別為5.80、5.85和6.78[Bakir等，1993,Hiromi等，1966,Sierks和Svensson,1994]。與野生型相比，S411G突變麥芽糖-複合形式以及麥芽七糖-複合形式的pK1值增加約0.6個單位，而S411G對任一酶-底物複合物的PK2均沒有影響，它只對游離酶的pK1和pK2有較小的影響。S411G對pK1和pK2的組合影響是使麥芽糖-復配合形式和麥芽七糖-複合形式的最適pH提高了約0.3單位。然而，S411G突變對游離酶的最適pH卻沒有影響。S411A和S411C對麥芽糖水解pH依賴性有相似的作用。S411A和S411C分別使游離酶和麥芽糖-複合形式的pK1增加0.3-0.5單位和1.21單位。令人驚奇的是，S411A和S411C也使麥芽糖-複合形式的pK2增加約0.5單位。另外，S411A使麥芽七糖-複合形式的pK1和pK2分別增加1.31和0.4單位。S411H使游離酶和麥芽糖-複合形式的pK1分別增加0.33和1.47單位；然而，它使游離酶和麥芽糖-複合形式的pK2分別減少0.79和1.16單位。S411D使游離酶和麥芽糖-複合形式的pK1分別增加0.36和1.23單位。S411D還使麥芽糖-複合形式的pK2減少0.32單位。對於野生型、S411G和S411A來說，麥芽七糖-複合形式的pK1、pK2和pHopt分別比相應的麥芽糖-複合形式高大約0.5、0.9和0.7單位。對於S411G和S411A，用長度較長的底物(麥芽七糖)獲得的pH最適點增量(與野生型相比)，與用長度較短的底物(麥芽糖)獲得的pH最適點增量幾乎相同。位置411處的所有5種突變體顯示出，酶-底物複合物的最適pH與野生型相比有0.15-0.87單位的變化(表12)(主要是由於pK1值增加)。與其它突變體相比，S411A是pH效果最佳的突變體。S411A使最適pH提高了0.84單位，並且還保留了高水平的催化活性(kcat)和催化效率(kcat/Km)。麥芽糖糊精10的水解通過28％(w/v)麥芽糖糊精的水解來研究在高濃度長底物時GA活性的pH依賴性。麥芽糖糊精10是平均(主要)聚合度為10的麥芽糖糊精混合物。測定11個不同的pH值下，麥芽糖糊精10水解時野生型和S411A葡糖澱粉酶產生的葡萄糖量，並用來計算不同pH值葡萄糖產生的初始速度(圖10)。葡萄糖的產量按照雙曲線增加。當pH值大於6.6時，S411A的葡萄糖產生初始速度高於野生型(圖10)。在整個申請中，列出了各出版物的作者、年份以及專利號。下面列出了出版物的全部引用內容。這些出版物和專利的公開內容全部納入本文作參考，以便更完整地描述本發明相關領域的技術狀況。本發明是以例舉的方式來描述，應當理解，採用的技術名詞是描述性的文字而非限制性的文字。顯然，根據上述內容可以對本發明作許多改進和變動。因此，應當理解這些改進和變動都在本發明所附的權利要求的範圍之內，本發明可以實施而非具體描述而已。表l突變型GA的Δ和Tm相對於野生型的變化GA形式ΔΔ(kJ/m01.)ΔTm(℃)Ser30→Pro1.61.7Asp345→Pro0.50.4Glu408→Pro-7.2-6.7表2經過或未經DTT還原的野生型和突變型GA中DTNB可滴定的巰基數總結酶[SH]/分子二硫鍵數目*DTT+DTT-野生型8.60.94A27C/N20C10.90.95A471C/T72C10.41.35*二硫鍵數目=([SH]/分子(DTT+)-[SH]/分子(DTT-))/2表5野生型和突變型GA的比活GA形式比活a(IU/mg)野生型21.1±0.1S30P/Gly137A24.0+1.2S-S/S30P21.2+0.5S-S/S30P/G137A24.5+0.2a三次或更多次試驗結果獲得的標準差表6野生型和突變型GA的巰基分析GA形式[蛋白質](μM)[SH](μM)a[SH]/[蛋白質]野生型1080.8S-S/S30P10111.1S-S/S30P/G137A10131.3a兩份分析結果的平均值表7熱滅活自由能的變化(ΔΔ)，以及加熱10分鐘後相對於野生型GA50％的酶被滅活時的溫度(ΔTm)GA形式ΔΔ(kJ/mol)ΔTm(℃)S30Pb1.61.7G137Ac0.81.2S-Sd1.21.4S30P/G137A4.53.5S-S/S30P3.53.2S-S/S30P/G137A4.43.9a在65℃下算得b莉自Allen等8c得自Chen等6d得自Li等7表8野生型和突變型GA在45℃、pH4.4、0.05M乙酸鹽中水解麥芽寡糖DP2-7(G2-G7)的動力學參數a標準差b過渡態能量的變化Δ(ΔG)=-RTln[(kcat/KM)mut/(kcat/KM)wt]表10野生型和突變型葡糖澱粉酶水解異麥芽糖和麥芽寡湖精DP2-7的動力學參數a在45℃、pH4.4、0.05M乙酸鈉緩衝液中測定b標準差c過渡態能量的變化Δ(ΔG)=-RTln[(kcat/KM)mut/(kcat/KM)wt]d未測定表11野生型和突變型葡糖澱粉酶水解異麥芽糖、麥芽糖和麥芽七糖的動力學參數a在45℃、pH4.4、0.05M乙酸鈉緩衝液中測定b標準差c過渡態能量的變化Δ(ΔG)=-RTln[(kcat/KM)mut/(kcat/KM)wt]d未測定表12野生型和突變型葡糖澱粉酶在45℃水解麥芽糖和麥芽七糖的pK值和最適pH表13在65℃計算所得相對於野生型GA的熱滅活自由能的增量(ΔΔ)a大於0表示熱穩定性增加表1430％(w/v)葡萄糖縮合反應中異麥芽糖形成初始速度與30％(w/v)麥芽糊精M100水解反應中葡萄糖形成初始速度的相對比值的減少量上述所有反應在55℃、pH4.4、0.05M乙酸鈉緩衝液中進行。a比值低於1.00表示α-(1,4)-相對於α-(1,6)-鍵合底物中的專一性增加。表15突變型葡糖澱粉酶的酶-底物複合物在45℃下水解麥芽糖的最適pH相對於野生型的增量a野生型葡糖澱粉酶的酶-底物複合物在45℃水解麥芽糖時的pH最適點為pH3.98。參考文獻Ahearn和Klibanov.「不可逆酶100℃滅活機制」(TheMechanismofIrreversibleEnzymeInactivationat100℃)《科學》(Science),228,1280(1985).Ahearn等人.蛋白工程改造寡聚酶熱穩定性控制」(ControlofOligomericEnzymeThermostabilitybyProteinEngineering.)《美國科學院院報》(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.),84,675(1987).Aleshin等人，1992.「Aspergillusawamori葡糖澱粉酶X100晶體結構」(CrystalstructureofglucoamylasefromAspergilhusawamorivar.X100to2.2-Aresolution.)《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)267:1929l-19298.Aleshin等人，1994.「阿卡波糖與葡糖澱粉酶的確定結構」(RefinedstructureforthecomplexofacarbosewithglucoamylasefromAspergillusawamorivar.X100to2.4-Aresolution.)《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)269:15631-15639.Aleshin等人，1994，《分子生物學》(J.Mol.Biol),238:575-591Aleshin等人，1996.「葡糖澱粉酶與麥芽寡糖的晶體學複合物」(Crystallographiccomplexesofglucoamylasewithmaltooligosaccharideanalogs:relationshipofstereochemicaldistortionsatthenonreducingendtothecatalyticmechanism.)《生物化學》(Biochemistry)35:8319-8328.Argos等人.「熱穩定性和蛋白結構」(ThermalStabilityandProteinStructure.)《生物化學》(Biochemistry),18,5698(1979).Bakir等人(1993)《蛋白質工程》(ProteinEng.)6:939-946Balaji等人1989.「通過導入二硫鍵和脯氨酸來改性蛋白穩定性」(Modificationofproteinstabilitybyintroductionofdisulfidebridgesandprolines；Geometriccriteriaformutationsites.)《生化生理通訊》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)160:109-114.Banks,W.和Greenwood,C.J.1971.「用葡萄糖氧化酶估計葡萄糖」(Thespecificestimationofglucoseusingglucoseoxidase.Strke.23:222-228.Boel等人.「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eGlyPheGlyGlnTrpLeuLeuAsp130135140AsnGlyTyrThrSerThrAlaThrAspIleValTrpProLeuValArg145150155160AsnAspLeuSerTyrValAlaGlnTyrTrpAsnGlnThrGlyTyrAsp165170175LeuTrpGluGluValAsnGlySerSerPhePheThrIleAlaValGln180185190HisArgAlaLeuValGluGlySerAlaPheAlaThrAlaValGlySer195200205SerCysSerTrpCysAspSerGlnAlaProGluIleLeuCysTyrLeu210215220GlnSerPheTrpThrGlySerPheIleLeuAlaAsnPheAspSerSer225230235240ArgSerGlyLysAspAlaAsnThrLeuLeuGlySerIleHisThrPhe245250255AspProGluAlaAlaCysAspAspSerThrPheGlnProCysSerPro260265270ArgAlaLeuAlaAsnHisLysGluValValAspSerPheArgSerIle275280285TyrThrLeuAsnAspGlyLeuSerAspSerGluAlaValAlaValGly290295300ArgTyrProGluAspThrTyrTyrAsnGlyAsnProTrpPheLeuCys305310315320ThrLeuAlaAlaAlaGluGlnLeuTyrAspAlaLeuTyrGlnTrpAsp325330335LysGlnGlySerLeuGluValThrAspValSerLeuAspPhePheLys340345350AlaLeuTyrSerAspAlaAlaThrGlyThrTyrSerSerSerSerSer355360365ThrTyrSerSerIleValAspAlaValLysThrPheAlaAspGlyPhe370375380ValSerIleValGluThrHisAlaAlaSerAsnGlySerMetSerGlu385390395400GlnTyrAspLysSerAspGlyGluGlnLeuSerAlaArgAspLeuThr405410415TrpSerTyrAlaAlaLeuLeuThrAlaAsnAsnArgArgAsnSerVal420425430ValProAlaSerTrpGlyGluThrSerAlaSerSerValProGlyThr435440445CysAlaAlaThrSerAlaIleGlyThrTyrSerSerValThrValThr450455460SerTrpProSerIleValAlaThrGlyGlyThrThrThrThrAlaThr465470475480ProThrGlySerGlySerValThrSerThrSerLysThrThrAlaThr485490495AlaSerLysThrSerThrSerThrSerSerThrSerCysThrThrPro500505510ThrAlaValAlaValThrPheAspLeuThrAlaThrThrThrTyrGly515520525GluAsnIleTyrLeuValGlySerIleSerGlnLeuGlyAspTrpGlu530535540ThrSerAspGlyIleAlaLeuSerAlaAspLysTyrThrSerSerAsp545550555560ProLeuTrpTyrValThrValThrLeuProAlaGlyGluSerPheGlu565570575TyrLysPheIleArgIleGluSerAspAspSerValGluTrpGluSer580585590AspProAsnArgGluTyrThrValProGlnAlaCysGlyThrSerThr595600605AlaThrValThrAspThrTrpArg610615(2)SEQIDNO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度7胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2:AsnGlyAsnGlyAsnSerGln15(2)SEQIDNO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度31鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3:CAGAGTCCGCGCCCGGCACCCAAGCACCGTC31(2)SEQIDNO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4:AAGTCCAGCGACACAGGTGTGACCTCCAACGAC33(2)SEQIDNO:5的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5:CGAGCGGAAAGCTGCGGGCCATCAGACTTGTC32(2)SEQIDNO:6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度32鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:6:CGTACTGCCATCCTGTGTAACATCGGGGCGGA32(2)SEQIDNO:7的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:7:ATCGGGGCGGACGGTTGTTGGGTGTCGGGCGCG33(2)SEQIDNO:8的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度25鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:8:GAGTATCGTGTGTACTGGCGGCACC25(2)SEQIDNO:9的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=″引物″(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:9:GGTCTCGGTGAGCCCAGGTTCAATGTCGAT30(2)SEQIDNO:10的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度30鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=「引物」(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:10:GGTCTCGGTGAGCCCATGTTCAATGTCGAT30(2)SEQIDNO:11的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度27鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=「引物」(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:11:GAGGACACGTACTGGAACGGCAACCCG27(2)SEQIDNO:12的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度60鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型其它核酸(A)描述/描述=「引物」(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:12:TACCCTGAGGACACGTACAACGGCAACGGCAACTCGCAGGGCAACCCGTGGTTCCTGTGC60權利要求1．一種真菌葡糖澱粉酶，它包括Asn20Cys與Ala27Cys連接的一對突變，此突變對的兩個成員間形成二硫鍵。2．根據權利要求1所述的葡糖澱粉酶，其中突變增加了熱穩定性，減少了異麥芽糖的形成。3．根據權利要求1所述的真菌葡糖澱粉酶，它包括選自表13的至少一個突變，其中該附加的突變提供了累積的熱穩定性。4．根據權利要求1所述的真菌葡糖澱粉酶，它還包括突變Ser30Pro、Gly137Ala，其中此附加的突變提供了累積的熱穩定性。5．根據權利要求1所述的真菌葡糖澱粉酶，它包括選自表14的至少一個突變，其中該附加的突變累積地減少了異麥芽糖的形成。6．根據權利要求1所述的真菌葡糖澱粉酶，它還包括311-314Loop突變，其中該突變累積地減少了異麥芽糖的形成。7．一種真菌葡糖澱粉酶，它包括311-314Loop突變。8．根據權利要求7所述的葡糖澱粉酶，其中該突變累積地減少了異麥芽糖的形成。9．根據權利要求7所述的真菌葡糖澱粉酶，它包括選自表14的至少一個突變，其中該附加的突變累積地減少了異麥芽糖的形成。10．一種真菌葡糖澱粉酶，它包括突變Ser411Ala。11．根據權利要求10所述的葡糖澱粉酶，其中該突變提高了pH最適點，減少了異麥芽糖的形成。12．根據權利要求10所述的真菌葡糖澱粉酶，它包括選自表15的至少一個突變，其中該突變使pH最適點累積性增加。13．根據權利要求10所述的真菌葡糖澱粉酶，它包括選自表14的至少一個突變，其中該突變累積地減少了異麥芽糖的形成。14．一種真菌葡糖澱粉酶，它包括Ser411Ala突變以及Asn20Cys與Ala27Cys連接的突變對，此突變對的兩個成員之間形成二硫鍵。15．根據權利要求14所述的葡糖澱粉酶，其中這些突變可增加熱穩定性、提高pH最適點，並減少異麥芽糖的形成。16．一種真菌葡糖澱粉酶，它包括Ser411Ala突變、311-314Loop突變，以及Asn20Cys與Ala27Cys連接的突變對，此突變對的兩個成員之間形成二硫鍵。17．根據權利要求16所述的葡糖澱粉酶，其中這些突變可增加熱穩定性、提高pH最適點，並減少異麥芽糖的形成。18．一種載體，它含有權利要求1-17所述的工程化葡糖澱粉酶的cDNA。19．一種宿主細胞，它用權利要求18所述的載體來轉化。20．根據權利要求1-17所述的真菌葡糖澱粉酶，其中葡糖澱粉酶是麴黴屬葡糖澱粉酶。21．根據權利要求20所述的葡糖澱粉酶，其中葡糖澱粉酶是泡盛麴黴葡糖澱粉酶。22．一種獲得熱滅活性降低的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法是通過設計突變來減少去摺疊構象熵，或增加α螺旋的穩定性，或增加二硫鍵、氫鍵、靜電作用、疏水作用、範德瓦爾斯作用和堆積緻密度。23．一種獲得異麥芽糖形成減少的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法是通過設計突變來降低對α-(1,6)-糖苷鍵的親和力。24．一種獲得pH最適點升高的真菌葡糖澱粉酶的方法，該方法是改變在催化性鹼Glu400微環境中該酶的極性、電荷分布和氫鍵。25．一種選擇真菌葡糖澱粉酶突變的方法，所述方法用於構建具有累積性突變的葡糖澱粉酶，此方法步驟如下設計並用定點誘變產生單個突變；篩選單個突變，選擇那些至少表現出pH最適點升高、不可逆熱滅活速度降低或異麥芽糖形成減少的突變；進行定點誘變，產生攜帶至少兩個分開的所選突變的酶，該酶的pH最適點升高，不可逆熱滅活速度降低，或是異麥芽糖形成量減少；和通過製得的至少攜帶有兩個分開的所選突變的酶，篩檢這些突變對pH最適點、熱穩定化作用或異麥芽糖形成減少的累積性疊加作用。全文摘要一種真菌葡糖澱粉酶，它包括Asn20Cys與Ala27Cys連接的一對突變，該突變對的兩個成員間形成二硫鍵。該突變使此酶增加了熱穩定性，減少了異麥芽糖的形成。也提供包括311—314Loop突變的真菌葡糖澱粉酶，該突變可減少異麥芽糖形成。還提供包括突變Ser411Ala的真菌葡糖澱粉酶，該突變能提高pH最適點，減少異麥芽糖的形成。還提供工程化葡糖澱粉酶中的突變組合以及與其它葡糖澱粉酶突變的組合，這些組合為工程化葡糖澱粉酶熱穩定性的增加，pH最適點的提高以及異麥芽糖形成的減少提供了累積性改進作用。文檔編號C12N1/21GK1238009SQ97196758公開日1999年12月8日申請日期1997年7月24日優先權日1996年7月24日發明者M·艾倫,T－Y·方,Y·李,H－L·劉,H－M·陳,P·科蒂紐,R·洪扎特科,C·福特申請人:衣阿華州立大學研究基金會股份有限公司