發酵木糖的真核細胞的代謝工程的製作方法

2023-05-05 01:26:26

專利名稱：發酵木糖的真核細胞的代謝工程的製作方法
技術領域：
本發明涉及真核宿主細胞中的進一步遺傳修飾，所述真核宿主細胞已經被轉化而 表達賦予宿主細胞使木糖異構為木酮糖的能力的木糖異構酶。所述進一步遺傳修飾目的在 於改善木糖代謝的效率，包括例如降低非特異性醛糖還原酶活性、增加木酮糖激酶活性及 增加磷酸戊糖途徑的流量(flux)。本發明的修飾的宿主細胞適於在包含木糖作為碳源的各 種方法中生產各種發酵產物。
背景技術：
從植物生物量的半纖維素成分生產經濟學可行的乙醇需要戊糖和己糖以同等比 率及高產量同時轉化。酵母，特別是糖酵母物種(Saccharomyces spp.)，是用於這一方法的 最合適的候選物，因為它們在己糖上既可以需氧也可以厭氧地快速生長。另外，它們與(遺 傳修飾的)細菌相比對於木質纖維素水解產物的毒性環境更具抗性。在先前的研究中有證據表明為了利用木糖而對釀酒酵母(S. cerevisiae)進行 的代謝工程應基於引入木糖異構酶(XI，EC5.3. 1.5) (Bruinenberg et al. (1983，Eur J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 18 :287_292))。與基於木糖還原酶(XR, EC 1. 1. 1. 21)和 木糖醇脫氫酶(XD，EC 1.1.1.9)的酵母株相反，表達XI活性的酵母株顯示高醇產量及幾 乎不產生木糖醇，如最近的 WO 03/0624430 和 Kuyper et al. (2004，FEMS Yeast Res. 4 655-664)所證實。從理論上看這不令人驚奇，因為經過XR和XD的途徑導致NADH平衡受 阻，其可以在無氧條件下例如通過形成木糖醇而緩解。WO 03/0624430揭示了將功能性Piromyces XI導入釀酒酵母中使得通過由XKSl 編碼的內源木酮糖激酶(EC 2. 7. 1. 17)及磷酸戊糖途徑的非氧化部分的酶而減緩木糖的 代謝，並賦予該酵母轉化體在木糖上生長的能力。Kuyper等(如前述)描述了其中已經導入Piromyces XI並且之後在搖瓶中進行 定向進化的釀酒酵母株顯示出改良的木糖發酵速率，但是仍需要氧以生長。通過在木糖過 量的條件下的極度限氧方案進行進一步選擇，並隨後進行厭氧選擇，產生了實驗室酵母株 (RWB202-AFX)，其達到利用半纖維素的至少一個必要條件，即利用木糖產生可接受的乙醇 產量。然而，這個酵母株中乙醇產生的比速率仍是無法接受地低。特別地，在木糖上生長期 間的糖消耗比速率(345mg木糖/g生物量/小時)仍比在葡萄糖上生長低10倍。迄今為 止通過進化工程進一步改良酵母株RWB202-AFX的嘗試仍未成功。WO 03/0624430列出了許多替代性遺傳修飾，它們可以導致在表達Piromyces XI 基因的宿主細胞中利用木糖進行的乙醇產生和/或糖消耗的比速率進一步改進至商業利 用半纖維素所需的水平。這些替代性遺傳修飾包括(a)提高木糖至宿主細胞中的轉運; (b)增強木酮糖激酶活性；(c)增加磷酸戊糖途徑的流量；(d)降低對於分解代謝物抑制的 敏感性；(e)增強對乙醇、滲透壓(osmolarity)或者有機酸的耐受；以及(f)降低副產物(例如木糖醇、甘油和/或乙酸)的產生。更特別地，WO 03/0624430建議過表達編碼己糖 或者戊糖轉運蛋白、木酮糖激酶(如釀酒酵母XKS1)、磷酸戊糖途徑的酶如轉醛醇酶(TALl) 或轉羥乙醛酶(TKLl)、糖酵解酶、產乙醇酶如醇脫氫酶的一或多種基因，和/或失活己糖激 酶基因例如釀酒酵母HXK2基因、釀酒酵母MIGl或MIG2基因、(非特異性)醛糖還原酶基 因如釀酒酵母GRE3基因或者參與甘油代謝的酶的基因如釀酒酵母甘油-磷酸脫氫酶1和/ 或2基因。然而WO 03/0624430未揭示這些替代方案中哪些在攜帶Piromyces XI基因的 宿主細胞中確實使乙醇產量和/或木糖消耗的比速率改進。Karhumaa et al. (2004, 「 Development of a Xylose-growing Saccharomyces cerevisiae strain expressing bacterial xylose isomerase「 ， Poster presentation at the second meeting on Physiology of Yeasts and Filamentous Fungi ；March 24-28 2004 Anglet,France. Page 43 ；and,2004, " New Xylose-growing Saccharomyces cerevisiae strain for biofuel ethanol production 「 ， Oral presentation at the 26th Symposium on Biotechnology for fuels and chemicals, May 9—12,2004 Chattanooga (TN)，USA. Page 19)揭示了一種表達嗜熱棲熱菌(Thermus thermophi lus)細 菌XI的釀酒酵母菌株。該菌株進一步含有WO 03/0624430中建議的許多遺傳修飾木酮糖 激酶及非氧化的磷酸戊糖途徑的所有四種酶的過表達以及釀酒酵母非特異性醛糖還原酶 基因(GRE3)的失活。然而，儘管存在這些遺傳修飾，但是這個菌株在木糖上還是不能生長。 只有在適應在木糖上需氧生長之後，才獲得能在木糖上具有低速率生長(μ = O.CMh—1)及 低木糖消耗比速率(4. 3mg木糖/g細胞/小時)的菌株TMB3050。由於(在適應期間積累 的)未確定的遺傳修飾0對於在木糖上生長是首先明確需要的，因此技術人員從Karhumaa 等的工作中不能推導出哪些已確定的遺傳修飾(如木酮糖激酶或者磷酸戊糖途徑的任何 酶的過表達或者醛糖還原酶基因的失活)確實有助於經適應的菌株在木糖上生長的能力。因此本發明的一方面提供了用XI基因轉化的真核宿主細胞，如真菌宿主細胞，所 述XI基因賦予宿主細胞在木糖上生長的能力，並且所示宿主細胞具有適於商業應用的木 糖消耗和/或產物(乙醇)形成的比速率。發明描述^X木糖異構酶本文所用術語「木糖異構酶」(EC 5. 3. 1. 5)是指催化D-木糖直接異構為D-木酮 糖以及相反過程的酶。所述酶也稱為D-木糖酮異構酶(D-xylose ketoisomerase)。一些 木糖異構酶也能催化D-葡萄糖與D-果糖之間的轉化，因此有時也稱作葡萄糖異構酶。木 糖異構酶需要二價陽離子如鎂或者錳作為輔因子。本發明的木糖異構酶可通過下文所述的 其胺基酸序列而進一步定義。同樣，木糖異構酶也可以通過編碼該酶的核苷酸序列以及與 編碼下文描述的木糖異構酶的參考核苷酸序列雜交的核苷酸序列而定義。木糖異構酶活性單位(U)在本文是指在Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4 69-78)所述條件下，每分鐘產生Inmol木酮糖的酶量。木酮糖激酶本文所用術語「木酮糖激酶」 (EC 2. 7. 1. 17)是指催化ATP+D-木酮糖=ADP+D-木 酮糖5-磷酸反應的酶。該酶也稱作磷酸化木酮糖激酶、D-木酮糖激酶或者ATP:D-木酮糖
55_磷酸轉移酶。本發明的木酮糖激酶可通過下文所述的其胺基酸序列而進一步定義。同 樣，木酮糖激酶也可以通過編碼該酶的核苷酸序列以及與編碼下文所述木酮糖激酶的參考 核苷酸序列雜交的核苷酸序列而定義。木酮糖激酶活性單位在實施例1. 13中詳細定義。核酮糖5-磷酸差向異構酶本文所用術語「核酮糖5-磷酸差向異構酶」(5. 1. 3. 1)是指催化D-木酮糖5_磷 酸差向異構為D-核酮糖5-磷酸以及相反過程的酶。該酶也稱作磷酸核酮糖差向異構酶、 赤蘚糖-4-磷酸異構酶、磷酸戊酮糖3-差向異構酶、木酮糖磷酸3-差向異構酶、磷酸戊酮 糖差向異構酶、核酮糖5-磷酸3-差向異構酶、D-核酮糖磷酸-3-差向異構酶、D-核酮糖 5-磷酸差向異構酶、D-核酮糖-5-P 3-差向異構酶、D-木酮糖-5-磷酸3-差向異構酶、戊 糖-5-磷酸3-差向異構酶、或者D-核酮糖-5-磷酸3-差向異構酶。本發明的核酮糖5-磷 酸差向異構酶可以通過下文描述的其胺基酸序列進一步定義。同樣，核酮糖5-磷酸差向異 構酶可以通過編碼該酶的核苷酸序列以及與編碼下文描述的核酮糖5-磷酸差向異構酶的 參考核苷酸序列雜交的核苷酸序列而定義。核酮糖5-磷酸異構酶本文所用術語「核酮糖5-磷酸異構酶」(EC 5. 3. 1. 6)是指催化D-核糖5_磷酸 直接異構為D-核酮糖5-磷酸以及相反過程的酶。該酶也稱作磷酸戊糖異構酶、磷酸核糖 異構酶、核糖磷酸異構酶、5-磷酸核糖異構酶、D-核糖5-磷酸異構酶、D-核糖-5-磷酸酮 醇_異構酶、或者D-核糖-5-磷酸醛糖-酮糖-異構酶。本發明的核酮糖5-磷酸異構酶 可以通過下文描述的其胺基酸序列進一步定義。同樣，核酮糖5-磷酸異構酶可以通過編碼 該酶的核苷酸序列以及與編碼下文描述的核酮糖5-磷酸異構酶的參考核苷酸序列雜交的 核苷酸序列而定義。轉羥乙醛酶本文所用術語「轉羥乙醛酶」(EC 2. 2. 1. 1)是指催化如下反應以及相反過程的 酶D-核糖5-磷酸+D-木酮糖5-磷酸一景天庚酮糖7_磷酸+D-甘油醛3_磷酸該酶也稱作甘油醛轉移酶或者景天庚酮糖-7-磷酸D-甘油醛-3-磷酸甘油醛轉 移酶。本發明的轉羥乙醛酶可以通過下文描述的其胺基酸序列進一步定義。同樣，轉羥乙 醛酶可以通過編碼該酶的核苷酸序列以及與編碼下文描述的酮糖轉移酶的參考核苷酸序 列雜交的核苷酸序列而定義。轉醛醇酶本文所用術語「轉醛醇酶」(EC 2. 2. 1. 2)是指催化如下反應以及相反過程的酶景天庚酮糖7-磷酸+D-甘油醛3-磷酸μ D-赤蘚糖4_磷酸+D-果糖6_磷酸該酶也稱作二羥基丙酮轉移酶、二羥基丙酮合酶、甲醛轉羥乙醛酶、或者景天庚酮 糖-7-磷酸D-甘油醛-3-磷酸甘油轉移酶(glyceronetranserase)。本發明的轉醛醇酶 可以通過下文描述的其胺基酸序列而進一步定義。同樣，轉醛醇酶可以通過編碼該酶的核 苷酸序列以及與編碼下文描述的轉醛醇酶的參考核苷酸序列雜交的核苷酸序列而定義。醛糖還原酶本文所用術語「醛糖還原酶」(EC 1. 1. 1. 21)是指能將木糖或木酮糖還原為木糖醇 的任何酶。在本發明中，醛糖還原酶可以是本發明宿主細胞天然(內源)的並且能將木糖或木酮糖還原為木糖醇的任何非特異性醛糖還原酶。非特異性醛糖還原酶催化如下反應醛糖+NAD (P) H+H+ 醛醇 +NAD (P)+所述酶具有廣泛特異性，也稱作醛糖還原酶、多醇脫氫酶(NADP+)、醛醇NADP氧 化還原酶、醛醇NADP+ 1-氧化還原酶、NADPH-戊醛糖還原酶、或者NADPH-醛糖還原酶。 這種非特異性醛糖還原酶特別例如是釀酒酵母內源的並且由GRE3基因編碼的酶( TrSff etal.，2001，Appl. Environ. Microbiol. 67 5668-74)。因此，本發明的醛糖還原酶可以通過 下文描述的其胺基酸序列進一步定義。同樣，醛糖還原酶也可以通過編碼該酶的核苷酸序 列以及與編碼下文描述的醛糖還原酶的參考核苷酸序列雜交的核苷酸序列而定義。序列相同件與相似件本發明所述的序列相同性是兩或多個胺基酸(多肽或蛋白質)序列或者兩或多 個核酸(多核苷酸)序列之間的關係，通過序列對比而確定。在本領域中，「相同性」也意 味著胺基酸或者核酸序列之間的序列關聯性程度，可以通過這種序列鏈之間的匹配而確 定。兩個胺基酸序列之間的「相似性」是通過將一個多肽與另一個多肽的胺基酸序列及其 保守的胺基酸取代物進行對比而確定。「相同性」和「相似性」可以通過已知方法容易地計 算，所述方法包括但不限於如下文獻所述方法Computational Molecular Biology，Lesk， Α. Μ. , ed. , Oxford University Press, New York,1988 ；Biocomputing Informatics and Genome Projects,Smith,D. W. ,ed. ,Academic Press,New York, 1993 ；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. , and Griffin, H.G. , eds. , Humana Press, New Jersey, 1994 ；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G. , Academic Press, 1987 ；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M. and Devereux,J. ,eds. ,M Stockton Press, New York,1991 ； R Carillo, H. ， and Lipman, D. ， SIAM J. Applied Math. ,48 1073(1988)。確定相同性的優選方法是給出測試序列之間的最大匹配。確定相同性和相似性的 方法編程在可公開獲得的電腦程式中。確定兩個序列之間相同性和相似性的優選計算機 程序方法包括例如 GCG 程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1) 387(1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN 及 FASTA (Altschul，S. F. et al.，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)。BLAST X 程序可公開得自 NCBI 及其它來源(BLAST Manual, Altschul, S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul, S.，et al.，J. Mol. Biol. 215 403-410(1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用於確定相同性。進行多肽序列對比的優選參數包括如下參數Algorithm =Needleman and ffunsch,J. Mol. Biol. 48 443-453(1970) ；Comparison matrix :BL0SSUM62 from Hentikoff and Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89 10915-10919(1992) ；Gap Penalty 12 ； Gap Length Penalty :4。含有這些參數的可用的程序是可公開獲得的程序，如得自位於 Madison，WI的Genetics Computer Group的Ogap程序。前述參數是進行胺基酸對比的默 認參數(以及末端間隔無罰分)。進行核酸對比的優選參數包括如下參數Algorithm :Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443_453 (1970) ；Comparison matrix :matches = +10, mismatch = O ；Gap Penalty 50 ；Gap Length Penalty :3。可獲得的如得自位於 Madison，Wis 的 Genetics Computer Group的Gap程序。上述是進行核酸對比的默認參數。
任選地，在確定胺基酸相似性的程度中，技術人員也可以考慮所謂的「保守」氨基 酸取代，這對於技術人員是明了的。保守胺基酸取代是指具有相似側鏈的殘基的可互換性。 例如，具有脂肪族側鏈的一組胺基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；具有脂 肪族_羥基側鏈的一組胺基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含醯胺側鏈的一組胺基酸是天冬醯 胺和穀氨醯胺；具有芳香族側鏈的一組胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有鹼性側 鏈的一組胺基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有含硫側鏈的一組胺基酸是半胱氨酸和甲 硫氨酸。優選的保守胺基酸取代組是纈氨酸_亮氨酸_異亮氨酸，苯丙氨酸_酪氨酸，賴 氨酸_精氨酸，丙氨酸_纈氨酸，及天冬醯胺_穀氨醯胺。本發明揭示的胺基酸序列的取代 變體是揭示的序列中至少一個殘基已經被除去並在其位置插入一個不同殘基的胺基酸序 列。優選地，所述胺基酸改變是保守的。每個天然發生的胺基酸的優選保守取代如下Ala 變為ser ；Arg變為Iys ；Asn變為gin或his ；Asp變為glu ；Cys變為ser或ala ；Gln變為 asn ；Glu 變為 asp ；Gly 變為 pro ；His 變為 asn 或 gin ；Ile 變為 Ieu 或 val ；Leu 變為 ile 或 val ；Lys 變為 arg、gin 或 glu ；Met 變為 Ieu 或 ile ；Phe 變為 met、Ieu 或 tyr ；Ser 變為 thr ；Thr 變為 ser ；Trp 變為 tyr ；Tyr 變為 trp 或 phe ；及 Val 變為 ile 或 leu。雜交胺基酸序列編碼本發明的酶的核苷酸序列也可以通過其在中等或者優選在嚴格雜交條件下 分別與SEQ ID NO :9-16和18的核苷酸序列雜交的能力而定義。本文所述嚴格雜交條件是 使至少大約25個、優選大約50、75、或100個、最優選大約200或更多個核苷酸的核酸序列 在大約65°C溫度，在包含大約IM鹽、優選6XSSC或者具有相當的離子強度的任何其它溶液 中雜交，並且在65°C在包含大約0. IM鹽或者更低濃度、優選0.2XSSC或具有相當的離子強 度的任何其它溶液中洗滌。優選地，所述雜交是過夜進行，即至少10小時，優選洗滌是用至 少更換兩次的洗滌溶液洗滌至少1小時。這些條件通常允許具有大約90%或者更高序列相 同性的序列特異性雜交。本文所述中等條件是使得至少50個、優選大約200或更多個核苷酸的核酸序列在 大約45°C在包含IM鹽、優選6XSSC或者具有相當的離子強度的任何其它溶液中雜交，並且 在室溫在包含大約IM鹽、優選6XSSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液中洗滌。優 選地，所述雜交是過夜進行，即至少10小時，優選洗滌是用至少更換兩次的洗滌溶液洗滌 至少1小時。這些條件通常允許具有高至50%序列相同性的序列特異性雜交。本領域技術 人員能修改這些雜交條件以特異性鑑別相同性在50% -90%之間變化的序列。可操縱地連接如本文所用，術語「可操縱地連接」是指多核苷酸元件以功能關係而連接。當一個 核酸與另一個核酸序列以功能關係放置時，該核酸被「可操縱地連接」。例如，如果啟動子或 增強子影響編碼序列的轉錄，則其與編碼序列的連接是可操縱地連接。可操縱地連接是指 被連接的DNA序列典型是相鄰的，並且在需要之處相鄰地及符合讀框地連接兩個蛋白質編 碼區。啟動子如本文所用，術語「啟動子」是指控制一或多個基因轉錄的核酸片段，位於基因的 轉錄起始位點的轉錄方向的上遊，通過存在如下結構而在結構上加以鑑別DNA依賴性RNA 聚合酶的結合位點、轉錄起始位點及任何其它DNA序列，包括但不限於轉錄因子結合位點、本領域技術人員已知的直接或間接調節所述啟動子的 轉錄量的任何其它核苷酸序列。「組成型」啟動子是在大多數環境和發育條件下有活性的啟 動子。「可誘導的」啟動子是在環境或發育調節下有活性的啟動子。MM術語「同源」當用於描述給定的(重組)核酸或者多肽分子與給定的宿主生物體 或宿主細胞之間的關係時，是指所述核酸或多肽分子是由相同物種、優選相同品種或菌株 的宿主細胞或者生物體天然產生的。如果與宿主細胞同源，則編碼多肽的核酸序列典型地 與另一啟動子序列可操縱地連接，或者如果可行，與其天然環境之外的另一分泌信號序列 和/或終止子序列可操縱地連接。當用於描述兩個核酸序列之間的關聯性時，術語「同源」 是指一個單鏈核酸序列可以與互補的單鏈核酸序列雜交。雜交程度依賴於許多因素，包括 序列之間相同性的量及雜交條件，如後文討論的溫度和鹽濃度。優選地，相同性區域多於大 約5bp，更優選相同性區域多於10bp。碰術語「異源」當用於描述核酸(DNA或RNA)或者蛋白質時，是指核酸或蛋白質不是 其所處的生物體、細胞、基因組或者DNA或RNA序列的天然發生的一部分，或者所述核酸或 蛋白質是在與其天然發現的不同的細胞或者基因組或DNA或RNA序列的不同位置中發現。 異源核酸或蛋白質對於其被導入的細胞而言不是內源的，而是得自另一細胞或者經合成或 重組產生。通常地，儘管不是必要的，這些核酸編碼不是由其中所述DNA被轉錄或表達的細 胞正常產生的蛋白質。相似地，外源RNA編碼不是在其中存在外源RNA的細胞中正常表達 的蛋白質。異源核酸和蛋白質也可以是指外來的核酸或蛋白質。本領域技術人員認為的對 於在其中表達的細胞而言是異源或外源的任何核酸或蛋白質均涵蓋在術語異源核酸或蛋 白質中。術語異源也用於描述核酸或胺基酸序列的非天然組合，即其中至少兩個組合的序 列彼此是外來的的組合。在本文及其權利要求書中，動詞「包含」以其非限制性含義使用，是指涵蓋了其後 的項目，但是並不排除沒有提到的項目。另外，當描述一個元件時，數量短語「一個」不排除 存在多於一個所述元件的可能性，除非上下文清楚地要求有且僅有一個所述元件。因此數 量短語「一個」通常是指「至少一個」。發明詳述本發明涉及轉化的真核宿主細胞，其具有將木糖異構為木酮糖的能力，例如WO 03/0624430所述。將木糖異構為木酮糖的能力是通過用包含編碼木糖異構酶的核苷酸序列 的核酸構建體轉化宿主細胞而賦予宿主細胞的。轉化的宿主細胞的將木糖異構為木酮糖的 能力是將木糖直接異構為木酮糖。這意味著在由木糖異構酶催化的一個單一反應中即將木 糖異構為木酮糖，與分別由木糖還原酶和木糖醇脫氫酶催化的以木糖醇為中間物的將木糖 轉變為木酮糖的兩步反應不同。所述核苷酸序列編碼優選在轉化的宿主細胞中以活性形式表達的木糖異構酶。因 此，宿主細胞中所述核苷酸序列的表達產生在30°C具有至少IOU木糖異構酶活性/mg蛋白 質、優選至少20、25、30、50、100、200、300或500U/mg蛋白質的比活性的木糖異構酶。在轉化 的宿主細胞中表達的木糖異構酶的比活性在本文以宿主細胞無細胞裂解物例如酵母無細 胞裂解物的每毫克蛋白質的木糖異構酶活性單位的量表示。木糖異構酶活性、蛋白質量的
9確定及無細胞裂解物的製備如實施例1. 13所述。因此，編碼木糖異構酶的核苷酸序列在宿 主細胞中的表達產生具有在30°C至少50U木糖異構酶活性/mg蛋白質、優選至少100、200、 500、750或者1000U/mg蛋白質的比活性的木糖異構酶。優選地，編碼木糖異構酶的核苷酸序列在宿主細胞中的表達產生對於木糖其Km低 於50、40、30或者25mM的木糖異構酶，更優選對於木糖其Km為大約20mM或更低的木糖異 構酶。編碼木糖異構酶的優選的核苷酸序列可以選自由如下核苷酸序列組成的組(a)編碼包含與SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的胺基酸序列具有至少60、65、 70、75、80、85、90、95、97、98或者99%序列相同性的胺基酸序列的多肽的核苷酸序列；(b)包含與SEQ ID NO :9和/或SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少40、50、60、 70、80、90、95、97、98或者99%序列相同性的核苷酸序列的核苷酸序列；(c)其互補鏈與(a)或(b)的核酸分子序列雜交的核苷酸序列；(d)其序列由於遺傳密碼的簡併性而與(C)的核酸分子序列不同的核苷酸序列。編碼木糖異構酶的核苷酸序列可以編碼原核或者真核木糖異構酶，即具有與在原 核或真核生物體中天然發生的木糖異構酶相同的胺基酸序列的木糖異構酶。本發明人發 現特定的木糖異構酶賦予真核宿主細胞將木糖異構為木酮糖的能力不十分依賴於該異構 酶源自原核還是真核生物體，而是依賴於異構酶的胺基酸序列與Piromyces序列(SEQ ID NO 1)的關聯性。令人驚奇地，真核Piromyces異構酶與原核異構酶的關聯性高於與其它 已知真核異構酶的關聯性。Piromyces異構酶與黃單胞菌屬(Xanthomonas)酶呈現61% 胺基酸序列相同性，與擬桿菌屬(Bacteroides)酶(SEQ ID NO 2)呈現82%胺基酸序列相 同性，而與一些植物木糖異構酶僅呈現49-52%胺基酸序列相同性。未有植物木糖異構酶 在酵母中活性表達的報導。相反，在實施例3中，我們描述了擬桿菌屬木糖異構酶賦予真核 宿主細胞將木糖異構為木酮糖的能力及在木糖作為唯一碳源的條件下生長的能力。因此， 優選的核苷酸序列編碼具有與上述Piromyces序列相關的胺基酸序列的木糖異構酶。優 選的核苷酸序列編碼真菌木糖異構酶(例如來自擔子菌(Basidiomycete))，更優選厭氧 真菌的木糖異構酶，例如來自屬於 Neocallimastix、Caecomyces、Piromyces、Orpinomyces 或Ruminomyces科的厭氧真菌的木糖異構酶。或者，優選的核苷酸序列編碼細菌木糖異構 酶，優選來自革蘭氏陰性菌，更優選來自擬桿菌綱或者擬桿菌屬、最優選來自多形擬桿菌 (B. thetaiotaomicron)的異構酶(SEQ ID NO 2)。為了增加木糖異構酶以活性形式在真核宿主細胞如酵母中表達的可能性，可以對 編碼木糖異構酶的核苷酸序列進行調整適應以優化其密碼子為真核宿主細胞所利用。編碼 木糖異構酶(或者本發明的其它酶，見下述)的核苷酸序列對於宿主細胞的密碼子使用的 適應性可以表示為密碼子適應指數(codon adaptiveness index，CAI)。密碼子適應指數在 本文定義為基因的密碼子使用與高度表達的基因的密碼子使用的相關適應性測定。每個密 碼子的相關適應性⑷是每個密碼子的使用與相同胺基酸最豐餘的密碼子的比率。CAI指 數定義為這些相關適應性數值的幾何平均數。非同義密碼子和終止密碼子(依賴於遺傳密 碼)除外。CAI數值範圍是0-1，較高的數值表示較高比例的最豐餘的密碼子(見Sharp and Li，1987， Nucleic Acids Research 15 1281-1295 Jansen et al. ，2003， Nucleic Res. 31 (8) =2242-51)。經調整適應的核苷酸序列優選CAI為至少0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6或
用如上所述的編碼木糖異構酶的核苷酸序列轉化的宿主細胞優選是能主動或被 動將木糖轉運至細胞中的宿主。所述宿主細胞優選含有主動糖酵解。所述宿主細胞可進一 步含有內源磷酸戊糖途徑，及可含有內源木酮糖激酶活性，由此由木糖異構形成的木酮糖 可以代謝為丙酮酸。所述宿主進一步優選含有將丙酮酸轉變為希望的發酵產物的酶，所述 發酵產物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、胺基酸、1，3_丙二醇、 乙烯、甘油、β -內醯胺抗生素和頭孢菌素。優選的宿主細胞是天然能進行乙醇發酵、優選厭氧乙醇發酵的宿主細胞。所述宿 主細胞進一步優選具有對乙醇的高度耐受性，對低PH的高度耐受性(即能在低於5、4、3或 2. 5的ρΗ條件下生長)及對有機酸如乳酸、乙酸或者甲酸和糖降解產物如糠醛和羥甲基糠 醛的高度耐受性，及對升高的溫度的高度耐受性。宿主細胞的任何這些特性或活性可以天 然存在於宿主細胞中，或者可以導入或者通過遺傳修飾進行修飾。合適的宿主細胞是真核 微生物如真菌，然而，最合適的宿主細胞是酵母或者絲狀真菌。酵母在本文被描述為真核微生物，包括主要以單細胞形式生長的真菌亞門 (Eumycotina)的所有禾中(Alexopoulos, C. J.，1962，In Introductory Mycology, John Wiley & Sons，Inc. , New York)。酵母可以通過單細胞原植體的芽殖而生長或者通過該 生物體的分裂而生長。優選作為宿主細胞的酵母屬於糖酵母屬(Saccharomyces)、克魯 維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬(Pichia)、裂殖酵母屬 (Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、許旺酵母 屬(Schwarmiomyces)和耶氏酵母屬(Yarrowia)。優選所述酵母能進行厭氧發酵，更優選能 進行厭氧乙醇發酵。絲狀真菌在本文被定義為真核微生物，包括真菌亞門的所有絲狀形式。這些真菌 特徵在於由殼多糖、纖維素及其它複合多糖組成的營養菌絲體。本發明的絲狀真菌與酵 母在形態學、生理學和遺傳學方面截然不同。絲狀真菌的營養生長是通過菌絲延長進行， 大多數絲狀真菌的碳分解代謝是必須需氧的。作為宿主細胞的優選絲狀真菌屬於麴黴屬 (Aspergillus)、木黴屬(Trichoderma)、腐質黴屬(Humicola)、枝頂抱屬(Acremonium)、鍵 ？包菌屬(Fusarium)禾口青黴屬(Penicillium)0近年來提議導入各種生物體以從作物糖分中生產生物乙醇。然而，實際上所有主 要的生物乙醇生產方法繼續使用糖酵母屬的酵母作為乙醇生產株。這是由於糖酵母物種在 工業生產過程中具有許多吸引人的特點，即高酸性、乙醇和滲透壓耐受性，厭氧生長的能力 及其高醇發酵能力。作為宿主細胞的優選酵母物種包括釀酒酵母、S. bulderi.S. barnetti, 少孢酵母(S. exiguus)、葡萄汁酵母(S. uvarum)、糖化酵母(S. diastaticus)、乳酸克魯維 斯酵母(K. Iactis)、馬克斯克魯維酵母(K. marxianus)、脆壁克魯維酵母(K. fragilis)。本發明的宿主細胞因此是用包含編碼上述木糖異構酶的核苷酸序列的核酸構建 體轉化的宿主細胞。包含編碼木糖異構酶編碼序列的核酸構建體優選能在宿主細胞中表達 木糖異構酶。為此所述核酸構建體可以如WO 03/0624430所述構建。所述宿主細胞可包含 所述核酸構建體的一個但優選多個拷貝。所述核酸構建體可以附加型維持，並因此包含自 主複製的序列，如ARS序列。合適的附加型核酸構建體可例如基於酵母2 μ或pKDl(Fleer et al.，1991，Biotechnology 2:968-975)質粒。然而，優選所述核酸構建體以一或多個
11拷貝整合進宿主細胞的基因組中。整合進宿主細胞基因組中可以通過非常規重組隨機產 生，但優選核酸構建體是通過真菌分子遺傳學領域熟知的同源重組方法整合進宿主細胞中 (參見例如 WO 90/14423，EP-A-O 481 008，EP-A-O 635 574 及 US 6, 265, 186).在本發明的第一方面中，本發明的宿主細胞包含增加磷酸戊糖途徑流量的遺傳修 飾。特別地，所述遺傳修飾導致磷酸戊糖途徑的非氧化部分流量增加。導致磷酸戊糖途徑的 非氧化部分流量增加的遺傳修飾在本文理解為是指使所述流量與在除了導致流量增加的 遺傳修飾之外在遺傳學方面均相同的菌株中的流量相比增加至少1. 1、1.2、1.5、2、5、10或 者20倍。磷酸戊糖途徑的非氧化部分的流量的測定可以通過將修飾的宿主在木糖作為唯 一碳源的條件下生長，確定木糖消耗比速率，從木糖消耗比速率中減去木糖醇產生比速率 (如果有木糖醇產生的話)進行。然而，磷酸戊糖途徑的非氧化部分的流量與在作為唯一碳 源的木糖上的生長率成比例，優選與在作為唯一碳源的木糖上的厭氧生長率成比例。在作 為唯一碳源的木糖上的生長率(μ_)與磷酸戊糖途徑的非氧化部分的流量之間呈線性相 關。木糖消耗比速率(Qs)與生長率(μ)除以糖上的生物量的產量(Yxs)相等，因為糖上的 生物量的產量是恆定的(在給定的系列條件下厭氧，生長培養基，ΡΗ，菌株的遺傳背景等 等；即Qs= μ/Yj。因此，增加的磷酸戊糖途徑的非氧化部分的流量可以從在這些條件下 最大生長率的增加中推斷。增加磷酸戊糖途徑的流量的遺傳修飾可以通過各種方式導入宿主細胞中。這些方 式包括例如達到較高的木酮糖激酶和/或磷酸戊糖途徑的非氧化部分的一或多種酶的穩 態活性水平和/或降低的非特異性醛糖還原酶活性的穩態水平。穩態活性水平中的這些改 變可以通過選擇突變體(自發或被化學物質或輻射誘導)和/或通過重組DNA技術(例如 分別過表達或失活編碼調節這些基因的酶或因子的基因)而實現。在優選的宿主細胞中，所述遺傳修飾包含磷酸戊糖途徑(的非氧化部分)的至少 一種酶的過表達。優選所述酶選自編碼核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構 酶、轉羥乙醛酶和轉醛醇酶的酶。磷酸戊糖途徑(非氧化部分)的酶的各種組合均可以過表 達。例如過表達的酶可以至少是核酮糖-5-磷酸異構酶和核酮糖-5-磷酸差向異構酶；或 者至少是核酮糖-5-磷酸異構酶和轉羥乙醛酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構酶和轉醛 醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉羥乙醛酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸 差向異構酶和轉醛醇酶；或者至少是轉羥乙醛酶和轉醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸 差向異構酶、轉羥乙醛酶和轉醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構酶、轉羥乙醛酶和轉 醛醇酶；或者至少是核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉醛醇酶；或者 至少是核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶和轉羥乙醛酶。在本發明的一 個實施方案中，核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶、轉羥乙醛酶和轉醛醇 酶在宿主細胞中均是過表達的。更優選的是其中所述遺傳修飾至少包含轉羥乙醛酶和轉醛 醇酶均是過表達的宿主細胞，因為這種宿主細胞能在木糖上厭氧生長。事實上，在一些條件 下，我們發現僅過表達轉羥乙醛酶和轉醛醇酶的宿主細胞與過表達所有四種所述酶(即核 酮糖-5-磷酸異構酶、核酮糖-5-磷酸差向異構酶、轉羥乙醛酶和轉醛醇酶)的宿主細胞具 有相同的厭氧生長速率。另外，過表達核酮糖-5-磷酸異構酶和核酮糖-5-磷酸差向異構 酶這兩種酶的宿主細胞與僅過表達該異構酶或者該差向異構酶的宿主細胞相比是優選的， 因為僅這些酶中的一種的過表達可能產生代謝失衡。
本領域中有許多方式可以在本發明的宿主細胞中使所述酶過表達。特別地，可以 通過增加宿主細胞中編碼酶的基因的拷貝數而使所述酶過表達，例如通過將額外的基因拷 貝整合進宿主細胞基因組中、通過從附加型多拷貝表達載體中表達基因或者通過導入包含 基因多個拷貝的附加型表達載體而實現。或者，本發明宿主細胞中酶的過表達可以通過使用啟動子而實現，所述啟動子對 於編碼被過表達的酶的序列是非天然的，即其是與其可操縱地連接的編碼序列異源的啟動 子。儘管所述啟動子優選與與其可操縱地連接的編碼序列異源，但也優選所述啟動子與宿 主細胞同源，即內源的。優選地，所述異源啟動子與所述編碼序列的天然啟動子相比，優選 在其中木糖或者木糖和葡萄糖用作碳源、更優選作為主要碳源(即50%以上的可用碳源由 木糖或者木糖和葡萄糖組成)、最優選作為唯一碳源的條件下，能產生較高穩態水平的包含 所述編碼序列的轉錄物(或者每單位時間能產生更多的轉錄物分子，即mRNA分子)。在這 方面合適的啟動子既包括組成型啟動子也包括可誘導的天然啟動子以及工程化的啟動子。 另外，本發明中使用的優選啟動子對於分解代謝產物(葡萄糖)抑制不敏感和/或優選不 需要木糖以進行誘導。具有這些特性的啟動子可普遍獲得並且為技術人員所已知。這些啟動子例如包 括糖酵解基因的啟動子，如來自酵母或絲狀真菌的磷酸果糖激酶(PPK)、磷酸丙糖異構酶 (TPI)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GPD、TDH3或GAPDH)、丙酮酸激酶(PYK)、磷酸甘油酸激酶 (PGK)啟動子；關於酵母的這些啟動子的詳細描述可見於WO 93/03159所述。其它可用的啟 動子是核糖體蛋白質編碼基因啟動子、乳糖酶基因啟動子(LAC4)、醇脫氫酶啟動子(ADH1、 ADH4等)、及烯醇化酶啟動子(ENO)。其它啟動子(組成型和可誘導型)及增強子或上遊激 活序列為本領域技術人員所已知。如果需要，則可以對本發明的宿主細胞中使用的啟動子 進行修飾以影響其控制特性。用於過表達所述酶的編碼序列優選與本發明的宿主細胞同源。然而，也可以同樣 應用與本發明宿主細胞異源的編碼序列。用於在本發明宿主細胞中過表達核酮糖-5-磷酸異構酶的核苷酸序列是編碼具 有核酮糖-5-磷酸異構酶活性的多肽的核苷酸序列，優選所述多肽具有與SEQ ID N0:4具 有至少50、60、70、80、90或95%相同性的胺基酸序列，或者其中所述核苷酸序列能與SEQ ID NO 12的核苷酸序列在中等條件下、優選在嚴格條件下雜交。用於在本發明宿主細胞中過表達核酮糖-5-磷酸差向異構酶的核苷酸序列是編 碼具有核酮糖-5-磷酸差向異構酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選所述多肽具有與 SEQ ID NO :5具有至少50、60、70、80、90或者95%相同性的胺基酸序列，或者其中所述核苷 酸序列能與SEQID NO 13核苷酸序列在中等條件、優選嚴格條件下雜交。用於在本發明宿主細胞中過表達轉羥乙醛酶的核苷酸序列是編碼具有轉羥乙醛 酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選所述多肽具有與SEQ ID而6具有至少50、60、70、 80、90或95%相同性的胺基酸序列，或者其中所述核苷酸序列能在中等條件、優選在嚴格 條件下與SEQID NO 14核苷酸序列雜交。用於在本發明宿主細胞中過表達轉醛醇酶的核苷酸序列是編碼具有轉醛醇酶活 性的多肽的核苷酸序列，其中優選所述多肽具有與SEQID NO 7具有至少50、60、70、80、90 或95%相同性的胺基酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等條件、優選在嚴格條件下與SEQIDNO 15核苷酸序列雜交。酶的過表達當用於描述在遺傳修飾的宿主細胞中所述酶的產生時，是指在相同條 件下與未修飾的宿主細胞相比所述酶以較高水平的特異性酶活性產生。通常這意味著在 相同條件下與未修飾的宿主細胞相比，所述酶活性蛋白質(或者在多亞基酶的情況中的蛋 白質)以較高量產生，或者以較高穩態水平產生。相似地，這通常意味著在相同條件下與未 修飾的宿主細胞相比，編碼酶活性蛋白質的mRMA以較高量產生，或者以較高的穩態水平產 生。酶的過表達因此優選通過使用本文所述合適的酶分析測定宿主細胞中酶的比活性水平 而確定。或者，酶的過表達可以通過例如使用特異於酶的抗體量化酶蛋白質的特定穩態水 平，或者通過量化編碼所述酶的mRNA的特定穩態水平而間接確定。後者可能特別適於磷酸 戊糖途徑的酶，因為該酶分析方法並不易於施行，因為酶的底物不可商購。優選與除了導致 過表達的遺傳修飾之外在遺傳學方面均相同的菌株相比，在本發明的宿主細胞中準備被過 表達的酶被過表達至少1. 1、1.2、1.5、2、5、10或20倍。應理解這些過表達水平可用於描述 酶活性的穩態水平、酶蛋白質的穩態水平以及編碼酶的轉錄物的穩態水平。在本發明的第二個方面中，本發明的宿主細胞包含增加特異性木酮糖激酶活性的 遺傳修飾。優選所述遺傳修飾通過例如編碼木酮糖激酶的核苷酸序列的過表達而導致木 酮糖激酶的過表達。編碼木酮糖激酶的基因可以是宿主細胞內源的，或者可以是與宿主細 胞異源的木酮糖激酶。用於在本發明宿主細胞中過表達木酮糖激酶的核苷酸序列是編碼具 有木酮糖激酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選所述多肽具有與SEQ ID NO :3具有至少 50、60、70、80、90或95%相同性的胺基酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等條件、優選嚴 格條件下與SEQ IDNO 11的核苷酸序列雜交。特別優選的木酮糖激酶是與Piromyces木酮糖激酶(xylB ；見WO 03/0624430)相 關的木酮糖激酶。這種Piromyces木酮糖激酶實際上與原核生物激酶比與所有已知的真核 生物激酶如酵母激酶(SEQ ID NO 3)更相關。已經表明真核生物木酮糖激酶是非特異性糖 激酶，其具有廣泛的底物範圍，包括木酮糖。相反，已經表明與Piromyces激酶最相關的原 核生物木酮糖激酶是對於木酮糖更具有特異性的激酶，即具有較窄的底物範圍。因此，用於 在本發明宿主細胞中過表達木酮糖激酶的更優選的核苷酸序列是編碼具有木酮糖激酶活 性的多肽的核苷酸序列，其中優選所述多肽具有與SEQ ID而17具有至少45、50、55、60、 65、70、80、90或95%相同性的胺基酸序列，或者所述核苷酸序列能在中等條件、優選在嚴 格條件下與SEQ ID NO: 18核苷酸序列雜交的核苷酸序列。在本發明的宿主細胞中，增加特異性木酮糖激酶活性的遺傳修飾可以與上述增加 磷酸戊糖途徑流量的任何修飾組合，但這種組合對於本發明不是必需的。因此，本發明特別 包括僅包含增加特異性木酮糖激酶活性的遺傳修飾的宿主細胞。本領域可利用的達到和分 析本發明宿主細胞中木酮糖激酶過表達的各種方式與針對磷酸戊糖途徑的酶的上述方式 相同。優選地，與其中除了導致過表達的遺傳修飾之外在遺傳學方面均相同的菌株相比，在 本發明的宿主細胞中過表達的木酮糖激酶被過表達至少1. 1、1. 2,1. 5、2、5、10或者20倍。 應理解這些過表達水平可用於描述酶活性的穩態水平，酶蛋白質的穩態水平以及編碼酶的 轉錄物的穩態水平。在本發明的第三方面中，本發明的宿主細胞包含降低宿主細胞中非特異性醛糖還 原酶活性的遺傳修飾。優選地，宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性通過降低編碼非特異
14性醛糖還原酶的基因的表達或者使其失活的一或多個遺傳修飾而降低。優選地，所述遺傳 修飾降低宿主細胞中編碼非特異性醛糖還原酶的基因的每個內源拷貝的表達或者使其失 活。宿主細胞由於二、多或者非整倍性的結果而可以包含編碼非特異性醛糖還原酶的基因 的多個拷貝，和/或所述宿主細胞可含有一些不同的具有醛糖還原酶活性的(異構)酶，這 些酶具有不同的胺基酸序列並由不同的基因編碼。在這種情況中也優選降低編碼非特異性 醛糖還原酶的每個基因的表達或使其失活。優選地，所述基因是通過缺失該基因的至少一 部分或者通過破壞該基因而失活，文中所用術語「基因」也包括在編碼序列上遊或下遊的任 何非編碼序列，所述基因的(部分)缺失或者失活導致宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活 性的表達降低。編碼在本發明宿主細胞中其活性要被降低的醛糖還原酶的核苷酸序列是編 碼具有醛糖還原酶活性的多肽的核苷酸序列，其中優選所述多肽具有與SEQ ID N0:8具有 至少50、60、70、80、90或者95%相同性的胺基酸序列，或者所述核苷酸序列在中等條件下、 優選在嚴格條件下能與SEQ ID NO: 16的核苷酸序列雜交。在本發明的宿主細胞中，降低宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾可 以與增加磷酸戊糖途徑流量的任何修飾組合，和/或與上述增加宿主細胞中特異性木酮糖 激酶活性的任何修飾組合，但是這些組合對於本發明不是必需的。因此，本發明特別包括僅 包含降低宿主細胞中非特異性醛糖還原酶活性的遺傳修飾的宿主細胞。在另外的方面中，本發明涉及進一步適應木糖利用的修飾的宿主細胞，其通過選 擇自發或者誘導的(例如通過輻射或者化學物質)在木糖上生長，優選在作為唯一碳源的 木糖上生長，更優選在厭氧條件下生長的突變體得到。突變體的選擇可以通過培養物的連 續傳代而進行，例如Kuyper et al. (2004，FEMS Yeast Res. 4 655-664)所述，或者通過在 恆化器培養物中在選擇壓力下培養而進行，如本發明實施例4所述。在優選的本發明宿主細胞中，上述至少一種遺傳修飾(包括通過突變體選擇而獲 得的修飾)賦予宿主細胞在作為碳源、優選作為唯一碳源的木糖上優選在厭氧條件下生長 的能力。優選所述修飾的宿主細胞基本上不產生木糖醇，例如產生的木糖醇低於檢測限度， 或者例如基於摩爾低於5、2、1、0. 5或者0. 3%消耗的碳。優選地，修飾的宿主細胞具有在作為唯一碳源的木糖上在厭氧條件下以生長率為 至少0. 05,0. 1,0. 2,0. 25或者0. 3/小時生長的能力，或者如果適合的話，則在厭氧條件下 所述生長率為至少0. 03,0. 05,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 12,0. 15或者0. 2/小時。優選地，修 飾的宿主細胞具有在作為唯一碳源的葡萄糖和木糖混合物(重量比為1 1)上在厭氧條 件下以生長率為至少0. 05,0. 1,0. 2,0. 25或者0. 3/小時生長的能力，或者如果適合的話， 則在厭氧條件下所述生長率為至少0. 03,0. 05,0. 1,0. 12,0. 15或者0. 2/小時。優選地，修飾的宿主細胞具有至少346、350、400、500、600、750或者IOOOmg木糖 /g細胞/小時的木糖消耗比速率。優選地，在木糖上，修飾的宿主細胞的發酵產物(如乙 醇)產量是在葡萄糖上所述宿主細胞的發酵產物(如乙醇)產量的至少55、60、70、80、85、 90、95或者98%。更優選地，在木糖上，修飾的宿主細胞的發酵產物(如乙醇)產量等於在 葡萄糖上所述宿主細胞的發酵產物(如乙醇)產量。同樣，在木糖上，修飾的宿主細胞的生 物量產量優選是在葡萄糖上所述宿主細胞生物量產量的至少55、60、70、80、85、90、95或者 98%。更優選地，在木糖上，修飾的宿主細胞的生物量產量等於在葡萄糖上所述宿主細胞的 生物量產量。應理解在葡萄糖和木糖上的產量對比中，二者均在需氧條件下對比，或均在厭氧條件下對比。在一個優選方面，本發明的修飾的宿主細胞是生產乙醇的宿主細胞。在另一方面， 本發明涉及生產除了乙醇之外的發酵產物的經轉化的宿主細胞。這些非乙醇發酵產物原則 上包括可由真核微生物如酵母或者絲狀真菌產生的任何粗製或精細化學物質。這些發酵產 物包括例如乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、胺基酸、1，3-丙二醇、乙烯、 甘油、內醯胺抗生素和頭孢菌素。產生非乙醇發酵產物的優選的本發明修飾的宿主細 胞是含有導致醇脫氫酶活性降低的遺傳修飾的宿主細胞。另一方面，本發明涉及發酵方法，其中本發明修飾的宿主細胞用於發酵包含木糖 來源(如木糖)的碳源。除了木糖來源之外，發酵培養基中的碳源還可包含葡萄糖來源。木 糖或者葡萄糖來源可以是木糖或者葡萄糖，或者可以是包含木糖或葡萄糖單位的任何碳水 化合物寡聚或多聚體，例如木質纖維素、木聚糖、纖維素、澱粉等。為了從這些碳水化合物中 釋放木糖或葡萄糖單位，可以向發酵培養基中加入合適的糖酶(如木聚糖酶、葡聚糖酶、澱 粉酶等)或者由修飾的宿主細胞產生合適的糖酶。在後者情況中，修飾的宿主細胞可以經 遺傳工程化產生並分泌這些糖酶。使用葡萄糖的寡聚或多聚體來源的一個額外優勢是例如 可以通過使用限速量的糖酶在發酵期間保持較低濃度的游離葡萄糖。這將防止非葡萄糖糖 類如木糖的代謝和轉運需要的系統的抑制。在優選的方法中，修飾的宿主細胞使木糖和葡 萄糖均發酵，優選同時發酵，在這種情況中優選使用對葡萄糖抑制不敏感的宿主細胞，以防 止二次生長。除了作為碳源的木糖(和葡萄糖)來源之外，發酵培養基進一步包含修飾的 宿主細胞生長需要的合適成分。適合微生物如酵母生長的發酵培養基的成分為本領域所熟 知。發酵方法是生產發酵產物如乙醇、乳酸、3-羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸 檬酸、胺基酸、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、β -內醯胺抗生素如青黴素G或青黴素V及其發酵 產物、及頭孢菌素的方法。發酵方法可以是需氧或者厭氧發酵方法。本文所述的厭氧發酵 方法是在無氧條件下或者基本上沒有氧被消耗的條件下進行的，優選氧的消耗低於5、2. 5 或者lmmol/L/小時，更優選為Ommol/L/小時(即檢測不到氧消耗)，其中有機分子既作為 電子供體也作為電子受體。在無氧條件下，糖酵解和生物量形成中產生的NADH不能通過氧 化磷酸化氧化。為了解決這個問題，許多微生物使用丙酮酸鹽或其衍生物之一作為電子和 氫的受體，從而再生NAD+。因此，在優選的厭氧發酵過程中，使用丙酮酸鹽作為電子(和氫 的受體)，並且還原為發酵產物如乙醇、乳酸、3_羥基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、 胺基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內醯胺抗生素和頭孢菌素。發酵方法優選在對於修飾的宿主細胞最佳的溫度下進行。因此，對於大多數酵母 或者真菌宿主細胞，發酵方法是在低於42°C、優選低於38°C的溫度進行。對於酵母或者絲 狀真菌宿主細胞，發酵方法優選在低於35、33、30或28°C並高於20、22或25°C的溫度進行。優選的方法是產生乙醇的方法，其中所述方法包括如下步驟(a)發酵含有木糖 來源及修飾的宿主細胞的培養基，其中所述宿主細胞發酵木糖產生乙醇；任選地(b)回收 所述乙醇。所述發酵培養基還可包含葡萄糖來源，其也被發酵產生乙醇。在所述方法中，乙 醇的體積生產量優選為至少0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5,3. 0,5. 0或者10. Og乙醇/升/小時。 在所述方法中木糖和/或葡萄糖的乙醇產量優選為至少50、60、70、80、90、95或98%。本文 所述的乙醇產量是理論最大產量的百分比，所述最大產量對於葡萄糖和木糖是0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。另一方面，本發明涉及一種產生選自如下一組的發酵產物的方法乳酸、3-羥 基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、胺基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內醯胺抗生 素和頭孢菌素。所述方法優選包括如下步驟(a)發酵含有木糖來源及修飾的宿主細胞的 培養基，其中所述宿主細胞發酵木糖產生發酵產物；任選(b)回收所述發酵產物。在優選的 方法中，所述培養基還含有葡萄糖來源。遺傳修飾為了在本發明的宿主細胞中過表達上述酶以及對宿主細胞(優選酵母)進行額 外的遺傳修飾，通過本領域熟知的方法用本發明的各種核酸構建體轉化宿主細胞。這些 方法例如 Sambrook and Russel (2001) 〃 Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或者 F. Ausubel et al, eds. , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)的標準手冊所描述。對真菌宿主 細胞進行轉化和遺傳修飾的方法可從例如EP-A-O 635 574、WO 98/46772、WO 99/60102和 WO 00/37671 中獲知。用於核酸構建體中以在本發明宿主細胞中過表達酶的啟動子已經在上文描述。在 進行過表達的核酸構建體中，編碼所述酶的核苷酸序列的3』末端優選與轉錄終止子序列可 操縱地連接。優選所述終止子序列在選擇的宿主細胞如選擇的酵母物種中是可操縱的。在 選擇的終止子不是關鍵因素的任何情況中，其可以例如來自任何酵母基因，儘管有時也可 以使用來自非酵母真核生物基因的終止子。轉錄終止序列進一步優選包含一個聚腺苷酸化 信號。任選地，在所述核酸構建體中可存在一種可選擇的標記。如本文所用，術語「標記」 是指編碼使得可以選擇或者篩選含有所述標記的宿主細胞的性狀或者表型的基因。所述標 記基因可以是抗生素抗性基因，因此合適的抗生素可用於從未轉化的細胞中選擇出轉化的 細胞。合適的抗生素抗性標記包括例如二氫葉酸還原酶、潮黴素-B-磷酸轉移酶、『-0-磷 酸轉移酶II (卡那黴素、新黴素和G418抗性)。儘管抗生素抗性標記可以是對於多倍體宿 主細胞的轉化最便利的，然而優選使用非抗生素抗性標記，如營養缺陷型標記(URA3、TRP1、 LEU2)或者粟酒裂殖酵母(S. pombe)TPI 基因(由 Russell P R, 1985,Gene 迎125_130 描 述)。在優選的實施方案中，用所述核酸構建體轉化的宿主細胞不含有標記基因。構建不含 有重組標記基因的微生物宿主細胞的方法在EP-A-O 635 574中揭示，並且基於使用雙向 標記如溝巢麴黴(A.nidulans)amdS(乙醯胺酶)基因或者酵母URA3和LYS2基因。或者， 可以將可篩選的標記如綠色螢光蛋白、lacZ、螢光素酶、氯黴素乙醯轉移酶、β-葡糖醛酸糖 苷酶摻入本發明的核酸構建體中，以可以篩選轉化的細胞。任選可以存在於本發明的核酸構建體中的其它元件包括但不限於一或多個前 導序列、增強子、整合因子、和/或報導基因、內含子序列、著絲粒、端粒和/或基質附著 (MAR)序列。本發明的核酸構建體可進一步包含自主複製序列，如ARS序列。合適的附加 型核酸構建體可例如基於酵母2 μ或者pKD 1 (Fleer et al.，1991，Biotechnology 9 968-975)質粒。或者，所述核酸構建體可包含優選通過同源重組進行整合的序列。這些序 列因此可以是與宿主細胞基因組中用於整合的靶位點同源的序列。本發明的核酸構建體
17可以已知的方式提供，通常包括限制和連接核酸/核酸序列的技術，參見如Sambrook and Russel(2001)「 Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或者 F. Ausubel et al, eds. , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)的標準手冊所述。使酵母或絲狀真菌中基因的失活和破壞的方法為本領域所熟知(見例如 Fincham, 1989, Microbiol Rev. 53(1) 148-70 和 EP-A-O 635 574)。附圖描述

圖1 在發酵罐中菌株RWB 212在含有2% (w/v)木糖作為碳源的合成培養基上的 厭氧生長典型圖，一式兩份實驗的差異小於5%。A組木糖(·)，乙醇(〇)，甘油(■) 及從氣體分析中推導的每升中產生的累積CO2 (-)。B組乾重(·)，乙酸鹽(〇)，木糖醇 (□)，琥珀酸鹽(▲)，乳酸鹽(Δ)。圖2 在發酵罐中菌株RWB 212在含有2% (w/v)葡萄糖和2% (w/v)木糖作為碳 源的合成培養基上的厭氧生長典型圖，一式兩份實驗差異小於5%。A組葡萄糖(·)，木 糖(〇)，乙醇(■)，甘油(□)及從氣體分析中推導的每升中產生的累積的C02(-)。B 組乾重(·)，乙酸鹽(〇)，木糖醇(■)，乳酸鹽(□)，琥珀酸鹽(▲)。圖3 :A組RWB 212在30g/l木糖作為碳源的厭氧恆化器培養期間的殘餘木糖濃 度。顯示的數據是兩個獨立恆化器的平均值和實驗偏差。B組RWB 212在30g/l木糖作為 碳源的厭氧恆化器培養期間的培養物乾重。顯示的數據是兩個獨立恆化器的平均值和實驗 偏差。圖4 在葡萄糖和木糖(均為20g/l)上厭氧分批培養的三個木糖代謝菌株的CO2 產生概況圖。精確的實驗條件有所變化，因此實際的數值不可對比。圖5 源自RWB 212的選擇的菌株在2%葡萄糖和2%木糖上在兩批獨立厭氧發酵 罐培養期間測定的葡萄糖、木糖、乙醇、甘油和CO2的濃度。
實施例1.材料和方法1. 1.質粒構建為了將TPIl啟動子整合在靶基因之前，構建一些質粒。首先將TPIl啟動子從 pYX012-Aat (A. A. Winkler, pYX012 的衍生物(R&DSystems, Minneapolis, MN, USA))中切割 為XhoI-EcoRV片段，並與用Sall-PvuII切割的pUG6[3]連接。這樣產生了 pUG6PTPI，然後 將其用於PCR擴增產生Kanlox-Pm整合盒。在推定的ORF的位置與靶基因的ATG非常接近的情況中，將這些基因克隆進 pUG6PTPI中。從凝膠中分離一個0.8kb RPEl片段和一個2. 3 kb TKLl片段，用EcoRI 和XhoI (存在於引物中，見表3)切割，並連接進用Ec0Rl-SalI消化的pUG6PTPI中，產生 pUG6PTPI-RPEl 和 pUG6PTPI-TKLl。為了增加木酮糖激酶的活性，將XKSl基因通過PCR擴增，產生SpeI-SalI片段(位 點在引物中，見表3)並克隆進用XbaI-XhoI切割的p415ADH[4]中，產生p415ADHXKS。根據廠商指導使用限制性核酸內切酶(New England Biolabs, Beverly, MA, USA
18and Roche, Basel, Switzerland)禾口 DNA 連接酶(Roche)。使用 Qiaprep spin miniprep 試 劑盒(QiagemHilden，Germany)從大腸桿菌中分離質粒。將DNA片段在瓊脂糖(Sigma， St. Louis,MO,USA)凝膠、1XTBE[5]中分離。使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Quiagen)從 凝膠中分離片段。使用VentK DNA聚合酶(New England Biolabs)根據廠商指導擴增RPE1、 TKLl和XKSl。模板是CEN. PKl 13-7D (wt)的染色體DNA。聚合酶鏈反應(PCR)在Biometra TGradient Thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)中進行，使用如下設置在60°C
退火1分鐘，在75 °C延伸3分鐘及在94°C變性1分鐘，循環30次。1. 2.菌株和培養基在此項研究中使用的釀酒酵母菌株是RWB212(MATA ura3-521eu2_112 IoxP-Ptpi: (-266，-1) TALI gre3 hphMX ρUGPtpi-TKL 1 pUGPTPI-RPE 1 KanloxP-Pm (- ？，_1) RKI1)，其衍生自 CEN. PK102-3A (MATA ura3-52 leu2_112)。在構建期間，將菌株維持在複合物(YP :10g/l酵母提取物(BDDifco)，20g/l蛋 白腖(BD Difco))或者合成培養基(MY)[6]上，補加葡萄糖(2%)作為碳源(YPD或 MYD)及在平板的情況中補加1.5%瓊脂。在轉化後，通過鋪板在含有200 μ g/ml遺傳黴 素(geneticin) (G418) (Invitrogen/GIBCO)和 300 μ g/ml 潮黴素 B (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)的YPD上選擇整合物。在用質粒轉化後，將菌株鋪板於MYD上。 根據Gietz and Woods [7]所述轉化酵母。將質粒在大腸桿菌菌株XL-Iblue (Stratagene，La Jolla, CA, USA)中擴增。根 據Inoue et al. [8]所述進行轉化。將大腸桿菌在LB(Luria-Bertani)平板或者液體 TB(Terrific Broth)培養基中生長以分離質粒[5]。1. 3.菌株構建通過擴增具有KanMX標記和TPIl啟動子的PCR片段，並通過同源末端將其定向於 靶定位置，將TPIl啟動子的TALl和RKIl整合在開放讀框的5，末端。使用Taq DNA聚合酶 (Amersham Pharmacia, Piscataway, USA)根據廠商指導進行 PCR。模板為 pUG6PTPI，PTALdisA 和PTALdisB或者PEKIdisA和PffiIdisB (表3)作為引物。在TKLl 和 RPEl 的情況中，將質粒 pUG6PTPI_TKLl 和 pUG6Pm_RPEl 分別用 PvuII 和SalI線性化，並整合進基因組中。用針對TALl用TALI intern+KanA和對TKL1、RPE1和 RPIl用Ptpi primer+ 「intern」進行菌落PCR而證實構建體的正確整合。「intern」引物與 整合的構建體的下遊退火，而Ptpi引物與TPIl啟動子的3』末端退火。在構建體整合後，用ere重組酶除去KanMX標記。為此將菌株用pSH47[3]轉化。 將具有該質粒的菌落再懸浮於具有的半乳糖的YP中，在30°c溫育1小時。然後將大約 200個細胞鋪板於YPD上。檢測所得菌落的KanMX標記和pSH47 (URA3)的喪失情況。另外，將GRE3基因用來自pAG32的hphMX盒置換，賦予潮黴素抗性[9]。將 hphMX 盒使用寡核苷酸 5』 gre3: :Kanlox 和 3』 gre3: :Kanlox 擴增。用 5』 GRE3+KanA 和 3，GRE3+KanB (表3)經PCR證實正確的整合。KanA和KanB分別與A. gossipi TEF啟動子 和終止子退火，而其它引物在GRE3開放讀框之外退火。使用Taq DNA聚合酶(Amersham Pharmacia,Piscataway,USA)根據廠商指導進行 菌落PCR。將模板細胞再懸浮於2. 5μ 1 0.02Μ NaOH中，向其中加入PCR反應混合物。在 Biometra TGradient Thermocycler (Biometra, Gottingen, Germany)中進行 PCR,使用如下設置在60°C退火1分鐘，在72°C延伸3分鐘，在94°C變性1分鐘，循環30次。然後將所得菌株RWB212(MATA ura3_52 leu2_112 IoxP-Ptpi: (-266, -1)TAL1 gre3: :hphMX pUGPm_TKLl pUGPTPI-RPElKanloxP-PTPI: : (- ？，_1)RKI1)用 pAKX002 以 及p415ADHXKS轉化，pAKX002是在TPIl啟動子之後含有Piromyces sp. E2 xylA的多拷 貝載體。產生 RWB217(MATA ura3-52 leu2_112 IoxP-Ptpi (-266，-l)TALlgre3: :hphMX PUGPtpi-TKL 1 pUGPTPI-RPEl KanloxP-Pm: (- ？，-1) RKIl {pAKX002, p415ADHXKS})。1. 4.菌株維持將原種培養物在30°C在搖瓶中的補加20g葡萄糖/1的合成培養基[6]上生長。 當達到穩定期時，加入無菌甘油至30% (vol/vol)，將2ml等份貯存在_80°C無菌瓶中。1.5.培養和培養基在合成培養基[6]中在30°C進行搖瓶培養。培養基的pH用2M KOH調節為6. 0，之 後進行滅菌。用冷凍的原種培養物接種500ml搖瓶中含有20g/l木糖的IOOml培養基而制 備預培養物。在30°C在環形搖瓶(200rpm)中溫育24-48小時之後，將這種培養物用於接種 搖瓶培養物或者發酵罐培養物。將用於厭氧培養的合成培養基補加溶解於乙醇中的0. Olg/ 1麥角固醇和0. 42g/l Tween 80[10，11]，這於培養基中產生ll_13mM乙醇。1.6.發酵罐中厭氧分批培養在裝備了Norprene 管的 2 升實驗室發酵罐(Appl ikon，Schiedam, The Netherlands)中在30°C和pH 5. O條件下進行厭氧分批培養，工作體積為1. 5升。以800rpm 攪動培養物，噴射0. 51/分鐘高級氮氣(< 5ppm氧)。將所述合成培養基補加厭氧生長因 子麥角固醇和Tween 80 (分別為0. 01和0. 42g/l)以及100 μ 1/1矽酮消泡劑(BDH, Poole, UK)。1. 7.培養物乾重的確定將培養物樣品(10.0ml)用預先稱重的硝化纖維素濾膜(濾孔大小0.45μπι; Gelman laboratory, Ann Arbor, USA)過濾。在除去培養基後，將濾膜用去礦物質水洗滌， 在微波爐(Bosch，Stuttgart，Germany)中在360W乾燥20分鐘並稱重。一式兩份確定的值 變化小於1%。1. 8.氣體分析將廢氣在冷凝器(2 °C )中冷卻，用Permapure乾燥器MD-110-48P-4型 (Permapure, Toms River, USA)乾燥。O2 禾口 CO2 濃度用 NGA 2000 分析儀(Rosemount Analytical, Orrville, USA)確定。廢氣流速和特定的氧消耗和二氧化碳產生速率如前述 確定[12，13]。在計算這些生物量比速率時，對取出培養物樣品導致的體積變化進行校準。1. 9.代謝物分析在含有Biorad HPX 87H 柱(Biorad, Hercules, USA)的 Waters Alliance 2690 HPLC(Waters,Milford,USA)上通過HPLC分析檢測葡萄糖、木糖、木糖醇、有機酸、甘油和乙 醇。將該柱在60°C用0. 5g/l H2SO4以0.6ml/分鐘流速洗脫。利用Waters 2410折射率檢 測儀和Waters 2487 UV檢測儀進行檢測。以如下方式經酶促確定木酮糖。反應混合物由 IOOmM Tris-HCl 緩衝液(pH7. 5)及 IOmM MgCl2、0. 30mM NADH 和足量樣品(Iml 總體積)組 成，所述分析通過加入0. 2U山梨醇脫氫酶(Sigma，St Louis, USA)起始。木酮糖濃度使用 對於NADH的6. Smr1CnT1吸收係數計算
20
1. 10.碳回收及乙醇蒸發碳回收(Carbon recoveries)以形成的產物中的碳除以消耗的糖碳總量而計算 並基於48%的生物量的碳含量。為了校正發酵過程中的乙醇蒸發，假定產生的乙醇量等於 測定的累積CO2產生量減去由於生物量合成產生的CO2產生量(每克生物量為5. 85mmol CO2[14])和與前述的乙酸鹽形成相關的C02[2]。1. 11微陣列分析如前所述進行從恆化器取樣細胞、探針製備和與Affymetrix Genechip 微陣列 的雜交[15]。每一生長條件的結果衍生自3個獨立培養的複製培養物。1. 12.數據獲得和分析陣列圖像的獲得和定量以及數據過濾用Affymetrix軟體包Microarray Suite v5. 0, MicroDB ν3· O 禾口 Data Mining Tool ν3·0 進 亍。在對比前，用Microarray Suite v5. O使用來自全部基因特徵的平均信號將所有 陣列全局設定為靶值為150。從YG-S98陣列上的9335個轉錄物特徵，施加一濾波器以提 取6383個酵母開放讀框，其中有6084個不同基因。這一差異是由於當在陣列設計中使用 次最佳探針組時一些基因被呈現超過一次而導致的。為了表示一式三份測定值中的偏差，如Boer et al. [16]所述計算變異係數 (C. V.；標準偏差除以平均值)。為了進一步的統計學分析，使用運行Significant Analysis of Microarrays (SAM vl. 12) add in的Microsoft Excel [17]以用於8個數據集的可能的配對形式的對比。如果 使用SAM(預期中位錯誤發現率(FDR)為)發現基因在各種條件下彼此顯著改變至少2 倍，則它們被認為表達改變。隨後用Genespring(Silicon Genetics)進行所獲得的顯著改 變表達水平的集合的分層簇集(Hierarchical clustering)。1. 13 酶分析木糖異構酶活性在37°C在含有50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7. 0)、IOmM木糖、IOmM MgCl2和適量的無細胞提取物的反應混合物中分析。形成的木酮糖的量通過半胱氨酸_咔 唑方法(9)確定。或者木糖異構酶活性在30°C通過Kersters-Hildersson et al. (Kinetic characterization of D-xylose isomerases by enzymatic assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Technol. 9 (1987) 145-148)開發的酶分析方法確定。轉化的釀 酒酵母菌株的無細胞提取物中木糖異構酶的體外活性依賴於二價陽離子(Mg2+或者Co2+)。木酮糖激酶和木糖還原酶活性如Witteveen et al. (28)所述分析。一活性單位 是指在分析條件下每分鐘產生Inmol木酮糖需要的酶量。形成的木酮糖通過Dische and Borenfreund (Dische and Borenfreund, 1951, J. Biol. Chem. 192 583-587) fffi^Tj^M^., 或者通過使用在80°C運行的Biorad HPX-87N Column的HPLC及使用0. OlM Na2HPO4作為 洗脫劑以0.6ml/分鐘洗脫確定。木糖和木酮糖通過Refractive Index檢測儀在60°C內部 溫度進行檢測。比活性以每mg蛋白質的活性單位表示。蛋白質使用Bio-Rad蛋白質試劑(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA)及牛Y -球蛋白作為標準確定。2.結果2. 1磷酸戊糖途徑(PPP)基因的過表達
先前我們已經示出在釀酒酵母中表達真菌木糖異構酶在原則上足以使得該酵母 在作為唯一碳源的木糖上厭氧生長，條件是應用足夠的選擇壓力[2]。然而選擇的菌株仍不 能達到工業化需要(表1)。為了研究限速步驟在磷酸戊糖代謝中的可能性，決定構建過度產生將木糖轉變為 果糖-6-磷酸和甘油醛-3-磷酸所需要的所有酶的菌株。所述過表達的酶是木糖異構 酶(XI)、木酮糖激酶(XKS)、核酮糖-5-磷酸異構酶(R5PI)、核酮糖-5-磷酸差向異構酶 (R5PE)、轉羥乙醛酶(TKT)和轉醛醇酶(TAL)。另外，缺失由GRE3編碼的非特異性醛糖還原 酶，其介導不希望的木糖醇產生[18]。由於PPP中一些酶底物不可商購，因此決定通過DNA 陣列而不是通過酶活性測定檢測過表達情況。表1列出的結果進一步證實靶基因的轉錄在 菌株RWB 212中被成功修飾。表1 在參考菌株釀酒酵母CEN. PK113-7D及在工程化的木糖異構酶表達菌株釀酒 酵母RWB212中編碼木酮糖激酶和磷酸戊糖途徑酶的結構基因的mRNA水平。這兩個菌株均 在需氧、葡萄糖受限的恆化器培養中生長(D = 0. IOtT1)。轉錄水平用Affymetrix GeneChip 微陣列確定。數據是對於每個菌株進行的三個獨立培養分析的平均值士平均偏差。ACTl (Ng and Abelson,1980, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 77 3912-3916)禾口 PDAl(Wenzel et al., 1995，Nucleic. Acids Res. 23 883-884)作為內部標準。 η. d.=未確定(未呈現在Affymetrix微陣列中)；aNC =未改變2. 2工稈菌株的牛理學鑑定工程菌株的一個顯著性質是其不需要任何選擇壓力而在木糖上厭氧生長的能力 (圖1)。在基本培養基中的木糖上厭氧生長持續進行，生長速度高達o.ogtr1。木酮糖未積 累，但是木糖醇形成，儘管極少，但是可以檢測到(圖1)。菌株RWB 212在木糖上的生物量、乙醇和甘油產量與通過進化工程獲得的RWB 202-AFX相當(表2)。從表2中可以計算木糖 消耗比速率大於1. Og木糖/g生物量/小時(Qs = 0. 09/0. 085 = 1. 059gr Xyl/gr X/h)， 對比之下RWB 202-AFX的是345mg木糖/g生物量/小時，而獲得的產量與在葡萄糖上獲得 的產量至少是相似的。2. 3混和底物的利用如在導言中指出，半纖維素水解產物被經濟轉變為乙醇需要葡萄糖和木糖均發 酵，優選同時發酵。為了核實菌株RWB 212關於混和的糖利用的性質，將該酵母生長在葡萄 糖和木糖的混合物中(木糖和葡萄糖均為ZOgr1)。圖2描述的結果示出這兩種糖均被完 全消耗，但是葡萄糖是優選的底物。在葡萄糖消耗大約80%之後，木糖開始消耗。3.酵母中多形擬桿菌木糖異構酶的功能件表汰將編碼多形擬桿菌VPI-5482木糖異構酶的核苷酸序列(登記號AA075900或者 NP 809706 ；SEQ ID NO :10)克隆進多拷貝酵母表達載體中，產生p426GPDBtXI。將這個 質粒用於轉化 RWB215(MATura3-52 leu2_112 loxP-PTPI (-266，-1) TALI gre3: :hphMX pUGPTPI-TKLlpUGPTPI-RPEl KanloxP-Pm: : (- ，_1)RKI1)，將其用 p415ADHXKS 進一步轉化 以過表達木酮糖激酶。挑取兩個獨立轉化體，這兩個轉化體均能在木糖為唯一碳源的基本 培養基上生長，在轉化體的裂解物中測定特異性木糖異構酶活性為140+/-20U/mg蛋白質， 相比之下對於表達Piromyces木糖異構酶的菌株的活性為大約1300U/mg蛋白質。4. RffB 212 的詵擇將菌株RWB 212 (見上述)通過在厭氧培養恆化器(duplo)中與作為碳源的30g/ 1木糖一起培養而置於選擇壓力下，估計生長速率為0. 06/小時。選擇方法通過確定培養物 乾重和殘餘木糖濃度而監測。初始殘餘的木糖濃度為大約30mM，但是在26個世代後(300 小時)，殘餘的木糖濃度降低至低於15mM(圖3A)，也觀測到生物量濃度相應增加(圖3B)。在530小時從這些恆化器培養物中取樣，並將這些樣品鋪板於補加了 2%葡萄糖 的基本培養基瓊脂平板上。在30°C培養62小時後，將這些平板的單一菌落在新鮮葡萄糖平 板上劃線培養。在30°C溫育72小時後，選擇兩個菌落(每個獨立的恆化器選擇一個菌落) 並接種預培養物(需氧搖瓶，含有葡萄糖的基本培養基)以用於在20g/l葡萄糖和20g/l 木糖上的厭氧發酵罐分批培養。從圖4的CO2廢氣信號中可見這些培養物與親代菌株RWB 212及另一個選擇菌株 RWB 202-AFX相比具有出眾的木糖利用特性。「新的」選擇菌株當消耗木糖時呈現CO2產生 率增加，這在親代菌株中未觀測到。圖5描述了主要在木糖消耗期間這兩個獨立分批培養 物的上清中碳源和產物的測定濃度。這兩個實驗的全部(即葡萄糖+木糖期)乙醇體積生 產率高於0. 5g/L.小時，第一批培養物也表明在木糖消耗期的體積生產率高於0. 5g/L小 時。5.菌株 RffB 204.206.208 和 210 的測試測試的菌株如專利文件和Kuyper et al. ,2005, FEMSYR 5 :399_409所述構建。修 飾的基因如下表列出。所使用的菌株中過表達和缺失的基因列表
23 在導入上表中列出的修飾之後，將所有菌株均用兩種質粒轉化表達Piromyces 木糖異構酶的PAKX002和表達內源木酮糖激酶的質粒p415ADHXKS。在上述文章中用這兩 種質粒轉化的RWB 212以單獨編號命名RWB 217。用這兩種質粒對RWB 212重複轉化產生 RffB 223。在轉化後，將單菌落在具有葡萄糖的合成培養基瓊脂平板上劃線培養。從這些平 板接種具有合成培養基和20g/l木糖的搖瓶培養物並在30°C溫育48小時。每一搖瓶培養 物用於接種一個具有合成培養基和20g/l木糖的厭氧發酵罐。在溫育48小時後，通過目測確定用RWB 204接種的搖瓶未生長。所有四個搖瓶均 用於接種一個發酵罐。發酵罐中的生長情況通過測定廢氣中CO2的濃度而監測。為了進行參考，在圖1中也給出了 RWB 217禾PRWB 223 (均具有Tal、TKL、RPEj^ RKI過表達)的CO2概況。在100小時期間，在RWB204和RWB 206分批培養的廢氣中未測 出明顯CO2產生。從這些CO2產生圖中確定的生長率對於RWB 208、217和223為0. 121Γ1， 對於RWB210確定為0. OSr10從這些結果中可以看出，轉醛醇酶和轉羥乙醛酶的過表達對 於在木糖上厭氧生長是必需的。另外，在RWB 210中核糖5-磷酸差向異構酶的額外過表達 降低在木糖上的生長率。RPEl的過表達可能破壞木酮糖-5P、核酮糖-5P與核糖-5P之間 的平衡，阻礙轉羥乙醛酶的活性。在這些實驗條件下，R5P-差向異構酶和-異構酶的額外 過表達未進一步改良厭氧木糖發酵的性能。表2 在發酵罐中厭氧分批培養期間，由野生型CEN. PK 113-7D、選擇的菌株RWB 202-AFX和工程菌株RWB 212的生長參數、糖消耗和產物形成。數值表示兩個獨立分批培養 的平均值和實驗偏差。
產物:
生物量(g Γ1) CO2 (mmoles I"1) 乙醇e(mM) 木糖醇(mM) 木酮糖(mM)d 甘油(mM) 乙酸(mM) 琥珀酸(mM) 乳酸(mM)a在葡萄糖消耗階段確定。b基於從CO2產生中推導的乙醇濃度計算，見1.10。e 從CO2產生中推導，見1.10。d瞬時積累。這個值表示在對數中期期間的最高濃度。在生長 結束時，所有木酮糖均已經被再消耗，在所有其它培養物中，木酮糖濃度保持在低於檢測限度。
2.07 ± 0.06 197.1 ±3.4 181.6 士 3.9 <0.01 <0.01 22.9 ± 0.2 3.42 ±0.11
0.26 士 0.01
1.70 ±0.02
1.64 土 0.01 196.9 土 1.3 180.3± 1.4 <0.01 <0.01 24.2 ±0.1 6.93 ± 0.02 0.27 土 0.02 1.49 ±0.02
1.81 ±0.08
199.7± 1.5
186.8±2.2 2.76 ± 0.03 7.98 ± 0.09 18.3 ±0.3 2.26 ±0.16 0.75 ± 0.00 0.95 ± 0.02
1.70 ±0.04 199.9± 1.5 188.5 ± 1.3 0.38 ±0.04 <0.01 17.8±0.2 1.40 ±0.07 0.39 ±0.02 1.46 ±0.01
2.97 土 0.04
391.6±0.6
370.7±0.4 0.78 士 0.00 <0.01 32.7 ± 0.3 3.54 ±0.02 0.96 ± 0.00 2.78 ± 0.03 表4:本文中使用的質粒 參考文獻1. Bruinenberg, P. Μ. , De Bot, P. H. M, Van Di jken, J. P. and Scheffers, W. Α. (1983)The role of the redox balance in the anaerobic fermentation of xyloseby yeasts. Eur. J. App 1. Microbiol. Biotechnol. 18，287-292.2. Kuyper, M. ，Winkler, A. A. ，Van Dijken, J. P. and Pronk, J. T. (2004)Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylosefermentation :a proof of principle. FEMS Yeast Res.4,655-664.3· Guldener，U· , Heck, S.，Fiedler，T·，Beinhauer，J· and Hegemann, J. H. (1996) A new efficient gene dismption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic Acids Res. 24,2519-2524.4. Mumberg, D.，Muller，R. and Funk，M. (1995) Yeast Vvectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156，119-122.5. Sambrook, K. .，Fritsch，E. F. . and Maniatis，I. (1989)Molecular cloning :A laboratory manual，2nd edn.，Cold spring harbour, New York.6. Verduyn, C.，Postma，E.，Scheffers，W. A. and Van Di jken，J. P. (1992) Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts :a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast 8，501—517.7. Gietz, R. D. and Woods, R. A. (2002) Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzymo1. 350，87-96.8. Inoue，H.，Nojima，H. and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96，23—28.9. Goldstein, A. L. and McCusker, J. H. (1999) Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 15， 1541-1553.10. Andreasen，A. A. and Stier，T. J. (1953) Anaerobic nutrition of Saccharomyces cerevisiae.I. Ergosterol requirement for growth in a defined medium. J. Cell Physiol. 41, 23-36.
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權利要求
一種具有將木糖直接異構為木酮糖能力的真核宿主細胞，其中所述宿主細胞包含增加磷酸戊糖途徑流量的遺傳修飾，且所述宿主細胞具有至少346mg木糖/g生物量/小時的木糖消耗比速率。
2.權利要求1的宿主細胞，其中所述遺傳修飾包括磷酸戊糖途徑非氧化部分的至少一 個基因的過表達。
3.權利要求2的宿主細胞，其中所述基因選自編碼核酮糖-5-磷酸異構酶、核酮 糖-5-磷酸差向異構酶、轉羥乙醛酶和轉醛醇酶的基因。
4.權利要求2的宿主細胞，其中所述遺傳修飾包括至少編碼轉羥乙醛酶和轉醛醇酶的 基因的過表達。
5.權利要求2-4任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞進一步包括增加特異性木酮糖 激酶活性的遺傳修飾。
6.權利要求5的宿主細胞，其中所述遺傳修飾包括編碼木酮糖激酶的基因的過表達。
7.權利要求2-6任一項的宿主細胞，其中所述過表達的基因是宿主細胞內源的。
8.權利要求1-7任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞包括降低宿主細胞中非特異性 醛糖還原酶活性的遺傳修飾。
9.權利要求8的宿主細胞，其中所述遺傳修飾降低編碼非特異性醛糖還原酶的基因的 表達或者使所述基因失活。
10.權利要求9的宿主細胞，其中所述基因是通過缺失該基因的至少一部分或者破壞 該基因而失活。
11.權利要求8或9的宿主細胞，其中宿主細胞中編碼非特異性醛糖還原酶的每個基因 的表達均被降低或失活。
12.前述任一項權利要求的宿主細胞，其中所述宿主細胞是酵母，優選是屬於如下 屬之一的酵母糖酵母屬(Saccharomyces)，克魯維酵母屬(Kluyveromyces)，假絲酵母 屬(Candida)，畢赤酵母屬(Pichia)，裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)，漢遜酵母屬 (Hansenula)，克勒克酵母屬(Kloeckera)，許旺酵母屬(Schwanniomyces)和耶氏酵母屬 (Yarrowia)。
13.權利要求12的宿主細胞，其中所述酵母屬於如下物種之一釀酒酵母 (S. cerevisiae)、S. bulderi、S. barnetti、少孢酵母(S. exiguus)、葡萄汁酵母 (S. uvarum)、糖化酵母(S. diastaticus)、乳酸克魯維斯酵母(K. Iactis)、馬克斯克魯維酵 母(K. marxianus)、脆壁克魯維酵母(k. fragilis)。
14.權利要求1-11任一項的宿主細胞，其中所述宿主細胞是絲狀真菌，優選是屬 於如下屬之一的絲狀真菌麴黴屬(Aspergillus)，木黴屬(Trichoderma)，腐質黴屬 (Humicola),枝頂孢屬(Acremonium),鐮孢菌屬(Fusarium)禾口青黴屬(Penicillium)0
15.前述任一項權利要求的宿主細胞，其中所述宿主細胞表達賦予宿主細胞產生至少 一種發酵產物能力的一或多種酶，所述發酵產物選自乙醇、乳酸、3_羥基丙酸、丙烯酸、乙 酸、琥珀酸、檸檬酸、胺基酸、1，3_丙二醇、乙烯、甘油、β-內醯胺抗生素和頭孢菌素。
16. 一種生產乙醇的方法，其中所述方法包括如下步驟(a)發酵含有木糖來源及權利要求1-14任一項的修飾的宿主細胞的培養基，其中所述 宿主細胞發酵木糖成為乙醇，及任選地(b)回收所述乙醇。
17.權利要求16的方法，其中所述培養基還含有葡萄糖來源。
18.權利要求16或17的方法，其中乙醇體積生產率為至少0.5g乙醇/升/小時。
19.權利要求16-18任一項的方法，其中乙醇產量為至少50%。
20.一種生產發酵產物的方法，所述發酵產物選自乳酸，3-羥基-丙酸，丙烯酸，乙酸， 琥珀酸，檸檬酸，胺基酸，1，3_丙二醇，乙烯，甘油，β -內醯胺抗生素和頭孢菌素，所述方法 包括如下步驟(a)發酵含有木糖來源及權利要求15的修飾的宿主細胞的培養基，其中所述宿主細胞 發酵木糖成為發酵產物，及任選地，(b)回收所述發酵產物。
21.權利要求20的方法，其中所述培養基還含有葡萄糖來源。
全文摘要
本發明涉及真核宿主細胞中的進一步遺傳修飾，所述真核宿主細胞已經被轉化而表達賦予宿主細胞使木糖異構為木酮糖的能力的木糖異構酶。所述進一步遺傳修飾目的在於改善木糖代謝的效率，包括例如降低非特異性醛糖還原酶活性、增加木酮糖激酶活性及增加磷酸戊糖途徑的流量。本發明的修飾的宿主細胞適於在利用木糖來源或者木糖和葡萄糖來源作為碳源的發酵過程中生產包括乙醇在內的各種發酵產物。
文檔編號C12P7/18GK101914462SQ20101024313
公開日2010年12月15日 申請日期2005年7月15日 優先權日2004年7月16日
發明者威廉默斯·特奧多魯斯·安東尼厄斯·馬裡亞·德拉特, 約翰內斯·彼得·范戴肯, 西普克·馬爾滕·凱珀, 阿龍·阿德裡安·溫克勒, 雅各布斯·託馬斯·普龍克 申請人:代爾夫特技術大學