西米特酸的提取方法
2023-05-04 08:12:06 1
專利名稱：西米特酸的提取方法
技術領域：
本發明涉及一種化合物提取方法，尤其是指一種從中國南海海綿Rhabdastrella globostellata中提取西米特酸(異臭椿酸化合物)的方法。
背景技術：
海綿是最原始的多細胞動物之一，種類繁多，分布極廣，以海產為主。我國南海地處熱帶和亞熱帶，海洋生物物種極為豐富，特別是海綿，約佔世界總數的一半。近年來人們已從海綿生物中發現了許多結構獨特的有機化合物如萜類、甾體、苷類、生物鹼、多肽和聚醚類等，其中許多具有抗腫瘤、抗心血管病、抗菌和抗病毒等生理活性，不少化合物具有潛在的臨床應用價值。特別是以這些化合物為先導物，經過化學結構的修飾，獲得生理活性更強、毒性更低的有機藥物，引起世界各國越來越多的關注。
本發明所涉及的異臭椿酸化合物，結構上屬於一種三萜酸，因此也稱異臭椿酸三萜，是海綿中一類具有重要生理活性的三萜類天然產物，我們稱之為西米特酸。它是一類具有重要生理活性的天然產物。中科院上海藥物研究所的初步篩選發現，西米特酸對B淋巴細胞和T淋巴細胞的增殖顯示出100％的抑制作用(0.1μM濃度下)；動物體內抑瘤試驗表明，西米特酸對艾氏腹水癌實體瘤、S180肉瘤、A-549人肺腺癌、人肺巨細胞(PG)癌和人LOVO結腸癌等 異臭椿酸三萜(西米特酸)多種腫瘤模型有較高的抑制增殖活性，且安全係數較大。在華南腫瘤學國家重點實驗室進行的抗癌作用機理研究表明，西米特酸能通過激活Caspase-3酶誘導HL-60腫瘤細胞的凋亡；基因晶片檢測試驗顯示，西米特酸能增高或降低一些凋亡基因的表達；抑制PI3K/AKT信號轉導途徑可能是其抗腫瘤的作用機制。
海綿Rhabdastrella globostellata資源在南海數量可觀，採集方便(水深2～3米)，海綿中的西米特酸含量較豐富(約佔乾重的0.02％)。但原有的提取工藝(見專利申請號「95116029.X」)，該專利公開了如下提取工藝曬乾海綿破碎後用乙醇抽提，將抽提物濃縮至漿狀，然後將其分散於適量水中，再以石油醚，乙酸乙酯和正丁醇依次進行萃取分離，將所得乙酸乙酯部分經5次矽膠柱層析和2次葡聚糖凝膠柱層析，分別以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇作淋洗劑，將洗出液減壓濃縮後得到金黃色固體，再將該固體溶解於適量苯中，得到圓片狀晶體，即西米特酸。其產率為0.0022％。該方法的缺點在於比較繁瑣，耗時長、成本高，需要多次、反覆使用不易操作的矽膠柱層析，多次變換淋洗劑，且需用到價格較貴的葡聚糖凝膠LH-20作柱層析分離，不僅周期長、成本高，而且產率低，無法適應較大規模的製備，1克樣品的生產通常耗時2～3個月，有時甚至達半年。
發明內容
為了解決上述現有技術中存在的不足，本發明的目的在於提供一種西米特酸(異臭椿酸化合物)的提取方法。該方法充分利用了該類化合物的理化性質，以工業乙醇為初步提取劑，並連續以乙酸乙酯、氯仿作萃取劑，再通過石油醚除雜、柱層析和重結晶等步驟獲得純品異臭椿酸化合物。本發明提取方法具有生產周期短、成本低和產率高，適應規模製備的要求等優點。
本發明的目的通過下述技術方案實現一種西米特酸(異臭椿酸化合物)的提取方法，包括如下工藝步驟(1)海綿(Rhabdastrella sp.)用乙醇浸泡抽提得到乙醇提取液。
(2)乙醇提取液經濃縮得到海綿浸膏，將海綿浸膏分散於水中，用乙酸乙酯萃取，合併萃取液，濃縮，得到乙酸乙酯濃縮物。
(3)將乙酸乙酯濃縮物分散於體積濃度為80～95％的甲醇水溶液中，用石油醚萃取除雜後，剩餘液用水稀釋至40～70％(指甲醇的體積濃度)，再用氯仿萃取，合併、濃縮，得氯仿萃取物。
(4)氯仿萃取物經矽膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(體積比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶劑系統梯度淋洗，直至米黃色的西米特酸組分完全洗脫。
(5)合併所有西米特酸組分，濃縮，得到西米特酸粗品。
為了更好地實現本發明，將西米特酸粗品用柱層析除雜，得到金黃色粉末；然後重結晶，得到桔紅色的西米特酸純品。
所述乙醇為體積濃度95％的工業乙醇。所述海綿用乙醇浸泡3～5周，抽提3次。所述水為蒸餾水。步驟(4)中米黃色的西米特酸組分完全洗脫，可用色層法或TLC(薄層色譜)法進行監控。所述濃縮為減壓濃縮。
所述柱層析採用體積比8∶2的石油醚-丙酮柱層析或體積比9∶1的氯仿-丙酮柱層析。所述重結晶採用氯仿-石油醚重結晶，氯仿∶石油醚的體積比為6∶4。
本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果本發明的產率由原工藝的0.0024％提高到現在的0.03％，增加約12倍；生產周期由原先的2～3個月縮短至1～2個月；操作簡化，易於掌握；成本降低，本發明充分利用產品的理化性質，運用不同極性的溶劑，多次、分級萃取，取代原工藝的多次矽膠柱層析和凝膠柱層析，節省了大量矽膠和凝膠的消耗。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
實施例1將2.0公斤(乾重量)南海海綿Rhabdastrella globostellata破碎後用95％的工業乙醇室溫浸泡1周，濾幹後殘渣再浸泡2次，每次1周，共抽提3次，得到乙醇提取液。將乙醇提取液合併後減壓濃縮至黑色漿狀物(海綿浸膏)。將該漿狀物均勻分散在500ml蒸餾水中，以乙酸乙酯(500ml)萃取3次，合併萃取液並減壓濃縮，得乙酸乙酯濃縮物64克。將乙酸乙酯濃縮物均勻分散在300毫升93％的甲醇水溶液中，用石油醚(300ml)萃取3次除雜。剩餘液水層再用蒸餾水稀釋至70％(指甲醇的體積濃度)，用氯仿(500ml)萃取3次，合併萃取液，濃縮得氯仿萃取物20克。該萃取物經矽膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(體積比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶劑系統梯度淋洗，依次除去綠色、黑色的低極性組分，至出現米黃色的西米特酸組分，用顏色界面監控(即色層法)，直至西米特酸組分完全洗脫下來。合併所有米黃色的西米特酸色譜層，減壓濃縮，得西米特酸粗品10克。將該粗品用體積比8∶2的石油醚-丙酮柱層析進一步除雜，得金黃色粉末2克。最後用氯仿-石油醚(體積比6∶4)重結晶，得桔紅色的西米特酸純品0.35克。產率0.0175％。
產品化學結構的確認紅外數據vmax(cm-1)3427，2939，1711，1691，1579，1542，1422，1391，1289，1184，1160，974，803；核磁數據δ1H(CDCl3)7.42(1H，d)，7.06(1H，dd)，6.76(1H，d)，6.676(1H)，6.659(1H)，6.44(1H，d)，2.76(1H，m)，2.44(1H，m)，2.37(3H，s)，2.25(2H，dd)，2.21(2H，m)，2.07(3H，s)，2.05(3H，s)，1.90(1H，dd)，1.64(1H，m)，1.54(2H，m)，1.46(3H，s)，1.15(3H，s)，1.08(3H，s)，0.88(3H，s)。
實施例2將2.0公斤(乾重量)南海海綿Rhabdastrella globostellata破碎後用95％的工業乙醇室溫浸泡2周，濾幹後殘渣再浸泡2次，每次1.5周，共抽提3次，得到乙醇提取液。將乙醇提取液合併後減壓濃縮至海綿浸膏(漿狀物)，將該海綿浸膏均勻分散在500ml蒸餾水中，以乙酸乙酯(500ml)萃取3次，合併萃取液並減壓濃縮，得乙酸乙酯濃縮物80克。將乙酸乙酯濃縮物均勻分散在300毫升80％的甲醇水溶液中，用石油醚(300ml)萃取3次除雜，剩餘液水層再用蒸餾水稀釋至40％(指甲醇的體積濃度)，用氯仿(500ml)萃取3次，合併萃取液，濃縮得氯仿萃取物35克。該萃取物經矽膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(體積比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶劑系統梯度淋洗，依次除去綠色、黑色的低極性組分，至出現米黃色的西米特酸組分，用TLC法進行監控，直至西米特酸組分完全洗脫下來。合併所有TLC斑點與西米特酸標準樣品接近的組分，減壓濃縮，得西米特酸粗品20克。將該粗品用體積比9∶1的氯仿-丙酮柱層析進一步除雜，得金黃色粉末4克。最後用氯仿-石油醚(體積比6∶4)重結晶，得西米特酸純品0.6克，產率0.03％。
產品化學結構的確認紅外數據vmax(cm-1)3427，2939，1710，1691，1579，1541，1422，1391，1289，1183，1160，974，803；核磁數據δ1H(CDCl3)7.42(1H，d)，7.06(1H，dd)，6.76(1H，d)，6.676(1H)，6.659(1H)，6.44(1H，d)，2.76(1H，m)，2.44(1H，m)，2.37(3H，s)，2.25(2H，dd)，2.21(2H，m)，2.07(3H，s)，2.05(3H，s)，1.90(1H，dd)，1.64(1H，m)，1.54(2H，m)，1.46(3H，s)，1.15(3H，s)，1.08(3H，s)，0.88(3H，s)。
實施例3將2.0公斤(乾重量)南海海綿Rhabdastrella globostellata破碎後用95％的工業乙醇室溫浸泡2周，濾幹後殘渣再浸泡2次，每次1周，共抽提3次，得到乙醇提取液。將乙醇提取液合併後減壓濃縮至黑色漿狀物(海綿浸膏)。將該漿狀物均勻分散在500ml蒸餾水中，以乙酸乙酯(500ml)萃取3次，合併萃取液並減壓濃縮，得乙酸乙酯濃縮物78克。將乙酸乙酯濃縮物均勻分散在300毫升87％的甲醇水溶液中，用石油醚(300ml)萃取3次除雜。剩餘液水層再用蒸餾水稀釋至55％(指甲醇的體積濃度)，用氯仿(500ml)萃取3次，合併萃取液，濃縮得氯仿萃取物33克。該萃取物經矽膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯(體積比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶劑系統梯度淋洗，依次除去綠色、黑色的低極性組分，至出現米黃色的西米特酸組分，用顏色界面監控(即色層法)，直至西米特酸組分完全洗脫下來。合併所有米黃色的西米特酸色譜層，減壓濃縮，得西米特酸粗品18克。將該粗品用體積比8∶2的石油醚-丙酮柱層析進一步除雜，得金黃色粉末3.5克。最後用氯仿-石油醚(體積比6∶4)重結晶，得桔紅色的西米特酸純品0.55克。產率0.0275％。
產品化學結構的確認紅外數據vmax(cm-1)3428，2940，1711，1692，1579，1542，1422，1391，1289，1186，1160，973，803；核磁數據δ1H(CDCl3)7.42(1H，d)，7.06(1H，dd)，6.76(1H，d)，6.676(1H)，6.659(1H)，6.44(1H，d)，2.76(1H，m)，2.44(1H，m)，2.37(3H，s)，2.25(2H，dd)，2.21(2H，m)，2.07(3H，s)，2.05(3H，s)，1.90(1H，dd)，1.64(1H，m)，1.54(2H，m)，1.46(3H，s)，1.15(3H，s)，1.08(3H，s)，0.88(3H，s)。
權利要求
1.一種西米特酸的提取方法，包括如下工藝步驟(1)海綿用乙醇浸泡抽提得到乙醇提取液；(2)乙醇提取液經濃縮得到海綿浸膏，將海綿浸膏分散於水中，用乙酸乙酯萃取，合併萃取液，濃縮，得到乙酸乙酯濃縮物；(3)將乙酸乙酯濃縮物分散於體積濃度為80～95％的甲醇水溶液中，用石油醚萃取除雜後，剩餘液用水稀釋至40～70％，再用氯仿萃取，合併、濃縮，得氯仿萃取物；(4)氯仿萃取物經矽膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯溶劑系統梯度淋洗，直至米黃色的西米特酸組分完全洗脫；(5)合併所有西米特酸組分，濃縮，得到西米特酸粗品。
2.根據權利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述西米特酸粗品用柱層析除雜，得到金黃色粉末；然後重結晶，得到桔紅色的西米特酸純品。
3.根據權利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述乙醇為體積濃度95％的工業乙醇。
4.根據權利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述海綿用乙醇浸泡3～5周，抽提3次。
5.根據權利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述水為蒸餾水。
6.根據權利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於步驟(4)中米黃色的西米特酸組分完全洗脫，用色層法或薄層色譜法進行監控。
7.根據權利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述濃縮為減壓濃縮。
8.根據權利要求2所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述柱層析採用體積比8∶2的石油醚-丙酮柱層析或體積比9∶1的氯仿-丙酮柱層析。
9.根據權利要求2所述的西米特酸的提取方法，其特徵在於所述重結晶採用氯仿-石油醚重結晶，氯仿∶石油醚的體積比為6∶4。
全文摘要
本發明公開了一種西米特酸的提取方法。該提取方法如下海綿用乙醇浸泡抽提得到乙醇提取液；經濃縮得到海綿浸膏，將海綿浸膏分散於水中，用乙酸乙酯萃取，合併萃取液，濃縮，得到乙酸乙酯濃縮物；將乙酸乙酯濃縮物分散於甲醇水溶液中，用石油醚萃取除雜後，剩餘液用水稀釋，再用氯仿萃取，合併、濃縮，得氯仿萃取物；氯仿萃取物經矽膠柱層析，用石油醚－乙酸乙酯溶劑系統梯度淋洗，直至米黃色的西米特酸組分完全洗脫；合併所有西米特酸組分，濃縮，得到西米特酸粗品。本發明具有生產周期短、成本低和產率高等特點。
文檔編號C07C59/82GK1861558SQ20061003589
公開日2006年11月15日 申請日期2006年6月12日 優先權日2006年6月12日
發明者肖定軍, 鄧松之 申請人:中國科學院廣州化學研究所