高產酯的東方伊薩酵母菌、其組合物和應用的製作方法

2023-05-05 00:16:21

專利名稱：高產酯的東方伊薩酵母菌、其組合物和應用的製作方法
高產酯的東方伊薩酵母菌、其組合物和應用發明所屬領域
本發明屬於白酒釀造領域，具體地說，本發明涉及高產酯的東方伊薩酵母菌、含該菌的釀酒菌劑組合物，及該酵母菌和其組合物在白酒釀造中的應用
背景技術：
中國白酒香味物質種類繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、縮醛、芳香族化合物、含氮化合物、 含硫化合物、醚類、內酯類等化合物達數百種之多(莊名揚，釀酒，2007，34 (2) :109-113)。 中國白酒風味物質的形成，是微生物代謝的產物，同時也是原料中基本組分及非基本組分， 在各類生物酶的直接或間接催化下的生物合成、非酶促化學反應和熱降解反應等多種因素共同作用結果。白酒的風味與釀造微生物及釀造工藝也有直接關係。釀造基酒質量的聞低對廣品的最終質量的好壞起決定性的作用。白酒釀造中的生香酵母又稱產酯酵母，主要屬於產膜酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發酵產香的重要菌種(熊子書，釀酒科技，2002，5 :19-21)。濃香型白酒以己酸乙酯為主的複合香，是由梭狀芽孢桿菌，俗稱己酸菌的作用，產於泥質發酵老窖或人工培養泥窖中，發酵周期長；清香型白酒以醋酸乙酯為主體香，在小曲、麩曲或液態法白酒中添加生香酵母，在發酵過程中生成醋酸及其乙酯。酒精發酵過程中酯的產生量與特殊的酵母菌種類有密切關係。白酒發酵要求釀酒菌劑具有產酯率高、產酒精率高並耐高溫。重量和質量相同的原料使用不同的釀酒菌劑，形成不同的酒精產量和酯含量。好的釀酒菌劑使同樣的原料酒精產量高、富含酯類，並使白酒純香。但傳統大曲雖然產酯率高，產酒率卻較低，特別是大曲構成成份複雜，使白酒質量不穩定；而單個酵母菌或釀酒菌劑組合物不耐高溫，雖發酵產酒率高但產酯率低，白酒品質較差。酒精發酵過程中酯的產生量與特殊的酵母菌種類有密切關係。乙酸乙酯的產生量高低被普遍認為是依賴於酯的合成和酯的水解之間的平衡。在最新審定通過的中國兼香型白酒國家標準中，總酯含量(以乙酸乙酯計)是劃分白酒等級的重要指標，優級酒總酯含量比一級酒高I倍(熊小毛等，2009)。如何提高白酒中總酯含量，提高白酒等級是白酒企業和研究者面對的技術難題。在中國專利CN201010520135. 2中公開了一株東方伊薩酵母菌Z1，核菌耐42°C高溫，液體發酵乙酸乙酯產量達229. 06毫克/升，液體發酵產物酒精度可達5. 2%。但總酯含量和發酵產物酒精度仍然偏低，在品酒感覺中，採用100分制，品酒分數在75-88，口感不甚
理相發明技術內容
本發明的一個目的是提供一種新的高產酯東方伊薩酵母菌株，該菌株不但耐高溫，更重要的是高產酯和發酵產物酒精度高，使用該菌株發酵生產白酒，具有高產酯率和高酒精產率，品酒分數在90-95，並形成濃醬兼香型白酒獨特風味。本發明的另一個目的是提供一種含有東方伊薩酵母菌的釀酒菌劑組合物。
本發明的再一個目的是提供製備釀酒菌劑組合物的方法。本發明的再一個目的是提供東方伊薩酵母菌株在白酒發酵中的應用。本發明的再一個目的是提供釀酒菌劑組合物在白酒發酵中的應用。本發明公開了一株新的高產酯東方伊薩酵母菌，其特徵在於，該菌株為東方伊薩酵母Z19株(Issatchenkia orientalis Z19),保藏於湖北省武漢市武漢大學校內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011499，保藏日期是2011年12月31日。東方伊薩酵母Z19株從湖北白雲邊酒池分離經篩選獲得。該菌株有如下特徵東方伊薩酵母Z19 株可耐42°C高溫，液體發酵乙酸乙酯產量高達270. 29毫克/升，液體發酵產物酒精度可達
5.98%。即東方伊薩酵母Z19株不但具有耐高溫性能，更具有乙酸乙酯產力強，且較強的產酒精能力。使用該菌株發酵生產白酒，具有高產酯率和高酒精產率，品酒分數在90-95，並形成濃醬兼香型白酒獨特風味。東方伊薩酵母Z19株形態特徵是菌落乳白色、形狀為規則圓形、表面較平坦、乾燥，培養較長時間後，芽生孢子延長呈梳妝交錯，假菌絲分支分布，細胞呈圓形或橢圓形。東方伊薩酵母Z19株生化特徵是可發酵利用果糖，蔗糖；不能發酵利用D-半乳糖，纖維二糖，綿子糖，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-海藻糖，L-鼠李糖，L-山梨糖和D-木糖。東方伊薩酵母Z19株耐高溫及生長特徵與Zl相似YPD平板上劃線接種，分別在 33°C至42°C下培養均生長良好。在37°C培養時，菌株Z19在YPD培養基中延遲期明顯比生香產酯酵母菌短，在早期的生長中具有明顯的優勢，而市售生香產酯酵母菌一安琪生香活性乾酵母具有較長的延遲期。東方伊薩酵母Z19株耐酒精能力特徵是接種菌種到酒精度0-14%的YPD液體培養基中，30°C搖床培養24小時，OD63tol測定酵母菌的生長濃度，東方伊薩酵母Z19株最高耐受酒精度為10%，表明酵母菌Z19的耐酒精能力好。東方伊薩酵母Z19株26S rDNA D1/D2區域基因序列分析顯示東方伊薩酵母Z19 株與東方伊薩酵母NRRL Y-5396株的同源性超過99%。東方伊薩酵母Z19株可耐42°C高溫，液體發酵乙酸乙酯產量高達270. 29毫克/ 升，液體發酵產物酒精度可達5. 98%。本發明還公開了一種含東方伊薩酵母Z19株菌的釀酒菌劑組合物，該釀酒菌劑組合物主要成份是東方伊薩酵母Z19株及胞外產物。優先地，本發明還公開了一種含東方伊薩酵母Z19株釀酒菌劑組合物，其特徵在於它含有下列組份(體積比)
東方伊薩酵母Z1960%
酒精酵母40%
其中東方伊薩酵母為CCTCC M2011499，酒精酵母為AS2. 300。酒精酵母AS2. 300為常用普通微生物菌種，登載於中國普通微生物菌種保藏管理中心目錄，處於公開狀態，科學工作者可向中國普通微生物菌種保藏管理中心索取。本發明還公開了製備固態釀酒菌劑組合物的方法，該方法包括如下步驟
I)菌種活化分別接種東方伊薩酵母Z19株和酒精酵母AS2. 300於滅菌的糖度為12巴林的麥芽汁或米曲汁三角瓶培養基中，28 30°C搖床培養18-24天；2)固體培養固體培養的配料是麩皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液潤料，加1%濃硫fe，蒸煮冷散後，將I)中活化培養的2種酵母囷液按3 :2體積比混合接種後裝盒,保持室溫20 0C左右.品溫25 °C左右，培養發酵2天；
3)真空乾燥對發酵後的固體樣品在45°C進行真空乾燥處理，樣品含水率低於10%後真空包裝。在對產品進行活菌計數時，東方伊薩酵母Z19株和酒精酵母AS2. 300的比例是3 : 2。本發明還公開了新的高產酯東方伊薩酵母菌Z19株在白酒釀造中的應用。本發明還公開了釀酒菌劑組合物在白酒釀造中的應用。本發明的優點
I、本發明提供的東方伊薩酵母Z19株是一株新的菌株，該菌株不但可耐42°C高溫，液體發酵乙酸乙酯產量高達270. 29毫克/升，液體發酵產物酒精度可達5. 98%，分別比東方伊薩酵母Zl提高18 %和15%，即東方伊薩酵母Z19株不但耐42°C高溫，更具有高乙酸乙酯產力和較強的產酒精能力。2)使用東方伊薩酵母Z19株發酵生產白酒，通過品酒，品酒分數在90-95，較高於東方伊薩酵母Zl的75-88，並形成濃醬兼香型白酒獨特風味，優級酒率達到100%
3、東方伊薩酵母Z19株與酒精酵母混合製備釀酒菌劑，在目前通用的白酒固態發酵物料中添加釀酒菌劑進行發酵製酒，與東方伊薩酵母Zl株製備釀酒菌劑對比出酒率提高了 I. 4%,同時原酒中總酯的含量增加了 4. 4%，改善口感作用明顯。


圖I是東方伊薩酵母菌Z19株26S rDNA D1/D2區序列系統發育樹圖
具體實施例方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用於說明本發明，而不能限制本發明的保護範圍。在本發明中涉及的微生物菌種情況如下
東方伊薩酵母Z19株orientalis Z19),保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011499
對照菌株東方伊薩酵母Zl株，在中國專利CN201010520135. 2中進行了公開，
公開日2011年6月22日，任何符合要求的研究者可從保藏機構索取。酒精酵母AS2. 300為常用普通微生物菌種，登載於中國普通微生物菌種保藏管理中心目錄，處於公開狀態，科學工作者可向中國普通微生物菌種保藏管理中心索取。 安琪耐高溫釀酒酵母TRADY為市場流通商品。東方伊薩酵母Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396 和釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae CCTCC AY92003為常用普通微生物菌種,分別登載於美國農業部菌種保藏中心和中國典型培養物保藏中心目錄，處於公開狀態，科學工作者可向保藏中心索取。實施例實施例I 東方伊薩酵母Z19的分離與鑑定 I. I樣品、培養基與試劑
樣品白雲邊酒廠釀造車間已經高溫堆積，即將入池的酒醅。培養基 I曲汁培養基。配製方法，以配製200 mL曲汁培養基為例)取酒醅20 g,加水200 mL，煮沸30 min,過濾,補水定容至200 mL，加鹿糖4 g，115°C滅菌30 min。( !
牛肉膏蛋白腖培養基(YPD)。如配固體培養基則另外添加總重I. 5%的瓊脂粉。Taq DNA聚合酶和dNTP購自上海申能博彩公司。DL2000 marker購自大連寶生物公司。PCR引物16S-27F，16S-1492R委託北京奧科生物技術公司合成。I. 2東方伊薩酵母Z19株的分離從白雲邊酒廠堆積發酵料，包括堆積後高溫酒醅、剛混合的酒醅和堆積後中等溫度的酒醅中取樣，將樣品活化後加入到PH4. 5-5. O的YPD 液體培養基中，轉速200rpm，溫度30°C時富集培養48小時，然後取100 μ I經過一定梯度稀釋後的培養液塗布到YPD培養基固體平板上，30°C培養48小時後，挑取典型酵母形態的單菌落，再在相同培養基固體平板上重複劃線純化三次後，4°C保存。然後通過糧食水解液發酵實驗檢驗這些分離出來的菌株在發酵過程中的乙醇產率、乙酸乙酯產率，最後根據發酵試驗結果篩選出產酒精能力和產酯率均較高的菌株25株。本發明人將分離的一株新的東方伊薩酵母菌Z19株(Issatchenkia orientalis Z19)保藏於湖北省武漢市武漢大學校內的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M2011499。保藏日為2011年12月31日。I. 3 東方伊薩酵母菌Z19株的鑑定通過形態特徵觀察、生理生化測定及26S rDNA D1/D2區域基因序列分析結果對Z19進行鑑定。在鑑定中，本實驗選擇安琪耐高溫釀酒酵母 TRADY、東方伊薩酵母orientalis NRRL Y-5396，和 AS2. 300 菌株作為對照菌株。安琪耐高溫釀酒酵母TRADY為市場流通商品；東方伊薩酵母 orientalis NRRL Y-5396和釀酒酵母AS2. 300為常用普通微生物菌種，分別登載於美國農業部菌種保藏中心和中國普通微生物菌種保藏管理中心索取目錄，處於公開狀態，科學工作者可向保藏中心索取。I. 3. I東方伊薩酵母菌Z19株形態特徵觀察菌落乳白色、形狀為規則圓形、表面較平坦、乾燥，培養較長時間後，芽生孢子延長呈梳妝交錯，假菌絲分支分布，細胞呈圓形或橢圓形。I. 3. 2通過26S rDNA D1/D2區域序列分析進行系統發育地位鑑定
用酵母菌基因組DNA提取試劑盒(BioFlux杭州博日科技有限公司提供)提取Z19的全DNA，然後以提取出來的全DNA為模板，進行PCR擴增，正向引物NLl 5』 -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3』，反向引物 NL4 :5』 - GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3』。按以下的反應條件共進行30個循環94°C預變性5 min,94°C變性I min, 59°C退火I min, 72°C延伸I min，30個循環後，72°C延伸5 min。所得PCR產物由北京奧科生物技術公司進行純化及序列測定。將測定出來的Z19的26S rDNA D1/D2區域與GenBank核酸序列資料庫中的序列進行比對，採用ClustalX軟體進行匹配排列(align)，用MEGA4. O軟體中的neighbor-joining分析法構建系統發育樹，並進行1000次Bootstraps檢驗，最後用 TreeView軟體顯示系統樹。
實驗得到570bp的基因序列，在Genbank核酸序列資料庫中進行同源序列搜索， TYQ 與Issatchenkia orientalis NRRL Y-5396 的同源性超過 99%,符合Kuttzman&Robnett 所定的同種內不同菌株見差異不超過1%的標準。I. 3. 3 :東方伊薩酵母菌Z19株的生理生化實驗測定結果
(I)發酵試驗
權利要求
1.一株高產酯的東方伊薩酵母菌，，其特徵在於，該菌株為東方伊薩酵母Z19株 (Jssatchenkia oriental is Z19),保藏於中國典型培養物保藏中心,保藏編號為CCTCC M2011499。
2.一種含權利要求I中所述菌株的釀酒菌劑組合物。
3.根據權利要求2中所述的釀酒菌劑組合物，其特徵在於它含有下列組份(活菌數比)東方伊薩酵母Z19 60%酒精酵母40%其中東方伊薩酵母為CCTCC M2011499，酒精酵母為AS2. 300。
4.製備權利要求4中所述的固態釀酒菌劑組合物的方法，包括如下步驟菌種活化分別接種東方伊薩酵母Z19株和酒精酵母AS2. 300於滅菌的糖度為12巴林的麥芽汁或米曲汁三角瓶培養基中，28 30°C搖床培養18-24天；固體培養固體培養的配料是麩皮70%、玉米面30%，用玉米糖化液潤料，加1%濃硫酸，蒸煮冷散後，將活化培養2種酵母菌液按3 2體積比混合接種後裝盒，保持室溫20°C左右.品溫25 °C左右，培養發酵2天；真空乾燥對發酵後的固體樣品在45°C進行真空乾燥處理，樣品含水率低於10%後真空包裝。
5.權利要求I所述的東方伊薩酵母Z19株在白酒釀造上的應用。
6.權利要求2或3中所述的任何一種釀酒菌劑組合物在白酒釀造上的應用。
全文摘要
本發明公開了一株新的高產酯東方伊薩酵母菌，含該菌的釀酒菌劑組合物以及高產酯東方伊薩酵母菌及釀酒菌劑組合物在白酒釀造中的應用。本發明還提供製備釀酒菌劑組合物的方法。本發明公開的高產酯東方伊薩酵母菌不但耐高溫，更重要的是具有高產酯率和高酒精產率。品酒分數在90-95。採用該菌株發酵可形成白酒獨特風味。
文檔編號C12G3/02GK102586125SQ20121003924
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日
發明者劉婷婷, 宋瑤, 張明春, 曾馳, 楊團元, 熊小毛, 繆禮鴻 申請人:武漢工業學院, 湖北白雲邊酒業股份有限公司