一種響應面法優化產酶溶桿菌OH11生產活性抗菌物質HSAF的方法與流程

2023-05-05 01:27:36

本發明屬於微生物發酵工程
技術領域：
：，具體涉及到一種響應面法優化產酶溶桿菌oh11生產活性抗菌物質hsaf的方法。
背景技術：
：：目前農業生產上對農作物病蟲害的防治方法主要依賴於化學防治，而大量化學農藥的使用不僅會對土壤、水體及大氣帶來不良影響，同時還會不可避免地引發嚴重的「3r」(殘留risidue、有害生物再猖獗resurgence、病原物的抗藥性resistance)和「三致」(致畸、致癌、致突變)危機。生物農藥是指利用生物活體、生物代謝產物或生物特定基因而製成的農藥，目前研發和應用較多的有農用抗生素(井岡黴素、阿維菌素等)、微生物農藥(蘇雲金桿菌、假單胞菌等)、植物源農藥(苦參鹼、除蟲菊素等)等，其具有低毒、低殘留、不易產生抗藥性等優點，因而在近年來受到格外的關注。熱穩定抗真菌因子(heatstableaniifungalfactor，hsaf)是一類含有四胺酸殘基的大環內酞胺類化合物(如下式)，由graupner等於1997年首次從鏈黴菌streptomyces.sp發酵液中分離而得的，hsaf具有獨特的抗真菌機制，能抑制多種植物病原菌和原生動物，而且生物學實驗表明，hsaf的作用靶標是鞘脂類的生物合成途徑，只對絲狀真菌有抑制，對哺乳動物和植物不起作用，這說明使用hsaf安全性高，對人體基本無毒性，可作為良好的生物源農藥用於生物防治。儘管對hsaf生物合成的遺傳調控機制有了充分的了解，但其產量仍然較低(僅為30-60mg/l)，與工業化生產水平差距較大，阻止了其進一步商業化推廣和應用。為了提高hsaf產量，儘快實現工業化生產，有必要進一步對其發酵工藝進行深入研究，通過改善發酵環境，充分發揮菌株的潛在生產能力，從而滿足工業化生產和市場的需求。技術實現要素：針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種響應面法優化產酶溶桿菌oh11生產活性抗菌物質hsaf的方法，對hsaf的工業化生產和市場需求具有重要意義。本發明的目的通過以下措施達到：一種響應面法優化產酶溶桿菌oh11生產活性抗菌物質hsaf的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將菌株產酶溶桿菌(l.enzymogenes)oh11接入lb液體培養液中，過夜培養後劃線於lb固體平板培養基上，培養後即得活化的菌株；(2)種子液的培養：將步驟(1)活化的菌株接入到lb液體培養液中振蕩培養至od600＝1.0-2.0，即為發酵所用的種子液；(3)發酵培養：將步驟(2)中培養好的種子液按照(0.8-1.2)％的體積比接種於發酵培養基中進行發酵培養，發酵培養條件為：裝液量20-24％，發酵溫度25-27℃，發酵時間56-60h，所述發酵培養基的配比為：黃豆粉7.80-8.10g/l，葡萄糖7.69-7.99g/l，cacl20.70-0.74g/l；(4)發酵液中hsaf提取與檢測：發酵液酸化後，加入惰性物質和乙酸乙酯，渦旋混合振蕩萃取，離心、吸取上清液提取hsaf，並通過hplc檢測發酵液中hsaf具體產量。優選的，步驟(3)中對hsaf發酵有顯著性影響因素為裝液量、培養溫度和發酵周期，其最佳條件分別為裝液量22％、26℃、58h，所述發酵培養基的配比為：黃豆粉8.00g/l，葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l。優選的，步驟(3)發酵培養的搖床振蕩轉速為180-250rpm，更優選200-220rpm。步驟(1)中所述的lb液體及固體平板培養基配方為：胰蛋白腖10.0g/l，nacl10.0g/l，酵母粉5.0g/l；lb固體平板培養基另在每升lb液體培養液中加入2g瓊脂粉。優選的，步驟(1)中所述的過夜培養條件為：溫度28-35℃，更優選28-30℃；搖床轉速180-220rpm，更優選180-200rpm。優選的，步驟(1)中lb固體平板培養基的培養條件為：28-35℃恆溫培養箱靜置培養2-3天，更優選28-30℃下培養2d。優選的，步驟(2)中的振蕩培養條件為：溫度28-35℃，轉速150-220rpm，時間10-25h，更優選為28-30℃，轉速180-200rpm，時間12-18h。優選的，步驟(4)中發酵液中hsaf提取與檢測的方法為：發酵液酸化後，加入惰性物質和乙酸乙酯，渦旋混合振蕩萃取，離心、吸取上清液提取hsaf，並通過hplc檢測，利用hsaf濃度與吸收峰面積間的標準曲線換算成發酵液中hsaf具體產量；所述惰性物質選自溶於水而不溶於乙酸乙酯的無機鹽。優選的，所述發酵液可以選用實驗室中常用於調節ph的酸來進行酸化，如濃鹽酸、濃硫酸等；本發明中發酵液酸化至ph2.0-5.0，優選酸化ph至3.0-4.5。優選的，所述的惰性物質為溶於水而不溶於乙酸乙酯的無機鹽，優選為nacl、cacl2、mgcl2或na2so4中的任意一種或者幾種的組合；更優選的為cacl2或nacl或二者的組合；本發明通過惰性物質的加入，能顯著降低乙酸乙酯在發酵液中的溶解度，使乙酸乙酯從發酵液中游離出來，並伴隨著hsaf從發酵液中轉移到乙酸乙酯中，實現hsaf的分離；在整個過程中，因不存在穩定、大量的傳質界面，故破壞了乳化形成的基本條件，有效地克服了乳化問題。優選的，所述的惰性物質的單位為g，發酵液體積的單位為ml，惰性物質添加量與發酵液體積的比為(0.1-0.3)g：1ml；優選(0.15-0.25)g：1ml；更優選的(0.15-0.20)g：1ml。惰性物質添加量低於此範圍時，破乳效果不佳。本發明選用乙酸乙酯做萃取劑，萃取效率高，且易分層；優選乙酸乙酯與發酵液體積比為0.5-1.5:1，更優選0.8-1.2:1。乙酸乙酯與發酵液體積比在此範圍內，可以提高萃取效率。本發明選用渦旋混合振蕩處理，有機溶劑和發酵液接觸更充分，萃取時間大大縮短，可以將萃取時間縮短至2min以內，優選的振蕩條件為1000-2500rpm，0.5-2min；更優選1500-2000rpm，1-1.5min。優選的，所述的離心是在常溫、5000-8000rpm條件下、離心5-10min。作為本發明一種更為具體的方案：一種響應面法優化產酶溶桿菌oh11生產活性抗菌物質hsaf的方法：(1)分別進行單因素考察，研究不同氮源、碳源和無機鹽對l.enzymogenesoh11發酵生產hsaf的影響，確立了最適的氮源為黃豆粉，碳源為葡萄糖，無機鹽為cacl2，且它們的最佳濃度分別為7g/l、5g/l、0.6g/l；接著，以發酵液中hsaf產量為響應值進行試驗設計，按照box-behnkendesign(bbd)試驗方案進行搖瓶實驗並對結果進行統計分析，獲得本發明所述的培養基配方，通過優化，hsaf實際產量可達356.34mg/l以上；(2)首先採用plackett-burman(pb)試驗對影響產酶溶桿菌oh11生產hsaf的發酵因素進行效應評價，篩選出影響hsaf產量的顯著性因素；然後利用最陡爬坡法對以上顯著因素進行最大響應區域逼近，確定響應面分析的中心點；最後通過bbd響應面設計試驗，建立以hsaf產量為響應值的多元二次回歸方程模型，從中分析得到最適的發酵條件；通過進一步優化後的hsaf產量達到440.26mg/l，比(1)優化後(356.34mg/l)又進一步提高了23.56％；其中，所述的pb試驗中發酵因素包括接種量(x1)、裝液量(x2)、初始ph值(x3)、培養溫度(x4)、搖床轉速(x5)、發酵周期(x6)6個因素；對hsaf產量有顯著性效應的因素為x2、x4和x6；其中，所建立的多元二次回歸方程模型為：y＝-19495.70+603.09x2+525.02x4+236.42x6-12.13x2x4+0.70x2x6-3.74x4x6-7.38x22-1.43x42-1.33x62，式中x2為裝液量、x4為培養溫度、x6為發酵周期。其中，所述的pb試驗、最陡爬坡試驗和bbd試驗均在500ml搖瓶上進行，培養基成分為(1)優化得到的培養基配方；優化後的方法包括以下步驟：(1)菌株活化：將菌株l.enzymogenesoh11接入lb液體培養液中，過夜培養後劃線於lb固體平板培養基上，培養後即得活化的菌株；(2)種子液的培養：將步驟(1)活化的菌株接入到lb液體培養液中振蕩培養至od600＝1.0-2.0，即發酵所用的種子液；(3)發酵培養：將步驟(2)中培養好的種子液按照(0.8-1.2)％的體積比接種於發酵培養基中進行發酵培養；發酵培養條件為：裝液量20-24％，發酵溫度25-27℃，發酵時間56-60h，所述發酵培養基的配比為：黃豆粉7.80-8.10g/l，葡萄糖7.69-7.99g/l，cacl20.70-0.74g/l。(4)發酵液中hsaf提取與檢測。本發明具有如下突出的效果：(1)本發明中得到的培養基原料來源廣、成本低、比較適合工業化生產。(2)本發明中明確了對hsaf產量有顯著性效應的因素為裝液量、培養溫度和發酵周期，對後續的工業化生產具有指導意義。(3)本發明中純化的hsaf純度＞95％，對缺乏hsaf標準品的市場是一個極大的補足。(4)利用本發明方案最終能使hsaf產量提高到440.26mg/l，是對照10％tsb(29.24mg/l)的15倍，為其工業化生產奠定了基礎。附圖說明圖1hplc檢測圖，(a)發酵液中hsaf；(b)純化的hsaf；圖2為hsaf濃度與吸收峰面積間的標準曲線圖；圖3(a)不同氮源對hsaf發酵的影響(b)黃豆粉濃度對hsaf發酵的影響；圖4(a)不同碳源對hsaf發酵的影響(b)葡萄糖濃度對hsaf發酵的影響；圖5(a)不同無機鹽對hsaf發酵的影響(b)cacl2濃度對hsaf發酵的影響；圖6黃豆粉、葡萄糖及cacl2間的交互作用對hsaf產量的影響；圖7不同有機溶劑萃取發酵液中hsaf過程的現象；圖8添加惰性物質時hsaf萃取過程的現象。具體實施方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1：hsaf發酵培養基的單因素考察取出-80℃超低溫冰箱中的l.enzymogenesoh11菌株甘油管，冰上融化後倒入含5mllb培養液的菌種瓶中，28℃下200rpm過夜培養後用接種環蘸取菌液在固體平板上劃線，於30℃恆溫箱中靜置培養2d。劃取平板上的單菌落菌株於50mllb培養液中，28℃下200rpm振蕩培養12h至od600＝1.5，即得到種子液。按照1.0％的接種量接入發酵培養基中，28℃、150rpm下培養48h，每組實驗設三個平行。單因素試驗是在5g/l酵母粉、2.5g/l葡萄糖和0.5g/lnacl作為基礎培養基上進行的，只需要替換相應考察對象即可，其他不變。(1)氮源的篩選：選取(nh4)2so4、nh4cl、nano3、尿素、酵母粉、玉米粉、牛肉膏、黃豆粉8種原料作為培養基中的唯一氮源，考察不同氮源對hsaf合成的影響。由圖3(a)所示，以黃豆粉作為唯一氮源時，發酵液中hsaf的含量最高，達到258.34mg/l，其次是牛肉膏，而使用無機氮源如(nh4)2so4、nh4cl、nano3、尿素僅有少量hsaf產生。由此可見，黃豆粉是最適合l.enzymogenesoh11合成hsaf的氮源，進一步，對其添加比例進行了考察，如圖3(b)所示，隨著黃豆粉比例的增加，hsaf的濃度逐漸增大，在7g/l時達到最高。(2)碳源的篩選：選取6種不同碳源(可溶性澱粉、蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘油)考察其對hsaf合成的影響。由圖4(a)所示，添加麥芽糖和葡萄糖時，hsaf的產量基本一致，均高於其他兩種碳源。又由於葡萄糖作為一種工業發酵中最常用的碳源，不僅來源廣泛，而且價格低廉，因此這裡選用葡萄糖作為最佳碳源。接著，對葡萄糖的添加比例進行了研究，如圖4(b)所示，hsaf產量在添加5g/l葡萄糖時達到最大，為268.56mg/l，隨後出現緩慢地下降。(3)無機鹽的篩選：分別添加nacl、mgcl2、cacl2、mnso4、znso4、feso4、kh2po4考察不同無機鹽對hsaf合成的影響，添加量均為0.2g/l，每組設3個重複。由圖5(a)可知，除了k2hpo4對hsaf的合成產生不利的影響，其餘無機鹽都能一定程度地促進hsaf的發酵過程，特別是添加cacl2能夠極大地刺激hsaf的合成，hsaf的產量為所取無機鹽中最大，故選用無水cacl2作為最佳無機鹽。通過對cacl2添加比例進行了考察，如圖5(b)，發現不同濃度cacl2對hsaf合成的影響不是很顯著，在0.6g/l比例是比其他條件稍微有所提高。實施例2：hsaf發酵培養基的優化根據單因素試驗選取各自最高值作為bbd試驗設計的中心點(即0水平)，建立因素水平表。並以l.enzymogenesoh11代謝產物hsaf的濃度為響應值，利用designexpert軟體根據bbd設計原則進行優化，如表1所示。表1hsaf發酵培養基成分bbd試驗設計及其結果根據表1的響應面試驗結果進行多元回歸擬合，得到發酵液中hsaf產量對黃豆粉(x1)、葡萄糖(x2)、cacl2(x3)濃度的二次多項回歸擬合方程：y＝-334.00+67.50x1+6.25x2-36.25x3-10.00x1x2-5.00x1x3+22.50x2x3-69.75x12-97.25x22-52.25x32，r2＝0.9863。通過統計軟體designexpert對試驗結果的分析，得出各發酵配方的最佳方案為：黃豆粉8.00g/l，葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l，此時hsaf理論值最大值為350.65mg/l。按照以上最佳配方，重複3次實驗，結果顯示該配方能使hsaf產量提高到356.34mg/l，與理論值十分接近，證明本發明方案具有可行性。並且通過響應面及其等高線圖對不同因素間的交互關係進行分析。由圖6(a為黃豆粉與葡萄糖交互作用的響應面圖；b為黃豆粉與cacl2交互作用的響應面圖；c為葡萄糖與cacl2交互作用的響應面圖；)可知，黃豆粉與葡萄糖、葡萄糖與cacl2間的交互作用及其顯著，對hsaf產量有較大影響，因此在發酵過程中需嚴格控制兩者的濃度及其比例；而黃豆粉與cacl2間的交互影響不明顯。實施例3pb試驗篩選影響hsaf搖瓶發酵的顯著性影響因子根據l.enzymogenesoh11發酵特性及本實驗室研究基礎選取6個培養因素(接種量、裝液量、初始ph、培養溫度、搖床轉速、發酵周期)作為pb試驗考察的因素，每個因素分別取高(+1)低(-1)兩個水平，以發酵液中hsaf濃度為響應值設計12組試驗，如表2所示。利用designexpert軟體對pb試驗結果進行回歸分析，獲得各發酵因素對hsaf濃度影響的顯著性順序為：發酵周期(x6)＞培養溫度(x4)＞裝液量(x2)＞初始ph(x3)＞接種量(x1)＞搖床轉速(x5)；其中發酵周期(p＝0.0034)、培養溫度(p＝0.0098)和裝液量(p＝0.0444)顯著影響hsaf的濃度(p＜0.05)，因此這3個因素作為進一步響應面優化的因素。表2hsaf發酵條件的pb試驗設計及結果實施例4bbd試驗設計hsaf搖瓶發酵條件與結果分析採用bbd試驗設計三因素三水平共17個實驗點的響應面分析試驗，具體過程同實施例2。通過designexpert8.0軟體對試驗數據進行回歸擬合併對方程做顯著性檢驗及方差分析，獲得hsaf濃度對裝液量(x2)、培養溫度(x4)和發酵周期(x6)的多元二次回歸方程為：y＝-19495.70+603.09x2+525.02x4+236.42x6-12.13x2x4+0.70x2x6-3.74x4x6-7.38x22-1.43x42-1.33x62，r2＝0.9939。且最適合的發酵條件為裝液量為22％、培養溫度為26℃、發酵周期為58h，此時模型能夠取得最大值，為436.50mg/l。為了檢驗該模型的有效性，按照上述最優發酵條件在搖瓶中進行重複實驗，同時以初始發酵條件作為對照，最終獲得hsaf實際產量為440.26mg/l，與理論預測值相接近，表明該模型十分可靠，能夠很好地預測實際發酵情況，對於今後的大規模發酵生產有一定指導意義。而且採用本發明發酵方法，hsaf產量是常規條件下(10％tsb，29.24mg/l)的15倍。實施例5優化後的生產活性抗菌物質hsaf的方法響應面法優化後產酶溶桿菌oh11生產活性抗菌物質hsaf的方法，包括以下步驟：(1)菌株活化：將菌株產酶溶桿菌oh11接入lb液體培養液中，過夜培養後劃線於lb固體平板培養基上，培養後即得活化的菌株；(2)種子液的培養：將步驟(1)活化的菌株接入到lb液體培養液中振蕩培養至od600＝1.0-2.0，即發酵所用的種子液；(3)發酵培養：將步驟(2)中培養好的種子液按照(0.8-1.2)％的體積比接種於發酵培養基中進行發酵培養，發酵培養條件為：裝液量22％，發酵溫度26℃，發酵時間58h，所述發酵培養基的配比為：黃豆粉8.00g/l，葡萄糖7.89g/l，cacl20.72g/l；(4)發酵液中hsaf提取與檢測，可以包括三個步驟：①高純度hsaf產品的製備：取1l發酵液加入濃hcl調節ph至2.5，投放166.7gcacl2並按照與發酵液等比例加入1l乙酸乙酯，按照每瓶200ml/1l分裝後於漩渦振蕩儀上1500r/min萃取2min，4℃、8000rpm離心3min，吸取上清液後利用旋轉蒸發儀50℃蒸乾得到hsaf粗品。加入100ml甲醇充分溶解後通過hplc收集22.5min特徵吸收峰，冷凍乾燥後即得hsaf純品，純度為96.5％，如圖1(b)所示。製備條件為：反相柱：intersustainswiftc185μm,250×20mm，進樣量：2ml，紫外吸收值：318nm，流動相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：15ml/min；進樣程序：0-10min，將溶液b從5％至25％；25min，增長到80％b；26min，增長到100％；30min返回到5％，溶液a和b總比例為100％。餾分收集程序：20.0min，unlock；20.6min，lock，收集水平：50000μv；②hsaf濃度與吸收峰面積間標準曲線的建立：準備稱取3.3mghsaf純品加入3.3ml甲醇溶液中，配置成1000mg/l母液，並依次稀釋750mg/l、600mg/l、500mg/l、400mg/l、250mg/l、100mg/l、50mg/l不同梯度濃度，最後通過hplc分析柱檢測，進樣量為20μl，檢測條件為，紫外吸收值：318nm，反相柱：intersustainswiftc185μm,250×4.6mm，流動相：溶液a(0.025％tfa水溶液)和溶液b(0.025％tfa乙腈溶液)，流速：1ml/min；進樣程序：0-10min，將溶液b從5％至25％；25min，增長到80％b；26min，增長到100％；30min返回到5％，溶液a和b總比例為100％。記錄峰面積，以配置溶液中hsaf的濃度為縱坐標(y)，吸收峰面積為橫坐標(x)繪製標準曲線，如圖2所示，可得hsaf濃度與峰面積間的線性方程為y＝4e-05x+12.46，r2＝0.9996；③發酵液中hsaf含量的檢測：取3ml發酵液加入濃hcl調節ph至2.5，投放0.5gcacl2並按照與發酵液等比例加入3ml乙酸乙酯，2000r/min下混合震蕩2min充分混勻發酵液與有機相，4℃、8000rpm離心3min，吸淨乙酸乙酯相，重複萃取三次後，各取1ml上清液與通風櫥中吹乾，最後加入500μl甲醇溶解後用於hplc分析。通過方法(2)中的標準曲線計算出萃取液中hsaf濃度，再換算成發酵液中hsaf的具體產量，檢測條件同方法②。本實施例中，步驟①或③中採用乙酸乙酯雖然產生了乳化層，但乙酸乙酯中hsaf濃度能到達到322.8mg/l，明顯優於同樣條件下選用醇類溶劑、乙酸丁酯或二氯甲烷作為萃取劑，如圖7和表3所示。表3有機溶劑對hsaf萃取效率的影響本實施例中步驟①或③中加入cacl2可有效破除萃取過程中產生的乳化現象，並且能夠進一步提高萃取液中hsaf的含量，以步驟③中取3ml發酵液進行萃取為例，第一次萃取液中濃度就可達到336.8mg/l，同時，以充分萃取後得到的hsaf含量為發酵液中hsaf總量(通過三次萃取至發酵液中不再產生hsaf為止，每次萃取液中hsaf含量為336.8mg/l，36.3mg/l，5.7mg/l，對應的體積分別為2.8ml，3ml，3ml。與此，計算出發酵液中hsaf總含量為356.3mg/l)，通過計算發現添加cacl2能夠使第一次萃取效率達到88.2％，比對照提高了1.83倍。而相同條件下加入商業化破乳劑(ppb)，對本研究中乳化問題效果不明顯，如圖8和表4所示。表4添加不同無機鹽對hsaf萃取效率的影響當前第1頁12當前第1頁12