紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表達載體及其應用的製作方法

2023-05-05 04:29:51 1

專利名稱：紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表達載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物基因工程領域，具體涉及ー種提高植物抗鋁毒脅迫能力的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體pK2-35S-#dZ#77及其在製備降低鋁吸收和抗鋁毒能力增強的轉基因植株中的應用。
背景技術：
鋁毒是酸性土壌中植物生長和作物產量的主要限制因素。酸性土壌佔世界可耕種土壌的30%，主要分布在南非、中亞和東南亞等對糧食需求量最大的發展中國家。我國的酸 性土壌主要分布在長江以南的熱帶、亞熱帶及雲貴川等地區，面積達204萬公頃，大部分土壤的PH值小於5. 5，其中很大一部分小於5. O。農業上通常靠施加生石灰以緩解酸性土壌中的鋁毒問題，然而這種方法只能改良表層土壌，並不能改變深層土壤的pH值，且耗費大量的經濟和人力。因此，在降低土壌酸度的同時，挖掘植物自身的抗鋁潛力，利用基因工程手段在植物中過量表達抗鋁基因，是解決酸性土壌中鋁毒害和農業生產可持續發展的有效策略。鋁誘導的植物根尖蘋果酸的分泌是植物抗鋁的主要機制，蘋果酸的分泌由蘋果酸通道蛋白基因(ALMT1)所控制。ALMTl是ー類含有UPR)005結構域且具有5_7個跨膜結構域的跨膜蛋白。TaALMTl是從耐招小麥(Triticum aestivum)ET8中克隆得到的第一個植物耐鋁基因，生理及電生理實驗發現，鋁耐受性小麥品種在鋁脅迫下有機酸的分泌是通過開啟有機酸陰離子通道來實現。如抗鋁小麥ET8主要的抗鋁基因TaALMTl在水稻和菸草細胞中異源表達後引起鋁誘導的蘋果酸外流，因而提高菸草細胞的耐鋁能力。將TaALMTl基因轉入大麥中過量表達，轉基因大麥具有與ET8相似的蘋果酸分泌和抗鋁毒能力。如Delhaize等發現表達TaALMTl的轉基因大麥具有ー個鋁激活的蘋果酸流，當轉基因大麥收到鋁脅迫時可以増加蘋果酸分泌和對鋁毒的抗性。進ー步的研究發現轉基因大麥在酸性土壌上可以更有效的吸收磷元素，產量也比非轉基因株系高。Pereira等在小麥種過量表達TaALMTl基因，結果9個T2代轉基因株系的TaALMTl表達增強，蘋果酸的分泌量和鋁耐受性顯著提高。ー些T2代轉基因株系在含有鋁溶液和土壌中培養時鋁耐受性都高於抗鋁小麥品種ET8，。抗鋁油菜品種中鋁誘導根的蘋果酸分泌與也#/7取BnALMT2的高表達有夫。過量表達BnALMTl取BnALMT2的轉基因菸草細胞在鋁脅迫下蘋果酸分泌比野生型細胞高8_11倍，鮮重増加3-4倍。AtALMTl是擬南芥的重要抗鋁基因之一，該基因的突變使其對鋁敏感性增カロ。Ryan等的研究證實過表達的轉基因擬南芥RRG比野生型高大約3倍。然而，值得我們關注的是，目前用於轉基因的メ1#77基因的植物來源還很不廣泛，基因均來源於単一的抗鋁或模式植物。紫花苜蓿由於產草量高、莖葉富含蛋白質和適ロ性好等特點而被稱為「牧草之王」，在我國廣泛種植。渝苜一號為西南大學玉永雄教授培育的具有耐溼、耐貧瘠且在西南地區廣泛種植的苜蓿新品種。我們的前期研究結果發現，在紫花苜蓿渝苜一號根中，鋁誘導了#基因的上調表達和蘋果酸的分泌。為了進一歩開發該基因在植物抗鋁中的應用，本發明使用紫花苜蓿渝苜一號的根為材料，克隆獲得了鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因(MsALMTO0本發明通過Gateway技術構建了植物表達載體pK2-35S-#dZ#77，通過葉盤轉化法成功將MsALMTI基因轉入菸草中實現了過表達。

發明內容
本發明的目的在於提供一種提聞植物抗招韋能力基因的植物表達載體，該載體是含有來自於紫花苜蓿根中的鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因(即基因)的植物表達載體；同時提供該載體的構建方法，以及該載體在製備降低鋁吸收和提高抗鋁能力的轉基因植物中的應用。本發明所提供的用於提高植物抗鋁能力的載體，是具有組成型啟動子和蘋果酸通道蛋白基因cDNA的植物表達載體。上述載體中，所述的蘋果酸通道蛋白基因的cDNA來源 於紫花苜蓿鋁敏感性栽培種渝苜一號(Uicago sativa L. cv. YMl),所述的來源於紫花苜猜的蘋果酸通道基WsALMTI 的 GenBank 登錄號為⑶550122。上述蘋果酸通道蛋白基因cDNA的上遊為CaMV 35S的組成型啟動子。本發明中用於構建所屬植物表達載體的起始載體為pK2GW7 (購自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology, VIB)。本發明的上述植物表達載體mHMsALMTl由下述方法構建而成
(I)根據MtALMTl的ORF設計的引物為
上遊引物5' - GGATCCATGGTGTCTGAACCAAATTCAAG-3 』 (.BamHl)
下遊引物5』 - AAGCTTTAGTTAATTATAATAACATGTTG -3』 (.HincIlll)
上遊引物5 』端加GGATCC特徵序列，並由此形成及 /TI酶切位點；下遊引物3 』加AAGCTT特徵序列，形成ガifldll酶切位點，以紫花苜蓿第一鏈cDNA為模板擴增，得到#基因的全長cDNA ；
2)回收並純化#全長基因cDNA片段，並將其連接到pMD_18T載體上，採用鹼裂解法提取質粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質粒pMD18-#dZ#77。對該質粒進行測序，結果發現與#^#77具有95%的相似性，NCBI的登錄號為⑶550122 ；
(3)構建中間載體pENTRTM2B- MsALMTI，覓 BamHl 和沿/ t/III 酶切 pMD18_i&也#77 和pENTR^-PrbcS-^T-67^ (Invitrogen)得到目的基因片段和載體片段pENTRTM_2B，回收後進行連接、轉化感受態細胞，得到重組載體PENTRTM2B- MsALMTI ；
(4)構建植物表達載體pK2-35S-#dZ#77，通過Gateway技術的LR反應把#亞克隆到植物表達載體PK2GW7中，獲得MsMMn基因的植物表達載體pK2-35S-#dZ#77。本發明另一目的是將重組載體pK2-35S-#dZ#77在製備吸收和抗鋁毒能力增強的轉基因植株中的應用。本發明利用組成型CaMV 35S啟動子構建#基因的植物表達載體，以便在轉基因植物中過量表達蘋果酸通道蛋白基因，由於該基因編碼了鋁誘導的蘋果酸通道蛋白，因此增強了植物蘋果酸分泌的同時，也提高了轉基因植物的抗鋁能力和降低了植物根尖對鋁的吸附。


圖I是本發明中間載體pMD18-#dZ#77的構建策略示意 圖2是本發明中中間載體pENTRTM2B-#dZ#77的構建策略示意 圖3是本發明中間載體pMD18-#^Z#77的構建和檢測；其中A是MsALMTI的PCR擴增產物，圖中1為使用鋁處理的植物根提取的RNA反轉錄合成cDNA第一鏈為模板的擴增產物；2為以水為負對照；M為Maker III ；B是重組質粒_18-MsALMn的酶切檢測，圖中1為 BatnHI 和 HindIII 酶切 pMD18_i&也#77 產物；M 為 Maker III。圖4是本發明中間載體pENTRTM2B-#dZ#77的檢測電泳示意圖；其中A是pENTRTM2B-#^Z#ri的質粒提取電泳檢測圖，圖中1_3為pENTRTM2B-ifejZ#77的質粒，M為Maker III ;B是pENTRTM2B-#dZ#77的質粒酶切檢測示意圖，圖中I為SalI和油a/的雙 酶切檢測，2為BamHI和HindIII的雙酶切檢測，3為pENTRTM2B-#dZ#77的質粒對照，M為Maker III。圖5是本發明中用Gateway的LR反應構建#基因的植物表達載體的策略示意圖。圖6是本發明中MsALMTI植物表達載體pK2-35S_i&也#77的檢測電泳示意圖；其中A是重組質粒pENTRTM2B-#d Z#77和pK2GW7質粒電泳圖，圖中I為中間克隆載體pENTRTM2B-i&也#77，2和3為植物表達載體pK2GW7，M為Maker III ;B是植物表達載體pK2-35S-#^Z#ri的質粒提取電泳示意圖，圖中1_4為pK2-35S-ifejZ#77質粒，5為pK2GW7質粒，M 為 Maker III。圖7是本發明中MsALMTI植物表達載體pK2-35S-#dZ#77的農桿菌轉化子菌落的檢測電泳示意圖；其中A是pK2-35S-#dZ#77質粒雙酶切檢測電泳示意圖，圖中I為BamHl和沿/ t/III雙酶切，M為Maker III ；B是農桿菌菌落PCR檢測pK2-35S-ife^Z#77的轉化農桿菌的效果示意圖，圖中1-5為轉化子，6為vmMsALMTl質粒正對照，7為pK2GW7負對照，M 為 Maker III。圖8是本發明中#轉基因菸草的中基因組水平和轉錄水平的檢測示意圖；其中A是轉基因植物的基因組水平的檢測電泳圖，圖中M為Maker III，I為以m-^-MsALMTl為模板進行PCR的正對照，2為WT植物，3為轉基因株系A4，4為轉基因株系A5，5為轉基因株系A6，6為轉基因株系A9 ；B是RT-PCR分析轉基因植物#的表達水平電泳圖，圖中A5-A9為轉基因株系，WT為野生型菸草。圖9是本發明中轉基因和野生型植物根尖蘋果酸分泌量結果比較示意圖，圖中+Al為0. 5 mM CaCl2 (pH4. 2)的處理液中添加30 u M AlCl3處理24 h，_Al為不添加AlCl3的CaCl2溶液(pH4. 2)處理24 h，WT為野生型菸草，A5-A9為轉基因株系。圖10是本發明中轉基因和野生型菸草的抗鋁能力一鋁脅迫下根的相對生長率分析比較示意圖；圖中WT為野生型菸草，A5-A9為轉基因株系。圖11是本發明中轉基因和野生型菸草的抗鋁能力一鋁脅迫後根尖鋁含量分析比較示意 WT為野生型菸草，A5-A9為轉基因株系。
具體實施方式
本實施例中採用的試劑主要分為分子生物學實驗試劑、植物遺傳轉化所需的培養基以及轉基因植物鑑定和檢測所需的各種試劑。各種限制性內切酶、Taq DNA聚合酶、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連)產品，質粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑盒、Gateway LR clonase EnzymeMix kit購自invitrogen公司。其餘試劑均為國產分析純。所用儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發明實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I -MsALMTI基因cDNA擴增、TA克隆和序列分析 由於模式植物截形苜蓿和紫花苜蓿具有很高的相似性，因此根據NCBI上公布的截形苜蓿的鋁誘導的蘋果酸通道蛋白的基因序列(#MZ#77，ABD32183)，設計引物如下
上遊引物5' - GGATCCATGGTGTCTGAACCAAATTCAAG-3 』 (.BamHl)
下遊引物5』 - AAGCTTTAGTTAATTATAATAACATGTTG -3』 (.HincIlll)
上遊引物5 』端加GGATCC特徵序列，並由此形成及 /TI酶切位點；下遊引物3 』加AAGCTT特徵序列，形成Hindi 11酶切位點。鋁敏感性紫花苜蓿YMl經鋁處理24 h後，剪取0. Ig根，使用液氮研磨後加入Iml的TRIzoL提取液，室溫靜置5min後移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉移上清液至新管,加入0. 5ml異丙醇,混勻室溫放置IOmin, 4°C離心IOmin (12000rpm),棄上清，沉澱用75%こ醇Iml清洗,4°C離心5min (7500rpm),棄こ酉享真空乾燥沉澱或自然晾乾，用20 焦碳酸ニこ酯(DEPC)處理水溶解RNA，取I 電泳檢測。使用 M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)進行 cDNA 的合成，取植物總RNA 約 0. Iii g-5ii g，oligo(dT) 50ng, IOmM dNTP mix I ii 1，用 DEPC 處理水補足至 10 y 1，混勻後，短暫離心將之收集於管底，置於72°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應混合物9 yl(5 Xreaction buffer 4 u l,25mM MgCl2 4u 1,0. IM DTT 2 y 1，RNA 酶抑制劑 I y 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集於管底，25°C保溫2min，加入Iiil M-MuLV ReverseTranscriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集於管底,25°C保溫20min,然後42°C保溫70min,合成cDNA。以cDNA為模板，用MsALMTI基因上下遊特異性引物進行PCR，擴增得到全長MsALMTI的序列(圖3A)。切膠回收並純化#全長基因片段，並將其連接到pMD_18T(大連寶生物公司)載體上(圖1)，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞(天根生化科技)，採用鹼裂解法提取質粒DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質粒做進ー步的雙酶切並測序和測序。根據陽性重組質粒pMD18-#^Z#77載體兩端的多克隆位點，用BamHl和#iflJIII雙酶切重組質粒，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物，連接成功的重組質粒pMD18-#dZ#77單酶切產物理論上為I. 4kb左右的條帶(圖3B)。測序結果表明，#
的全長序列為1347 bp，且編碼了一個編碼由448個胺基酸組成的跨膜蛋白(上傳至NCBI的登錄號為⑶550122)。使用 CLUSTAL (http://clustalw. genome, jp)對 MsALMTl 預測的蛋白與其他已知的抗鋁基因編碼的蛋白如BnALMTl，BnALMT2, AtALMl和TaALMTl序列比對發現，它們均具有ー個ALMTl結構域，且具有極高的相似性。實施例2 :構建中間載體pENTRTM2B_JfcZメ#77用 Hindlll 和 BamHl 雙酶切 pMD18_i&也#77 和 pENTt^-PrbcSiT-ffP 載體(圖 2)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，分別回收pMD18-#dZ#77被切割後產生的#基因片段(約I. 4kb)和pENTR*-PrbcS-*T-ffP被切割後產生的載體片段PENTRTM2B，然後用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTRTM2B和Jfe也#77基因的DNA片斷產生中間載體pENTRTM2B-#dZ#77 (圖2)。用連接反應混合物轉化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態細胞(DH5 a，購自天根生化科技公司)，把轉化好的大腸桿菌塗於加有卡那黴素(Km，50 ii g/ml)的平板上，於37°C過夜培養，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質粒，選出連接成功的質粒載體pENTRTM2B-#dZ#77 (圖4A )。用Hindi 11和BamHl以及SalI和XbaI雙酶切檢測，連接成功的質粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產生兩條帶，均分別為約2. 7kb和1.4kb (圖4B)。確認是連接成功的質粒後，重新轉化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒pENTRTM2B-#dZ#77。實施例3 :植物表達載體pK2-35S-#dZ#77的構建
通過Gateway技術的LR反敦把MsALMTI亞克隆到植物表達載體pK2GW7 (Gateway的目的載體，比利時VIB/Gent公司)中。具體的做法是用質粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pK2GW7(圖6A)，在Gateway的LR反應體系中加pENTRTM2B_i&也#77和pK2GW7各150ng, Iul LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen),混均於 25°C反應過夜，通過整合酶的作用把整合到pK2GW7中獲 得#的植物表達載體pK2-35S-#dZ#77(圖5)。用反應混合物轉化高效率(108)的大腸桿菌感受態細胞(DH5 a，購自天根生化科技公司)，把轉化好的大腸桿菌塗於加有壯觀黴素(Spe，50iig/ml)的平板上，於37°C過夜培養，篩選Spe抗性重組子菌落。從Spe抗性重組子菌落中提取質粒，選出大小和對照質粒pK2GW7相似的整合成功的質粒pK2-35S-i&也#77進行酶切檢測(圖6B)。用Hindlll取BamHl酶切檢測pK2-35S-#WZ#77，酶切結果得到11. Ikb和I. 4 kb左右的兩條帶(圖7A)。確認是整合成功的質粒後，重新轉化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培養，用試劑盒純化質粒。PK2GW7攜帯的篩選標記基因為卡那黴素抗性基因(Knf)，這樣可用加有卡那黴素的平板篩選轉基因植物。實施例4 用MsALMTI基因的植物表達載體轉化農桿菌
製備農桿菌的感受態細胞，用電脈衝法將上述構建好的植物表達載體pK2-35S-MsALMH轉入農桿菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壯觀黴素的平板上篩選轉化子。取少量質粒加入農桿菌感受態細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預冷的電轉化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉化杯置於電轉化儀(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數進行電擊，電擊後立即取出電轉化杯，迅速加入0. 5ml SOC培養基，混勻，轉移到I. 5ml的離心管中；28°C，200rpm搖床培養3_5h ;室溫下，7500rpm離心Imin,棄大部分上清,保留IOOii I將細胞懸浮；把農桿菌塗布於有壯觀黴素(Spe, 50 u g/ml)的LB固體培養基上，28°C培養2天獲得單菌落；首先用滅菌牙籤挑取農桿菌菌落於20 u I ddH20中，98°C處理5分鐘後取出10 u I農桿菌裂解液作為PCR反應的模板。PCR檢測pK2-35S-#dZ#77轉化結果，正對照擴增體系模板使用pK2-35S-#dZ#77質粒，負對照使用PK2GW7質粒，擴增片斷理論長度約為I. 4 kb，PCR產物經電泳分析顯示其片段大小與理論預測值相符，表明質粒已轉入農桿菌(圖7B)。實施例5 :用含有#基因植物表達載體的農桿菌轉化菸草挑取攜帯有質粒mHMsALMTl的農桿菌單菌落接種於50ml的LB培養基中(含Spe, 100 u g/ml), 180rpm, 28°C培養 24h,待菌液 OD600 至 I. 0 左右，離心 IOmin (3000rpm),沉澱菌體。再用IOml左右的MS液體培養基懸浮，離心IOmin (3000rpm)，沉澱菌體。重複以上操作2 3次。最後加入一定體積的MS液體培養基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。製備菸草tabacum cv. Xanth)的無菌苗,通過農桿菌介導,用葉盤法轉化菸草，然後通過組織培養獲得小苗，進ー步篩選獲得所需的轉基因植物。把無菌菸草的葉片切成小片葉盤，在製備好的農桿菌菌液中浸染15-20min，用無菌吸水紙吸乾後，平鋪於愈傷組織誘導培養基MSI (MS+NAA02. I u g/ml+BAP 0. 02 u g/ml)上黑暗共培養2天，將外植體轉移至含卡那黴素(50 u g/ml)的芽誘導培養基MS4 (MS+NAA0. 53 u g/ml+BAPO. 5 u g/ml)上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成後，轉入含卡那黴素(50 y g/ml)的MS培養基上進行根的誘導。 實施例6 -MsALMTI基因在轉基因菸草中的插入情況及轉錄水平檢測
為了確認通過卡那黴素篩選的轉基因菸草株系確實含有導入的目的基 因的DNA片段，用PCR方法對篩選到的轉基因菸草作進ー步的鑑定。首先採用CTAB法提取植物基因組稱取植物葉片IOOmg左右置於I. 5ml離心管中，加液氮用特製研棒研磨至粉末狀；加入900111預熱到65で的2\0^8緩衝液(!^8-11(1 pH 7. 5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl I. 4M, CTAB 2%)，65°C度水浴加熱20分鐘後取出冷卻；加入500 氯仿-異戊醇混合液(24
I)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm)後轉移上清至I. 5ml EP管；再次加入500 U I氯仿ー異戊醇混合液(24 1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm);取出上清置於新的EP管中，加入1/10體積3M pH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻後4°C離心20min (12000rpm);棄上清，用75%こ醇清洗兩次後，乾燥，用含RNase的TE緩衝液溶解並降解RNA，獲得的基因組DNA樣品。■ MsALMTI菸草抗性苗基因組作為模板，用MsALMTl基因上下遊引物進行PCR擴增檢測#是否插入菸草基因組。擴增產物大小約為I. 4 kb左右，和預期推測一致，說明目的基因均已插入這些轉基因株系的基因組，野生型菸草基因組PCR產物未出現目標條帶(圖8A)。為了進一步檢測目的基因在轉基因菸草株系中的轉錄情況，從轉基因植物中抽取總RNA，反轉錄成cDNA後用於RT-PCR分析，檢測MsALMTl基因在轉基因植物中的轉錄水平。採用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA,取植物根約 0. Ig,加入 Iml 的 TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min後移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉移上清液至新管,加入0. 5ml異丙醇,混勻室溫放置IOmin, 4°C離心IOmin (12000rpm),棄上清,沉澱用75%こ醇Iml清洗,4°C離心5min (7500rpm),棄こ醇真空乾燥沉澱或自然晾乾，用20 u I焦碳酸ニこ酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測質量和濃度。使用Reverse Transcriptase進行cDNA的合成,取植物總 RNA 約 0. I ii g-5 u g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix I ii 1，用 DEPC 處理水補足至 10U 1，混勻後，短暫離心將之收集於管底，置於65°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應混合物9u 1(5 X reaction buffer 4u l,25mM MgCl2 4u 1,0. IM DTT 2u I，RNA 酶抑制劑 I y 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集於管底，25°C保溫2min,加入Iul M-MuLV ReverseTranscriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集於管底,25°C保溫20min,然後42 °C保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用MsALMTl基因的上下遊引物進行RT-PCR分析，考察轉基因菸草中是否有目的基因的轉錄物。結果證明轉基因菸草植株均有目的基因的轉錄物，而野生型的菸草則沒有(圖SB)。實施例7 :轉基因菸草根系蘋果酸的分泌量測定
選取在MS培養基上生長兩周、大小一致的菸草幼苗,於1/2 MS液體培養基上生長I周后，分別置於15 mL含30iiM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2 (0.5 mM/L，pH4. 2)溶液中，置於25°C恆定光照(100 u mol/mVs1)下處理24 h後，收集處理液用於蘋果酸分泌量的測定。將得到的菸草根尖分泌物，使用真空乾燥儀真空乾燥後，溶於I mL蒸餾水中。將0.35 mL樣品與0. 45 mL緩衝液Tris-HCl (0. I mol/L，pH 9. 0)以及30 y L氧化型輔酶I (NAD)溶液(30 g/L)混合,讀取波長為340 nm處的OD值(Al)。接著加入2 y L蘋果酸脫氫酶懸浮液(16.5 U/iiL)於上述反應溶液中並混合均勻。15 min後，讀取340 nm處的OD值A2。根據樣品和蘋果酸標準溶液吸光度的增加值(A2-A1)計算樣品中蘋果酸的含量。結果表明，在沒有鋁的情況下，轉基因株系A5，A6和A9根系分泌的蘋果酸分別為野生型的2. 92,4. 19和4. 09倍。在鋁處理下，野生型和轉基因菸草根尖蘋果酸的分泌均有所増加，轉基因株系A5、A6和A9分泌的蘋果酸分別是WT根系的2. 88、3. 56和3. 88倍(圖9)。可見，在菸草中過表達基因可以有效的増加鋁脅迫下菸草根系蘋果酸的分泌。實施例8 :鋁脅迫下轉基因和野生型菸草的抗鋁能力和根尖鋁含量
選取在MS培養基上生長兩周、大小一致的菸草幼苗,於1/2 MS液體培養基上生長I周后，分別置於15 mL含30 uM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2(0. 5 mM/L，pH4. 2)溶液中，使用直尺測定根的長度；隨後置於25°C恆定光照(100 u mol/mVs1)下處理24 h後，使用直尺測定根的長度。每個株系測定9個根尖的長度，相對根伸長率為鋁溶液處理植株的根伸長量/無鋁溶液處理植株的根伸長量。鋁處理結束後，取根尖稱鮮重後在65°C烘箱烘至衡重，用灰化爐550°C灰化10 h左右，使用Iml濃硝酸溶解過夜，定容至50 ml，使用原子吸收分光光度法測定鋁的含量。結果表明，鋁處理使野生型菸草的根明顯受到了抑制，其根的RRG僅為未經鋁處理的0. 48。而轉基因株系A5、A6和A9的RRG與野生型相比分別提高了 I. 58、I. 80和I. 59倍(圖10)。對於根尖鋁含量測定結果表明，30 ii M處理24 h後，轉基因株系A5、A6和A9根尖的鋁含量僅為野生型根尖鋁含量的60%、48%和50%(圖11)。可見，是紫花苜蓿中編碼蘋果酸通道蛋白的ー個重要抗鋁基因，在菸草中過表達可以有效的提高轉基因菸草對鋁的抗性。
權利要求
1.紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體，其特徵在幹含鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因MsALMTI。
2.如權利要求I所述的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體，其特徵在於-MsALMTI基因cDNA的上遊連接有CaMV 35S組成型啟動子。
3.如權利要求I所述的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體，其特徵在於MsALMTI基因的cDNA來源於紫花苜蓿渝苜一號，GenBank登錄號為⑶550122。
4.權利要求I所述的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體在製備降低鋁吸收和抗鋁毒能力增強的轉基因植株中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種紫花苜蓿鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因的植物表達載體pK2-35S-MsALMT1，其為含有花椰菜花葉病毒的組成型啟動子(35S)和紫花苜蓿鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表達載體。從紫花苜蓿中擴增出MsALMT1基因，用組成型啟動子控制它在菸草中過量表達，提高菸草抗鋁毒的能力。實驗表明轉MsALMT1基因菸草在含有30μM的AlCl3溶液中脅迫生長24h後，轉基因菸草的根尖分泌的蘋果酸和抗鋁能力均顯著性高於野生型對照植物，而根尖鋁含量顯著性低於野生型植物。
文檔編號C12N15/82GK102952821SQ20121043799
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者陳麗梅, 陳奇, 武孔煥, 李昆志, 玉永雄 申請人:昆明理工大學