可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片及檢測方法
2023-05-04 18:55:46 1
可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片及檢測方法
【專利摘要】本發明公開一種可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片及檢測方法，所述基因晶片包括晶片載體，在晶片載體上固定有用於檢測奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌的核苷酸探針，還固定有固定陽性對照、雜交陽性對照和雜交陰性對照。該基因晶片針對gyrB和fliC的不同位點設計了多條探針，有效避免了不同亞型菌種核酸序列的差異以及菌種基因組中少數鹼基突變而造成的漏檢現象，實現對奶牛乳房炎中十種主要病原菌的高通量、高特異性、高靈敏度、高效快捷的檢測，對於奶牛養殖、奶牛乳房炎中病原菌的監測和預警具有實際意義。
【專利說明】可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片及檢測 方法
[0001]
【技術領域】： 本發明屬於微生物檢測【技術領域】，具體涉及一種可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病 菌的基因晶片及檢測方法。
[0002]
【背景技術】： 基因晶片技術（Genechip)是20世紀90年代初期發展起來的一種基因分析的高新生 物技術，是將人工合成的目的基因的核苷酸片段(探針）點置於一定的載體上，然後提取待 測微生物的全基因組DNA，通過PCR擴增該目的基因片段，並在這些基因片段上標記螢光物 質後，在合適的條件下使其與晶片上的探針雜交，同源性高的片段會通過雜交互補配對，經 清洗掃描，會在相應的矩陣探針位點顯示螢光信號。基因晶片檢測的目的片段可以是PCR 產物、基因組DNA、總RNA、cDNA、質粒DNA或者寡核苷酸等（Schenaetal，2000)。目前報導的 檢測方法中以多重PCR結合基因晶片方法、通用引物結合基因晶片方法等為主。基因晶片 技術在微生物鑑定中的應用，具有特異性強、靈敏度高的特點，尤其是在應對大量、複雜的 樣品時優勢更為明顯，便捷高效、成本低廉、誤差小。其突出的特點是集成化、微型化、自動 化、高通量等，可以高通量、平行化對多種靶基因進行準確鑑定，可為現代微生物菌種識別、 毒力因子確定、耐藥性檢測等提供完善的技術平臺（Calletal，2001)。因此，很有必要在短 期內利用高新分子生物學技術建立起多種感染性致病菌的高通量、快速、準確的監測體系， 以確保在較短的時間內正確診斷諸如奶牛乳房炎等的多種致病菌感染性疾病，以提高我國 多感染性致病菌預防、診斷和控制的能力。
[0003] 奶牛乳房炎致病菌感染能力、傳播途徑廣，同時由於抗生素的大量使用和藥物殘 留的問題使人們在面對奶牛乳房炎的高發和群發時，時常束手無策，多種致病菌通過散發 性、群體性發病對奶業造成重大的損失，進而給人們的奶製品消費造成很大影響，對消費者 的正常生活質量、社會經濟持續發展等方面帶來不可估量的損失，因此，對引起奶牛乳房炎 的主要致病菌實現快速平行檢測已迫在眉睫。引起奶牛乳房炎的致病菌種類眾多，目前已 知的致病菌大約有220多種其中常見的就有20多種，而90%奶牛乳房炎致病菌主要為大腸 桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、乳房 鏈球菌、無乳鏈球菌、傷寒沙門氏菌、綠膿桿菌、志賀氏菌、蠟樣芽胞桿菌等。現有技術中有 對奶牛乳房炎主要致病菌的檢測基因晶片及檢測方法的研究，如發明專利CN101492739A 公開的一種奶牛乳房炎主要致病菌的檢測基因晶片及檢測方法，其是對6種奶牛乳房炎主 要致病菌(無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、奇異變形桿菌和金黃色葡 萄球菌）基因晶片檢測方法的研究，所述基因晶片包括固相載體和固定在固相載體上的特 異性檢測探針，特異性檢測探針包含以大腸桿菌16SrDNA保守區為基底序列設計的通用引 物序列之間的6種奶牛乳房炎主要致病菌的可變區域內設計的特異性寡核苷酸雜交探針， 並限定了PCR反應的退化溫度、優化了PCR擴增的核酸片段和基因晶片進行雜交的條件，獲 得很好的雜交效果，最終得到準確的檢測結果。該方法利用16SrDNA保守區為基底序列設 計通用引物，將其作為細菌檢測盒鑑定的靶分子，但由於16SrRNA對於親緣關係較近的細 菌解析度不夠，且不同亞型菌種核酸序列的差異以及菌種基因組中少數鹼基突變都會造成 漏檢現象。
[0004]
【發明內容】
： 本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病 菌奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、綠 膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌的基因晶片及檢測方法，實現對複雜樣 本的並行快捷、高通量、高特異性、高靈敏度的檢測。
[0005] 已有的奶牛乳房炎主要致病菌的基因晶片是利用16SrRNA保守區作為基底序列 設計通用引物，將其作為細菌檢測盒鑑定的靶分子，然而16SrRNA對於親緣關係較近的 細菌解析度不夠， 申請人:經過長期的研究發現，採用gyrB作為細菌鑑定和分類的靶基因， gyrB基因是編碼DNA解旋酶B亞基的基因，該基因進化速率較快，鹼基替換頻率較高，能比 16srRNA基因更好地區分相似種，能夠滿足奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡 萄球菌、乳房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌九種細菌的鑑 定需求。另外，由於當前沙門氏菌的命名比較混亂，通過對16srRNA和gyrB序列的保守性 分析，根據兩種基因序列設計探針，可能只能鑑定到沙門氏菌屬，而無法保證設計的探針特 異性只針對鼠傷寒沙門氏菌。經過大量的文獻調研， 申請人:採用fliC作為鑑定傷寒沙門氏 菌的靶基因。因此，本發明針對上述十種常見奶牛乳房炎致病菌，根據gyrB和fliC兩種基 因分別選取特異性探針，以保證各個菌種探針之和對應的菌種產生特異性信號，同時針對 所述的十種細菌的gyrB和fliC兩種基因，分別設計了多條探針，有效避免了由於不同亞型 菌種核酸序列的差異以及菌種基因組中少數鹼基突變而造成的漏檢現象。
[0006] 本發明是採取以下技術方案予以實現： 一種可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片，包括有晶片載體，在晶片載 體上固定有用於檢測奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌、 肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌的核苷酸探針。
[0007] 所述的用於檢測奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈 球菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的探針是從gyrB基因中設計 的。
[0008] 所述的用於檢測傷寒沙門氏菌探針是從gyrB和fliC基因中設計的。
[0009] 所述的用於檢測奇異變形桿菌（pro)的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:1。
[0010] 所述的用於檢測停乳鏈球菌（sdy)的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:2。
[0011] 所述的用於檢測無乳鏈球菌（sag)的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:3。
[0012] 所述的用於檢測表皮葡萄球菌（s印）的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:4。
[0013] 所述的用於檢測乳房鏈球菌（supi)的核苷酸探針，其序列為SEQIDNO:5。
[0014] 所述的用於檢測肺炎克雷伯菌（kpn)的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:6。
[0015] 所述的用於檢測綠膿桿菌（pae)的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:7。
[0016] 所述的用於檢測金黃色葡萄球菌（sau)的核苷酸探針，其序列為SEQIDNO:8。
[0017] 所述的用於檢測大腸桿菌（eco)的核苷酸探針，其序列為SEQIDN0:9。
[0018] 所述的用於檢測傷寒沙門氏菌（sen)的核苷酸探針，其序列為SEQIDNO: 10。
[0019] 表1:本發明所用到的探針序列信息表
【權利要求】
1. 可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片，包括晶片載體，其特徵在於： 在晶片載體上固定有用於檢測奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳 房鏈球菌、肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和傷寒沙門氏菌的核苷酸 探針； 所述的用於檢測奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌、 肺炎克雷伯菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的探針是從gyrB基因中設計的； 所述的用於檢測傷寒沙門氏菌探針是從gyrB和fliC基因中設計的。
2. 根據權利要求1所述的可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片,其特徵 在於： 所述的用於檢測奇異變形桿菌（pro)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID NO: 1 ; 所述的用於檢測停乳鏈球菌（sdy)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:2 ; 所述的用於檢測無乳鏈球菌（sag)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:3 ; 所述的用於檢測表皮葡萄球菌（sep)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:4; 所述的用於檢測乳房鏈球菌（supi)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:5; 所述的用於檢測肺炎克雷伯菌（kpn)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:6; 所述的用於檢測綠膿桿菌（pae)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:7; 所述的用於檢測金黃色葡萄球菌（sau)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:8; 所述的用於檢測大腸桿菌（eco)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:9; 所述的用於檢測傷寒沙門氏菌（sen)的核苷酸探針，其序列為SEQ ID N0:10。
3. 根據權利要求1所述的可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片,其特徵 在於：還固定有固定陽性對照（HEX)、雜交陽性對照（PC)和雜交陰性對照（NC)，其核苷酸序 列依次為SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13;所述與陽性質控探針雜交的陽性 質控片段為雜交PC-TAMRA，其核苷酸序列為SEQ ID N0:14。
4. 權利要求1所述可並行檢測奶牛乳房炎十種主要致病菌的基因晶片的製備方法，其 特徵在於，包括如下步驟：將核苷酸探針稀釋至適當濃度後，在晶芯PersonalArrayer 16 個人點樣儀（CapitalBio)上，根據實際情況分別對384孔點樣板、玻片、針架、點陣、樣品和 清洗參數進行設置，通過運行晶芯PersonalArrayer 16個人點樣儀將探針點制於固相氨 基晶片上；然後用博奧晶芯LuxScanlOK掃描儀，檢測晶片點制情況； 所述步驟核苷酸探針稀釋至適當濃度，是使用無菌水溶解各探針至40剛，與晶芯@基 因晶片點樣液1:1的比例進行混合，使各探針終濃度為20剛；然後將探針按照設計好的探 針排布表，依次添加到384孔點樣板中。
【文檔編號】C12R1/19GK104328167SQ201410473932
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】王玉炯, 楊銀學, 鄧光存, 馬臣傑 申請人:寧夏大學