作為疫苗的hmgb2基因失活的減毒瘧原蟲的製作方法

2023-05-05 04:05:56

作為疫苗的hmgb2基因失活的減毒瘧原蟲的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於通過使用經由滅活hmgb2基因的功能而遺傳減毒的瘧原蟲寄生蟲免疫宿主以對抗瘧疾的新的組合物和方法。
【專利說明】作為疫苗的HMGB2基因失活的減毒瘧原蟲
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥領域，尤其是防治瘧疾。
【背景技術】
[0002]瘧疾是由瘧原蟲(Plasmodium)屬的真核單細胞寄生蟲引起的傳染病。這類寄生蟲病出現在世界各地，並在發展中國家中導致嚴重的經濟和健康問題。惡性瘧原蟲(P.falciparum)是感染人類的5類瘧原蟲中危害最大的種類。據世界衛生組織(法文縮寫為0MS)，惡性瘧原蟲導致25000至50000萬例急性疾病並且每年導致約100萬例死亡(尤其是小於5歲的兒童和孕婦)。腦型瘧疾是瘧疾的一種嚴重神經性併發症，這類疾病致死病例中的絕大多數都歸咎於此。即使個體存活了，腦型瘧疾可導致嚴重的神經性副作用，特別是對於幼兒，其免疫系統尚在形成過程之中。腦型瘧疾的發病機制複雜且仍然尚未完全闡明。目前認為，腦型病理可能是在主要器官(脾臟、肺、心臟、腸、腎、肝和腦)的微血管中被寄生的紅細胞的隔離(Mquestration)以及同樣在這些器官中促炎細胞因子產生的結果，造成了可導致個體死亡的全身性症候群和狀態。
[0003]防治瘧疾是OMS的主要挑戰之一，但迄今為止，旨在控制這種疾病的所有努力都失敗了。在過去三十年中，儘管OMS的數據似乎是令人鼓舞的，但情況已然惡化，這是因為瘧蚊(anophSles)對殺蟲劑產生抗性並且惡性瘧原蟲對於抗瘧疾藥物(即使是組合使用)產生持續增加的化學抗性。
[0004]防治瘧疾由於缺乏行之有效的抗這種疾病的疫苗而遇到困難。開發疫苗的第一次嘗試可追溯到20世紀70年代。自那時以來，出現了越來越多的疫苗試驗，而後者面臨著寄生蟲在其2個連續宿主(人和蚊子)中發育的複雜性，並且還面臨著寄生蟲逃避免疫系統的異常複雜的機制，其涉及相當高的抗原變異。
[0005]這種在寄生蟲紅細胞內期的變異使得傳統的利用瘧原蟲蛋白質-肽複合物的預防性免疫變得極其困難。由寄生蟲的蛋白質生產的瘧疾疫苗目前處於臨床試驗的III期(RTS, S de GlaxoSmithKline Biologicals)。然而,來自II期的結果表明，該疫苗僅可減少35%的臨床瘧疾發生，且僅可減少49%的嚴重瘧疾的發生。
[0006]獲得有效對抗寄生蟲的紅細胞形式的疫苗無論如何仍然是根除疾病中的主要挑戰，因為這樣的疫苗將既可以減輕症狀，又可以減少寄生蟲載量和血液中配子體的量，從而減少寄生蟲的傳播。
[0007]最近的研究表明，極低劑量的由惡性瘧原蟲3D7寄生的紅細胞與抗瘧疾藥物同時給藥聯合的重複給藥誘導了能夠保護患者以抵抗同源種屬的紅細胞內期的免疫(Pombo等人，2002)。
[0008]因此，設想利用遺傳減毒的活寄生蟲(或GAP，「遺傳減毒寄生蟲」)來誘導長期不育的保護。因此，幾種GAP已被公開。然而，大多數的這類GAP經由減毒寄生蟲的子孢子而靶向於肝細胞階段。也已經公開了 2個靶向紅細胞內期的GAP:其中嘌呤核苷磷酸化酶(PNP) (Ting等人，2008)或核苷轉運蛋白I (NTl) (Aly等人，2010)已被失活的齧齒目動物寄生蟲約氏瘧原蟲(P.yoelii)。已表明，這些GAP所提供的免疫是針對於同源種屬的，但也在較小程度上針對於異源種屬。然而，使用這些遺傳減毒的活寄生蟲的疫苗的療效和無害性仍尚待確認。
[0009]因此，現在仍然有必要開發新的策略，以特定地抑制嚴重攻擊的發生，如腦型瘧疾的發生，同時也減少寄生蟲載量和外周血中配子體的量,從而減少該疾病傳播的風險。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供新的用於預防瘧疾的疫苗組合物，尤其是預防瘧疾如腦型瘧疾的嚴重攻擊的發生。
[0011]發明人已經證實，屬於瘧原蟲屬的且其hmgb2基因功能已被失活的活寄生蟲可以用作瘧疾疫苗中的免疫原。實際上，已觀察到，施用這種寄生蟲在宿主中誘導了免疫反應，其可以清除寄生蟲(寄生蟲載量低於用顯微鏡在外周血中檢測的閾值)，並有效地和長期地抵禦瘧原蟲的感染，尤其是高致病種屬，且尤其是抵禦導致疾病症狀和傳播的寄生蟲的紅細胞內期。
[0012]因此，本發明首先涉及屬於瘧原蟲屬且其hmgb2基因功能已被失活的活寄生蟲，其用於預防瘧疾，尤其是預防具有嚴重神經性併發症的腦型瘧疾。
[0013]優選地，本發明的寄生蟲用於預防哺乳動物的瘧疾或腦型瘧疾，尤其是人類。
[0014]寄生蟲的種 屬可以選自伯氏痕原蟲(Plasmodium berghei)、惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)、間日痕原蟲(Plasmodium vivax)、卵形痕原蟲(Plasmodiumovale)、三日痕原蟲(Plasmodium malariae)和諾氏痕原蟲(Plasmodium knowlesi)。優選地，寄生蟲的種屬選自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和諾氏瘧原蟲，更優選地,選自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。
[0015]根據一個【具體實施方式】，寄生蟲的種屬是惡性瘧原蟲。
[0016]根據另一個【具體實施方式】，寄生蟲的種屬是伯氏瘧原蟲，尤其是伯氏瘧原蟲NK65。
[0017]優選地，野生型形式的寄生蟲不引起腦型瘧疾。
[0018]根據一個【具體實施方式】，寄生蟲的種屬是非細胞粘附的或具有降低的細胞粘附能力的惡性瘧原蟲種屬，優選具有降低的細胞粘附能力的。
[0019]本發明的寄生蟲可以是紅細胞內的形式，特別是紅細胞內滋養體、裂殖子或裂殖體的形式，優選是紅細胞內裂殖子或裂殖體的形式。
[0020]本發明的寄生蟲可以是非紅細胞內裂殖子的形式，即通過完全或部分純化而從被寄生的紅細胞中獲得的裂殖子的形式。
[0021]本發明的寄生蟲也可以是子孢子的形式。
[0022]hmgb2基因的功能可以通過完全或部分缺失所述基因而失活，優選通過完全缺失所述基因。尤其是，hmgb2基因的編碼區可以被替換為選擇標記，例如編碼二氫葉酸還原酶的人類基因。
[0023]hmgb2基因的功能也可以通過幹擾RNA的方法而失活，幹擾RNA阻塞或減少HMGB2蛋白的翻譯。
[0024]在本發明的寄生蟲中，一種或多種其它基因的功能可被失活。尤其是，功能被失活的其它基因可以選自編碼嘌呤核苷磷酸化酶、核苷轉運蛋白l、UIS3、nS4、p52和p36的基因及其組合。
[0025]在第二方面中，本發明涉及免疫原性組合物，其包含作為免疫原的免疫有效量的本發明的寄生蟲以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或支持物。本發明還涉及瘧疾疫苗，其包括作為免疫原的本發明的寄生蟲以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑或支持物。
[0026]免疫原性組合物或疫苗還可以包含一種或多種免疫佐劑。特別是，免疫佐劑可以選自胞壁肽類；海藻糖二黴菌酸酯(TDM);脂多糖(LPS);單磷醯脂質A(MPL);羧甲基纖維素；完全弗氏(Freund)佐劑；不完全弗氏佐劑；任選地補充角鯊烯或角鯊烷的「水包油」乳液型佐劑，;礦物佐劑；細菌毒素；CpG寡脫氧核苷酸；皂苷；合成的共聚物；細胞因子和咪唑喹諾酮類(imidazoquinolones)的佐劑。
[0027]免疫原性組合物或疫苗可以被配製為腸胃外給藥。[0028]免疫原性組合物或疫苗可以包括多種本發明的寄生蟲。
[0029]優選地，組合物或疫苗的每注射劑量包括在10至IO7之間，優選在10至IO5之間，更特別是優選在IO2至IO5之間的寄生蟲。
[0030]根據一個【具體實施方式】，免疫原性組合物或疫苗的每劑量單位包括在10至IO6之間，優選在IO2至IO6之間的紅細胞內形式的本發明的寄生蟲。
[0031]根據另一個【具體實施方式】，免疫原性組合物或疫苗的每劑量單位包括在IO2至IO7之間的非紅細胞內裂殖子形式的本發明的寄生蟲。
[0032]根據另一個【具體實施方式】，免疫原性組合物或疫苗的每劑量單位包括在IO3至IO7之間的子孢子形式的寄生蟲。
[0033]在另一個方面中，本發明涉及本發明的寄生蟲用於製備對抗瘧疾或腦型瘧疾的疫苗組合物中的用途。
[0034]在另一個方面中，本發明還涉及免疫受試者以對抗瘧疾的方法，包括對所述受試者施用本發明的免疫原性組合物或疫苗，優選胃腸外給藥，特別是皮下、肌內、皮內或靜脈內給藥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1:感染有用野生型寄生蟲PbNK65或突變的寄生蟲PbNK65 Δ hmgb2寄生的紅細胞(法文縮寫為GRP)的C57BL/6小鼠的寄生蟲血症(Parasit6mie)(分別每靜脈注射IO5和IO6的GRP)。通過在顯微鏡下對染色塗片中的GRP進行計數以分析寄生蟲血症，並表示為GRP的百分比(平均值土標準偏差)。實驗用5隻小鼠進行，並重複數次。P值為0.008。
[0036]圖2:研究用突變的寄生蟲PbNK65 Δ hmgb2進行初次感染並隨後用2個致病的野生型寄生蟲PbNK65和PbANKA感染三次的小鼠的存活率。第一組攻擊在J19 (初次感染後19天)進行，第二組在J71進行，最後第三組在J162進行。在每組攻擊時，通過感染未受到初次感染的同齡小鼠，並通過監控因嚴重寄生蟲血症(hyperparasit6mie)或腦型痕疾所致的境況及死亡的情況來驗證2種感染了 PbNK65和PbANKA的GRP製劑的致病性。每次試驗對5隻小鼠進行分析。
[0037]圖3:用不同量的感染了突變的寄生蟲PbNK65 Ahmgb2的GRP免疫C57BL/6小鼠。在時間O時，用103(口)、104(〇)或IO5(A)的感染了 PbNK65 Λ hmgb2的GRP感染10隻小鼠。之後，這些小鼠在J24用IO5的感染了野生型致病寄生蟲PbNK65(n=5)或PbANKA(n=5)的GRP進行感染攻擊。首次用於試驗的小鼠(Des souris na'ives )也在J24用IO5的感染了野生型致病寄生蟲PbNK65 ( ▲)或PbANKA (.)的GRP進行感染攻擊。
【具體實施方式】
[0038]惡性瘧原蟲基因組測序已於2002年完成。該基因組包含約5500個基因，其中50%以上的基因具有完全未知的功能。在研究惡性瘧原蟲中涉及轉錄調控的因子時，發明人注釋了 4個HMGB (PfHMGBl至4 ;高遷移率族蛋白)。這些是非常豐富的具有細胞核因子和細胞外介質的特異性的非組蛋白核蛋白。
[0039]在人類中，已經對其進行了詳細研究，其存在於細胞核中並發揮構件因子(facteurs architecturaux)的作用，通過染色質重塑參與轉錄調節。在對細胞而言危險的情況下(異物，炎症)，這些蛋白被主動分泌到細胞介質中和/或在細胞壞死的情況下被動分泌，並通過激活巨曬細胞和其它免疫系統的感應細胞(cellules competentes)而發揮實際危險信號(alarmines)的作用(Lotze和Tracey, 2005)。人HMGBl蛋白在疾病中的介入已證明會引起全身性炎症反應，如紅斑狼瘡、膿毒性休克或類風溼關節炎和某些癌症。最後，人HMGBl蛋白在患者的血清中的增加與這些疾病的嚴重程度相關。
[0040]在惡性瘧原蟲中，本發明人已更具體地研究了 PfHMGBl和PfHMGB2，其都是小於100個胺基酸的小蛋白。這兩種蛋白，同其人類同源基因一樣，能夠彎曲DNA (法文縮寫為ADN)並與特定DNA結構相互作用(Briquet等人，2006)。其也分泌到惡性瘧原蟲培養物上清液中並在惡性瘧原蟲培養物上清液中被發現。惡性瘧原蟲的HMGBl和2蛋白能夠在小鼠單核細胞系中 激活和誘導TNF α的表達(Kumar等人，2008)。
[0041]在本申請中，發明人用感染了伯氏瘧原蟲ANKA寄生蟲(PbANKA)的C57BL/6小鼠作為腦型瘧疾的動物模型。這種動物模型再現了人類病理學的主要特點，如共濟失調、空間定向力障礙、抽搐和昏迷。這些臨床症狀可以導致動物死亡。與人類類似，被寄生的紅細胞的隔離、腦出血和病變、促炎症性細胞因子的產生和血-腦屏障的破壞都可在此模型中觀察到。在該模型中，所有感染了 PbANKA分離株的C57BL/6小鼠在約7天內死於腦型瘧疾。在另一個方面中，本發明人觀察到60%的感染了寄生蟲PbANKA Ahmgb2的小鼠未發展成腦型瘧疾。
[0042]發明人失活了另一種伯氏瘧原蟲分離株即NK65分離株的hmgb2基因，其在感染後20至25天後因嚴重寄生蟲血症誘導C57BL/6小鼠死亡，但不引起腦型瘧疾。他們首先觀察到這種基因的失活阻礙了小鼠中PbNK65 Ahmgb2的發育，並在感染後10至15天時所獲得的外周血中，寄生蟲被清除了。發明人隨後證實，導致寄生蟲清除的宿主反應足以引起持續多於6個月的不育的免疫(immunit6 st6rile),這不僅針對於同源野生型種屬PbNK65,而且還針對於能夠誘導腦型瘧疾的高致病性異源種屬PbANKA。
[0043]因此，在第一方面中，本發明涉及屬於瘧原蟲屬且其hmgb2基因功能被失活的活寄生蟲，其用於瘧疾或腦型瘧疾的預防，優選在哺乳動物中，尤其是優選在人類中。
[0044]寄生蟲優選能夠在脊椎動物中發育，尤其是在哺乳動物中，並且屬於選自芬凱蟲屬(Plasmodium vinckeia)、痕原蟲屬(Plasmodium plasmodium)和拉符蟲屬(Plasmodiumlaverania)的亞屬。[0045]根據一個實施方式，寄生蟲能夠在人類宿主中發育並屬於痕原蟲屬(Plasmodiumplasmodium)或拉符蟲屬(Plasmodium laverania)亞屬。優選地，寄生蟲屬於導致人類痕疾的種類，特別是選自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和諾氏瘧原蟲的種類。雖然諾氏瘧原蟲是基本上感染靈長類動物的寄生蟲，但有越來越多的人類感染這種寄生蟲的病例被報導。更特別優選的為，寄生蟲屬於選自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲的種類。根據一個【具體實施方式】，寄生蟲屬於選自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲和三日瘧原蟲的種類。根據一個優選的實施方式，寄生蟲屬於惡性瘧原蟲的種類。
[0046]根據另一個實施方式，寄生蟲屬於能夠在人類中誘導免疫反應，但並不能夠引起痕疾症狀的種類。優選地，該寄生蟲屬於芬凱蟲屬(Plasmodium vinckeia)亞屬的哨齒動物寄生蟲。在對人類接種疫苗的過程中使用齧齒動物寄生蟲可顯著減少與對受試者施用活寄生蟲相關的風險。齧齒動物寄生蟲可以被修飾，以表達一種或多種感染人類的瘧原蟲如惡性瘧原蟲中的蛋白，其是侵入人類紅細胞所需要的。這樣的蛋白是，例如，在Triglia等人，2000中所描述的蛋白。優選地，寄生蟲屬於伯氏瘧原蟲或約氏瘧原蟲的種類。更特別優選地，寄生蟲屬於伯氏瘧原蟲的種類。根據一個優選的實施方式，寄生蟲是伯氏瘧原蟲種類的NK65分尚株。
[0047]根據一個【具體實施方式】，寄生蟲屬於選自伯氏瘧原蟲、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和諾氏瘧原蟲的種類。寄生蟲也可以屬於選自伯氏瘧原蟲、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲的種類，或選自伯氏瘧原蟲、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲和三日瘧原蟲的種類，或選自伯氏瘧原蟲和惡性瘧原蟲的種類。
[0048]根據一個優選的實施方式，寄生蟲的野生型種屬，即其hmgb2基因有活性的寄生蟲，不引起腦型瘧疾。該種屬可能，例如，選自伯氏瘧原蟲NK65、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、三日瘧原蟲和諾氏瘧原蟲。該種屬也可以是已失去其細胞粘附能力或具有降低的細胞粘附能力的惡性瘧原蟲種屬。根據一個實施方式，寄生蟲的野生型種屬是非細胞粘附的惡性瘧原蟲種屬。根據另一個實施方式，寄生蟲的野生型種屬是具有降低的細胞粘附能力的惡性瘧原蟲種屬。細胞粘附是惡性瘧原蟲的性質，其直接關係到腦型瘧疾的發展。實際上，感染了細胞粘附的惡性瘧原蟲種屬的紅細胞能結合到內皮細胞的表面分子上，如CD36、ICAMUVCAMl或PECAMl/⑶31，並因此在各種器官，尤其是腦中引起血管阻塞、炎症和損傷。種屬的細胞粘附能力可以通過任何本領域技術人員已知的技術進行評估，例如在Buffet等人，1999或在Traore等人，2000中所描述的。術語「降低的細胞粘附能力」是指比參照的細胞粘附的瘧原蟲種屬，例如惡性瘧原蟲3D7種屬中所觀察到的細胞粘附能力低的細胞粘附能力。以細胞粘附的瘧原蟲種屬，如惡性瘧原蟲3D7種屬作參照，細胞粘附可以減少至少40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%，優選至少80%，更優選至少90%。例如，可以通過在培養基中多次離體傳代(Udeinya等人，1983)來獲得具有降低的細胞粘附能力的惡性瘧原蟲種屬。例如在Trenholme等人，2000中(其clag9基因被失活的惡性瘧原蟲)和Nacer等人，2011(惡性瘧原蟲DlO和T9-96)中描述了具有降低的細胞粘附能力的各種惡性瘧原蟲種屬。因此，根據一個【具體實施方式】，寄生蟲的野生型種屬是鮮有細胞粘附的或非細胞粘附的惡性瘧原蟲種屬。尤其是，寄生蟲的野生型種屬可以是具有降低的細胞粘附能力的惡性瘧原蟲種屬，其選自器clag9基因被失活的惡性瘧原蟲種屬、惡性瘧原蟲DlO種屬和惡性瘧原蟲T9-96種屬。[0049]本發明使用的寄生蟲中，hmgb2基因的功能是被失活的。這意味著，由該基因編碼的HMGB2蛋白的活性被完全或部分抑制，優選為完全抑制。這種抑制可以通過本領域技術人員公知的多種方法而獲得。因此，可以在轉錄或翻譯水平或在蛋白質水平上阻斷基因功能，例如通過阻斷或降低hmgb2基因的轉錄或翻譯或者通過破壞蛋白的正確摺疊或其活性。
[0050]為了失活該基因，尤其可以通過完全或部分缺失該基因，或者插入或替換一個或多個核苷酸使hmgb2基因的功能失活。
[0051]根據一個【具體實施方式】，hmgb2基因的功能通過完全或部分缺失該基因而失活，優選通過完全缺失。
[0052]優選地，通過同源重組獲得hmgb2基因的缺失。該方法是本領域技術人員所公知的，並已多次應用於瘧原蟲屬的寄生蟲(參見，如Thathy和M6nard，2002)。根據一個【具體實施方式】，通過同源重組將hmgb2基因的編碼區替換為標記物，該標記物使得可以篩選發生重組的寄生蟲。選擇標記可以是，例如賦予寄生蟲乙胺嘧啶抗性的人類二氫葉酸還原酶(dhfr)基因。在實驗部分例證了缺失hmgb2基因的寄生蟲的獲取。根據本發明的一個【具體實施方式】，使用的寄生蟲是將其hmgb2基因替換為選擇標記的寄生蟲，優選為人類dhfr基因。根據本發明的一個非常具體的實施方式，寄生蟲是伯氏瘧原蟲，優選為NK65分離株，其中hmgb2基因已被替換為選擇標記，優選為人類dhfr基因。根據本發明的另一個【具體實施方式】，使用的寄生蟲是惡性瘧原蟲，其優選是非細胞粘附或鮮有細胞粘附的，其中hmgb2基因已被替換為選擇標記，優選人類dhfr基因。
[0053]也可通過阻斷或降低該基因的mRNA (法文縮寫為ARNm)的翻譯使hmgb2基因的功能失活。RNA (法文縮寫為ARN)幹擾可以特異性抑制靶基因的表達，其是本領域技術人員公知的現象並且已被用於抑制瘧原蟲基因的表達(參見，例如McRobert和McConkey，2002 ；Mohmmed等人,2003 ；Gissot等人,2004)。根據一個實施方式,編碼幹擾RNA或其前體的序列被引入到寄生蟲的基因組中且由強啟動子控制其表達，優選組成型啟動子，例如，eEFla延伸因子的啟動子，該因子在寄生蟲發育的所有階段都有活性，或者HSP70基因的啟動子，該基因在子孢子和整個紅細胞周期中都有活性。本領域技術人員可以容易地選擇幹擾RNA的序列和結構。尤其是，所使用的幹擾RNA可以是小幹擾RNA(siRNA，法文縮寫為ARNsi)。
[0054]下述表1中給出了已經測序的不同瘧原蟲種類的hmgb2基因的序列及其相應蛋白序列的GenBank號。
[0055]表1.目前已測序的不同瘧原蟲種類的HMGB2的核苷酸和蛋白序列的GenBank號
[0056]
【權利要求】
1.一種屬於瘧原蟲屬且hmgb2基因功能被失活的活寄生蟲，其用於預防哺乳動物的瘧疾或腦型瘧疾。
2.根據權利要求1所述的寄生蟲，其中寄生蟲選自伯氏瘧原蟲(Plasmodiumberghei)、惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)、間日痕原蟲(Plasmodium vivax)、卵形痕原蟲(Plasmodium ovale)、三日痕原蟲(Plasmodium malariae)和諾氏痕原蟲(Plasmodium knowlesi)。
3.根據權利要求1或2所述的寄生蟲，其中寄生蟲選自惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和三日瘧原蟲。
4.根據權利要求1至3任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲是惡性瘧原蟲。
5.根據權利要求1至4任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲的野生型形式不引起腦型瘧疾。
6.根據權利要求1、2和5任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲是伯氏瘧原蟲NK65(Plasmodium berghei NK65)。
7.根據權利要求1至5任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲是非細胞粘附的或細胞粘附能力降低的惡性瘧原蟲。
8.根據權利要求7所述的寄生蟲，其中寄生蟲是細胞粘附能力降低的惡性瘧原蟲種屬。
9.根據權利要求1至8任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲是非紅細胞內裂殖子的形式。
10.根據權利要求1至8任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲是紅細胞內的形式。
11.根據權利要求10所述的寄生蟲，其中寄生蟲是紅細胞內滋養體、裂殖子或裂殖體的形式。
12.根據權利要求11所述的寄生蟲，其中寄生蟲是紅細胞內裂殖子或裂殖體的形式。
13.根據權利要求1至8任一項所述的寄生蟲，其中寄生蟲是子孢子的形式。
14.根據權利要求1至13任一項所述的寄生蟲，其中通過hmgb2基因的完全或部分缺失使hmgb2基因的功能失活。
15.根據權利要求14所述的寄生蟲,其中通過hmgb2基因的完全缺失使hmgb2基因的功能失活。
16.根據權利要求14或15所述的寄生蟲，其中hmgb2基因的編碼區被替換為選擇標記。
17.根據權利要求16所述的寄生蟲，其中選擇標記是編碼二氫葉酸還原酶的人類基因。
18.根據權利要求1至13任一項所述的寄生蟲，其中利用阻塞或減少HMGB2蛋白翻譯的幹擾RNA使hmgb2基因的功能失活。
19.根據權利要求1至18任一項所述的寄生蟲，其中一種或多種其它基因的功能被失活。
20.根據權利要求19所述的寄生蟲，其中其功能被失活的其它基因選自編碼嘌呤核苷磷酸化酶、核苷轉運蛋白l、UIS3、HS4、p52和p36的基因及其組合。
21.一種免疫原性組合物，其包括免疫有效量的作為免疫原的權利要求1至20中任一項所定義的寄生蟲，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑或支持物。
22.—種瘧疾疫苗，其包括作為免疫原的權利要求1至20中任一項所定義的寄生蟲，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑或支持物。
23.根據權利要求21所述的免疫原性組合物或權利要求22所述的疫苗，其還包括一種或多種免疫佐劑。
24.根據權利要求23所述的免疫原性組合物或疫苗，其中免疫佐劑選自胞壁肽類的佐劑；海藻糖二黴菌酸酯(TDM);脂多糖(LPS);單磷醯脂質A (MPL);羧甲基纖維素；完全弗氏佐劑；不完全弗氏佐劑；任選地補充有角鯊烯或角鯊烷的「水包油」乳液型佐劑；礦物佐劑；細菌毒素；CpG寡脫氧核苷酸；皂苷；合成的共聚物；細胞因子和咪唑喹諾酮。
25.根據權利要求21、23和24任一項所述的免疫原性組合物或權利要求22至24中任一項所述的疫苗，其被配製為腸胃外給藥形式。
26.根據權利要求21和23至25任一項所述的免疫原性組合物或權利要求22至25中任一項所述的疫苗，其包括數種權利要求1至20中任一項所定義的寄生蟲。
27.根據權利要求21和23至26任一項所述的免疫原性組合物或權利要求22至26中任一項所述的疫苗，其每劑量單位包括在10至IO6之間的，優選在IO2至IO6之間的紅細胞內形式的所述寄生蟲。
28.根據權利要求21和23至26任一項所述的免疫原性組合物或權利要求22至26中任一項所述的疫苗，其每劑量單位包括在IO3至IO7之間的子孢子形式的寄生蟲。
29.根據權利要求21和23至26任一項所述的免疫原性組合物或根據權利要求22至26中任一項所述的疫苗 ，其每劑量單位包括在IO2至IO7之間的非紅細胞內裂殖子形式的寄生蟲。
30.權利要求1至20任一項所述的寄生蟲用於製備對抗瘧疾或抗腦型瘧疾的疫苗組合物的用途。
31.一種免疫受試者以對抗瘧疾的方法，其包括對所述受試者施用權利要求21和23至29中任一項所述的免疫原性組合物或權利要求22至29中任一項所述的疫苗。
32.根據權利要求31所述的方法，其中組合物或疫苗是經腸胃外施用的。
33.根據權利要求32所述的方法，其中組合物或疫苗經皮下、肌內、皮內或靜脈內給藥。
【文檔編號】A61P33/06GK103842029SQ201280045498
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年7月19日 優先權日:2011年7月20日
【發明者】凱薩琳·瓦克羅, 西爾維·布裡凱, 納杜·埃塞尼亞·勞森-赫巴恩, 薩拉赫迪內·梅凱裡, 羅伯特·梅納德 申請人:皮埃爾與瑪麗·居裡-巴黎第六大學, 巴斯德研究院