-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法及其應用的製作方法

2023-05-04 22:43:16

-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種TiO2-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法及其應用，屬於生物傳感檢測【技術領域】。基於TiO2-CdSe複合物作為光電信標物質，CdSe量子點以其量子尺寸效應、介電效應及表面積效應，增強了TiO2的光電性能，可實現對實體組織目標DNA及其管家基因的靈敏、特異及快速檢測，本發明製備的傳感器具有設備簡單、成本低、易於微型化和集成化的優點，易於推廣。
【專利說明】—種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法及其應用，該傳感器用於生物組織DNA的檢測，屬於生物傳感檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002]縱觀適配體傳感器的發展，可以發現大多數課題組對於DNA傳感器的研究主要集中在短鏈DNA(20-60bp)，同時這些DNA大多是根據需要，事先根據一定的規則進行設計，然後由生物公司代工合成，但DNA片段並非實際存在，應用價值不大。若要使DNA生物傳感器用於實際檢測，則被檢測的DNA應該是真實存在的，這就需要從實際問題中找尋需要檢測、識別的DNA，然後根據需要，設計傳感器，應用於實踐。
[0003]鑑於此，本專利將利用T12-CdSe納米複合材料的信號放大作用及體系中光致電信號的強度變化，對真實生物細胞經培養後抽提的DNA目標片段進行檢測。本發明具有成本低、製備簡單、靈敏度高、特異性好、檢測快速等優點，克服了目前DNA檢測方法局限於純生物領域的弊端。


【發明內容】

[0004]本發明的目的之一是基於賴氨酸對DNA的生物特異親和性及T12-CdSe納米複合材料，製備了一種特異性強，靈敏度高的光電生物傳感器；
本發明的目的之二是將該傳感器用於實體組織抽提DNA的檢測。
[0005]本發明的技術方案如下:
1.一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法
(1)將1.0 cmX2.5 cm的長方形ITO導電玻璃依次用丙酮、超純水、乙醇超聲清洗30min,純氮吹乾，將其作為工作電極，鉬絲為對電極，參比電極為飽和甘汞電極，以0.05、.2V/s掃速，在-1.5?2.5 V電位範圍，在含有5 X 10_3 mol/L的L-賴氨酸、pH為6.0?9.0的PBS中，利用循環伏安技術，於工作電極表面電聚合L-賴氨酸，形成一層聚L-賴氨酸，真空乾燥器中保存；
(2)滴塗2?18μ?的T12-固態CdSe複合物或2?18μ?的T12-液態CdSe複合物到
(I)修飾的工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(3)繼續滴塗10?20μ?、5?50 Pg/mL的目標DNA的上遊引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的上遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(4)繼續滴塗10?20μ?、5?50 Pg/mL的目標DNA的下遊引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的下遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾，製得一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器。
[0006]2.上述T12-固態CdSe複合物和T12-液態CdSe複合物製備
(I)T12的製備 0.ΟΓΟ.03 mol的鈦酸丁酯溶於30?90 ml乙醇中，逐滴加入至l(T30mL超純水中，攪拌12 min，將得到的混合物轉移至高壓釜中，200 °C下反應10 h，用超純水和無水乙醇分別清洗4?8次，80 °C下真空乾燥12 h，製得T12;
(2)CdSe的製備
移取0.6?1.0 mL的巰基乙酸加入到60 mL超純水中混勻，將其加入到盛有CdCl2溶液的250 mL三口燒瓶中，用I mol/L NaOH調pH至10，加入8?12 mL Na2SeSO3溶液，加熱至沸騰，回流4 h，製得液態CdSe ;將液態CdSe加熱乾燥，製得固態CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是將I?20 mmol Se和5?15 mmol Na2SO3加入到50mL超純水中，90°C反應3 h，過濾去渣，製得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口燒瓶中，在攪拌狀態下，將1?2 g CdCl2.2.5H20溶於40 mL超純水製得；
(3)T12-固態CdSe複合物的製備
將0.002?0.006 g T12,0.002?0.006 g固態CdSe於5 ml的離心管中，加入4 mL超純水，震蕩8?12 h, 11000轉/min、23°C下離心15 min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水，超聲，製得T12-固態CdSe複合物；
(4)T12-液態CdSe複合物的製備
0.002?0.006 g T12與2?6mL液態CdSe於10 mL的離心管中，震蕩8?12 h，11000轉/min離心15 min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-液態CdSe複合物。
[0007]3.目標DNA及其管家基因的檢測步驟
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器為工作電極，在1(T50 mL、pH7?9的PBS，0.Γθ.3 mmol/L的抗壞血酸緩衝溶液中進行測試；
(2)用時間-電流法對目標DNA標準溶液或管家DNA標準溶液進行檢測，輸入電壓為0.1 V，取樣間隔20 S，取樣時間20 S，運行時間400 S，光源選擇365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,記錄電流變化,繪製工作曲線；
(3 )將待測樣品代替目標DNA標準溶液或管家DNA標準溶液，按照工作曲線的繪製方法進行測定。
[0008]本發明的成果:
(I )L-賴氨酸有良好的熱穩定性、生物親和性，本發明中將L-賴氨酸進行電聚合，修飾於ITO電極表面，提供了可保持生物活性的固載DNA等生物大分子的方法，同時該方法不需經過預處理，電極選擇性、靈敏度和重現性較好，電極響應快，測得線性範圍為3.5 pmol/L?30 nmol/L,檢測限為 1.2 pmol/L。
[0009](2)本發明使用T12做為光電信標物質之一，拓展了 T12的使用範疇，同時利用CdSe量子點顯著的量子尺寸效應及小的粒子尺寸，增強了傳感器的光電性能。
[0010](3)本發明所檢測DNA均從實際生物組織中提取，實用價值高。
[0011]【具體實施方式】:
為進一步說明，結合一下實施例具體說明:
實施例1 一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法 (1)將1.0 cmX2.5 cm的長方形ITO導電玻璃依次用丙酮、超純水、乙醇超聲清洗30min,純氮吹乾，將其作為工作電極，鉬絲為對電極，參比電極為飽和甘汞電極，以0.05、.2乂/8掃速，在-1.5?2.5 V電位範圍，在含有5 X 10_3 mol/L的L-賴氨酸、pH為6.0的PBS中，利用循環伏安技術，於工作電極表面電聚合L-賴氨酸，形成一層聚L-賴氨酸，真空乾燥器中保存；
(2)滴塗2PL的T12-固態CdSe複合物或2PL的T12-液態CdSe複合物到(I)修飾的工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(3)繼續滴塗10μ?、5 Pg/mL的目標DNA的上遊引物或10 μ?、10 Pg/mL管家DNA的上遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(4)繼續滴塗10μ?、5 Pg/mL的目標DNA的下遊引物或10 μ?ΛΟ Pg/mL管家DNA的下遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾，製得一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器。
[0012]實施例2 —種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法
(1)將1.0 cmX2.5 cm的長方形ITO導電玻璃依次用丙酮、超純水、乙醇超聲清洗30min,純氮吹乾，將其作為工作電極，鉬絲為對電極，參比電極為飽和甘汞電極，以0.05、.2乂/8掃速，在_1.5?2.5 V電位範圍，在含有5 X 10_3 mol/L的L-賴氨酸、pH為7.4的PBS中，利用循環伏安技術，於工作電極表面電聚合L-賴氨酸，形成一層聚L-賴氨酸，真空乾燥器中保存；
(2)滴塗10μ?的T12-固態CdSe複合物或ΙΟμ?的T12-液態CdSe複合物到(I)修飾的工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(3)繼續滴塗15μ?、25 Pg/mL的目標DNA的上遊引物或15 μ?、15Pg/mL管家DNA的上遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(4)繼續滴塗15μ?、30 Pg/mL的目標DNA的下遊引物或15 μ?、16 Pg/mL管家DNA的下遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾，製得一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器。
[0013]實施例3 —種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法
(1)將1.0 cmX2.5 cm的長方形ITO導電玻璃依次用丙酮、超純水、乙醇超聲清洗30min,純氮吹乾，將其作為工作電極，鉬絲為對電極，參比電極為飽和甘汞電極，以0.05、.2乂/8掃速，在_1.5?2.5 V電位範圍，在含有5 X 10_3 mol/L的L-賴氨酸、pH為9.0的PBS中，利用循環伏安技術，於工作電極表面電聚合L-賴氨酸，形成一層聚L-賴氨酸，真空乾燥器中保存；
(2)滴塗18μ?的T12-固態CdSe複合物或18μ?的T12-液態CdSe複合物到(I)修飾的工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(3)繼續滴塗20μ?、50 Pg/mL的目標DNA的上遊引物或20 μ?、20 Pg/mL管家DNA的上遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾；
(4)繼續滴塗20μ?、50 Pg/mL的目標DNA的下遊引物或20 μ?、20 Pg/mL管家DNA的下遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾，製得一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器。
[0014]實施例4 T12-固態CdSe複合物和T12-液態CdSe複合物製備 (1)T12的製備
0.01 mo I的鈦酸丁酯溶於30ml乙醇中，逐滴加入至1mL超純水中，攪拌12 min,將得到的混合物轉移至高壓釜中，200 °C下反應10 h，用超純水和無水乙醇分別清洗4次，80°C下真空乾燥12 h，製得T12;
(2)CdSe的製備
移取0.6 mL的巰基乙酸加入到60 mL超純水中混勻，將其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口燒瓶中，用I mol/L NaOH調pH至10，加入8 mL Na2SeSO3溶液，加熱至沸騰，回流4h，製得液態CdSe ;將液態CdSe加熱乾燥，製得固態CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是將I mmol Se和10 mmol Na2SO3加入到50 mL超純水中，90 V反應3 h，過濾去渣，製得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口燒瓶中，在攪拌狀態下，將1.5 g CdCl2.2.5H20溶於40 mL超純水製得；
(3)T12-固態CdSe複合物的製備
將0.004 g T12,0.004 g固態CdSe於5 ml的離心管中，加入4 mL超純水，震蕩10h, 11000轉/min、23°C下離心15 min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-固態CdSe複合物；
(4)T12-液態CdSe複合物的製備
0.004 g T12與4mL液態CdSe於10 mL的離心管中，震蕩10 h，11000轉/min離心15min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-液態CdSe複合物。
[0015]實施例5 T12-固態CdSe複合物和T12-液態CdSe複合物製備
(1)T12的製備
0.02 mol的鈦酸丁酯溶於60 ml乙醇中，逐滴加入至20 mL超純水中，攪拌12 min，將得到的混合物轉移至高壓釜中，200 °C下反應10 h，用超純水和無水乙醇分別清洗6次，80°C下真空乾燥12 h，製得T12;
(2)CdSe的製備
移取0.8mL的巰基乙酸加入到60 mL超純水中混勻，將其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口燒瓶中，用I mol/L NaOH調pH至10，加入10 mL Na2SeSO3溶液，加熱至沸騰，回流4 h，製得液態CdSe ;將液態CdSe加熱乾燥，製得固態CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是將10 mmol Se和10 mmol Na2SO3加入到50mL超純水中，90 V反應3 h，過濾去渣，製得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口燒瓶中，在攪拌狀態下，將1.5 g CdCl2.2.5H20溶於40 mL超純水製得；
(3)T12-固態CdSe複合物的製備
將0.003 g T12,0.003 g固態CdSe於5 ml的離心管中，加入4 mL超純水，震蕩10h, 11000轉/min、23°C下離心15 min,分離得到固體，將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-固態CdSe複合物；
(4)T12-液態CdSe複合物的製備
0.003 g T12與4mL液態CdSe於10 mL的離心管中，震蕩10 h，11000轉/min離心15min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-液態CdSe複合物。
[0016]實施例6 T12-固態CdSe複合物和T12-液態CdSe複合物製備
(1)T12的製備
0.03 mol的鈦酸丁酯溶於90 ml乙醇中，逐滴加入至30mL超純水中，攪拌12 min,將得到的混合物轉移至高壓釜中，200 °C下反應10 h，用超純水和無水乙醇分別清洗8次，80°C下真空乾燥12 h，製得T12;
(2)CdSe的製備
移取1.0 mL的巰基乙酸加入到60 mL超純水中混勻，將其加入到盛有CdCl2溶液的250mL三口燒瓶中，用I mol/L NaOH調pH至10，加入12 mL Na2SeSO3溶液，加熱至沸騰，回流4 h，製得液態CdSe ;將液態CdSe加熱乾燥，製得固態CdSe ；
所述Na2SeSO3溶液是將20 mmol Se和15 mmol Na2SO3加入到50 mL超純水中，90 °C反應3 h，過濾去渣，製得Na2SeSO3溶液；
所述CdCl2溶液是在250 mL三口燒瓶中，在攪拌狀態下，將2 g CdCl2.2.5H20溶於40mL超純水製得；
(3)T12-固態CdSe複合物的製備
將0.006 g T12, 0.006 g固態CdSe於5 ml的離心管中，加入4 mL超純水，震蕩12h, 11000轉/min、23°C下離心15 min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-固態CdSe複合物；
(4)T12-液態CdSe複合物的製備
0.006 g T12與6mL液態CdSe於10 mL的離心管中，震蕩12 h，11000轉/min離心15min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-液態CdSe複合物。
[0017]實施例7目標DNA的檢測
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器為工作電極，在10 mL、pH 7的PBS，0.lmmol/L的抗壞血酸緩衝溶液中進行測試；
(2)用時間-電流法對目標DNA標準溶液進行檢測，輸入電壓為0.1 V，取樣間隔20 S，取樣時間 20 s,運行時間 400 s,光源選擇 365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,記錄電流變化,繪製工作曲線；
(3)將待測樣品代替目標DNA標準溶液，按照工作曲線的繪製方法進行測定；
(4)線性範圍3.5 pmol/L?25 nmol/L，檢測限為 1.2 pmol/L。
[0018]實施例8管家基因的檢測
(1)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器為工作電極，在50 mL、pH 9的PBS，0.3 mmol/L的抗壞血酸緩衝溶液中進行測試；
(2)用時間-電流法對目標DNA標準溶液或管家DNA標準溶液進行檢測，輸入電壓為0.1 V，取樣間隔20 S，取樣時間20 S，運行時間400 S，光源選擇365 nm、385 nm、405 nm、430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,記錄電流變化,繪製工作曲線；
(3)將待測樣品代替管家DNA標準溶液，按照工作曲線的繪製方法進行測
(4)線性範圍為1.5 pmol/L?15 nmol/L,檢測限為 0.68 pmol/L。
【權利要求】
1.一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器的製備方法，其特徵包括以下步驟: (1)將1.0 cmX2.5 cm的長方形ITO導電玻璃依次用丙酮、超純水、乙醇超聲清洗30min,純氮吹乾，將其作為工作電極，鉬絲為對電極，參比電極為飽和甘汞電極，以0.05、.2V/s掃速，在-1.5?2.5 V電位範圍，在含有5 X 10_3 mol/L的L-賴氨酸、pH為6.0?9.0的PBS中，利用循環伏安技術，於工作電極表面電聚合L-賴氨酸，形成一層聚L-賴氨酸，真空乾燥器中保存； (2)滴塗2?18μ?的T12-固態CdSe複合物或2?18 μ?的T12-液態CdSe複合物到(I)修飾的工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾； (3)繼續滴塗10?20μ?、5?50 Pg/mL的目標DNA的上遊引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的上遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾； (4)繼續滴塗10?20μ?、5?50 Pg/mL的目標DNA的下遊引物或10?20 μ?、1(Γ20 Pg/mL管家DNA的下遊引物到工作電極表面，4 °C冰箱中晾乾，製得一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器。
2.根據權利要求1所述的一種T12-CdSe複合納米材料光電生物體傳感器的製備方法，所述T12-固態CdSe複合物和T12-液態CdSe複合物，製備步驟如下: (1)T12的製備 0.0Γ0.03 mol的鈦酸丁酯溶於30?90 ml乙醇中，逐滴加入至l(T30mL超純水中，攪拌.12 min，將得到的混合物轉移至高壓釜中，200 °C下反應10 h，用超純水和無水乙醇分別清洗4?8次，80 °C下真空乾燥12 h，製得T12; (2)CdSe的製備 移取0.6?1.0 mL的巰基乙酸加入到60 mL超純水中混勻，將其加入到盛有CdCl2溶液的250 mL三口燒瓶中，用I mol/L NaOH調pH至10，加入8?12 mL Na2SeSO3溶液，加熱至沸騰，回流4 h，製得液態CdSe，將液態CdSe加熱乾燥，製得固態CdSe ； 所述Na2SeSO3溶液是將I?20 mmol Se和5?15 mmol Na2SO3加入到50 mL超純水中，90°C反應3 h，過濾去渣，製得Na2SeSO3溶液； 所述CdCl2溶液是在250 mL三口燒瓶中，在攪拌狀態下，將1?2 g CdCl2.2.5H20溶於.40 mL超純水製得； (3)T12-固態CdSe複合物的製備 將0.002?0.006 g T12,0.002?0.006 g固態CdSe於5 ml的離心管中，加入4 mL超純水，震蕩8?12 h, 11000轉/min、23°C下離心15 min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水，超聲，製得T12-固態CdSe複合物； (4)T12-液態CdSe複合物的製備 . 0.002?0.006 g T12與2?6 mL液態CdSe於10 mL的離心管中，震蕩8?12 h，11000轉/min離心15 min,分離得到固體,將固體加入I mL超純水,超聲,製得T12-液態CdSe複合物。
3.如權利要求1所述的製備方法製備的一種T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器，其特徵在於，用於目標DNA及其管家基因的檢測，檢測步驟如下: (I)使用電化學工作站以三電極體系進行測試，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極，所製備的T12-CdSe納米複合材料光電生物傳感器為工作電極，在1(T50 mL、pH.7?9的PBS，0.Γθ.3 mmol/L的抗壞血酸緩衝溶液中進行測試； (2)用時間-電流法對目標DNA標準溶液或管家DNA標準溶液進行檢測，輸入電壓為.0.1 V，取樣間隔20s，取樣時間20 S，運行時間400 S，光源選擇365 nm、385 nm、405 nm、.430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm,記錄電流變化,繪製工作曲線； (3 )將待測樣品代替目標DNA標準溶液或管家DNA標準溶液，按照工作曲線的繪製方法進行測定。
【文檔編號】G01N27/416GK104316460SQ201410470726
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月16日 優先權日:2014年9月16日
【發明者】龐雪輝, 閆濤, 魏琴, 朱寶存, 範大偉, 馬洪敏 申請人:濟南大學