用誘餌成分保護生物活性食品成分的方法

2023-05-04 15:20:41

專利名稱：：用誘餌成分保護生物活性食品成分的方法
技術領域：
：本發明涉及包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣生物活性食品成分的食品，其中所述活微生物和所述感興趣的生物活性食品成分以使所迷微生物對所述感興趣生物活性食品成分的代謝降低的方式使用。
背景技術：
：在過去數年中，食品成分、尤其是生物活性或功能性肽(即在消化道內局部或在it^v循環系統後在機體內其它遠處具有對消費者有益的活性)的市場正快速擴張。生物活性肽被定義為在其來源蛋白質中無活性、但一旦由於酶促作用而釋放出來即顯示特殊性質的M酸序列。所述肽還被稱為功能肽。除其它方面的作用外，所述生物活性肽還能夠作用於消化系統、機體防禦(例如抗微生物或免疫調節作用)、心血管系統(特別是抗凝血或抗高1和表2)。下表1列出了來源於人乳和牛乳的蛋白質水解釋放出的主要功能肽。表ltableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8(*)u酸序列並不完全一致(**)H-人乳，C-牛乳下表2總結了迄今為止在乳中發現的功能肽的主要生理活性。表2tableseeoriginaldocumentpage8表2(續上)tableseeoriginaldocumentpage9所述肽一般通過植物蛋白質(例如大豆蛋白質)或動物蛋白質(例如酪蛋白或乳血清蛋白質)的水解來獲得。所述水解通過酶促和/或發酵方法達成，通常伴隨著活性組分的濃縮，一般需要該步驟以提供相關的"健康利益"。這些提供"健康利益"的肽的生產和使用在文獻中有眾多的背景(參見DanoneWorldNewsletterNo.17，1998年9月)。在可能包含此類成分的食品載體中，由於存在發酵劑和發酵產物(即由乳酸菌轉化乳中存在底物而產生的分子)，發酵的乳製品能夠很好地提供健康利益。迄今為止，科學家們花費大量的精力研究發酵劑的性質。最近研究人員開始關注發酵產品，其中尤其是某些肽，因為它們是大量的、特異性生物信使。因此，發酵的乳製品似乎特別適合用作生物活性肽水解物的栽體，例如從乳品底物如酪蛋白或血清蛋白獲得的生物活性肽水解物。然而，出現了主要問題用於生產鮮乳製品(酸乳、發酵乳製品、基於乳的發酵飲料等)的微生物、尤其是乳酸菌通常能夠消耗肽以滿足它們的營養需求，尤其是它們的氮需求。在本發明的框架內，所述問題被稱為"肽代謝"。事實上，乳酸菌具有數種降解和/或轉運系統，使其能夠代謝肽，從而導致所述肽從介質中消失1.蛋白質水解系統(細胞壁蛋白酶，PRT)，其可切割蛋白質和大肽，促進其同化("胞外代謝")，2.轉運向細胞內部的系統，其中一種系統對大小約10個胺基酸的寡肽有特異性，另一種系統適於轉運二肽和三肽(乳桿菌具有另外的三肽通透酶系統)("轉運向細胞內部的系統，，)，和3.胞內酶系統，其能夠將肽降解為胺基酸(包括約15種內肽酶和外肽酶)("胞內代謝系統")。考慮到天然存在於乳中的肽含量與乳酸菌的需求相比一般太低，通常通過提供補充肽來加速它們的生長。所述肽然後在發酵期間被完全消耗。最終，由於(i)乳酸菌的氮需求，其中肽組成了乳中的主要來源，(ii)所述細菌高效消耗肽的能力，和(iii)直至使用期限(UBD)乳酸菌群在基於乳的發酵產品中的大量存活，因此很難甚至不可能在發酵乳製品中使用含有功能肽的成分，因為所述成分通常會在發酵期間或直至UBD的貯存期間被乳酸菌消耗。此外，細菌對肽的"不合時宜，，的代謝所導致的降解問題不僅不是特異性針對給定肽，而且也不是特異性針對特定發酵劑(或能夠發酵的微生物，優選細菌)。這個問題實際上普遍存在，不管使用哪種肽和微生物都會發生。可以引用生物活性aSl[91-100肽的情況作為一個實例(參見歐洲專利EP0714910;aSl[91-100肽是一種具有抗痙攣性質的肽，包含於乳蛋白質水解物中，具體由Ingredia上市銷售51-53，AvenueFernandLobbedezBP94662033ARRASCedex,法國，商品名Lactium)。因此，申請人發現在最終產品貯存期間存在於最終產品中的活乳酸菌群仍繼續代謝生物活性肽，因此僅僅10天(對於UBD為28天的新鮮產品)後，大約35-55。/Q的aSl[91-1001肽消失了，為保證對消費者的"健康"作用，這是一個完全不可接受的事實(數據未給出)。既然生物活性肽的消耗是由發酵劑的代謝活性所導致，那麼可以考慮通過破壞所有或部分的微生物來有效減少這種現象，例如採用適當的熱處理(熱處理(thermization)或巴氏消毒)。在此情況下，有可能保留aSl[91-100肽(例如，加熱至75'C大約1分鐘之後)。然而，這種方案存在很多缺點-發酵乳製品的熱滅菌涉及在熱處理前使用添加穩定劑(果膠、澱粉、角叉膠等)，因而使工藝更複雜，並顯著增加了配方的成本；-工業生產線更為複雜，並要求更為顯著的專門投資；-產品不再受益於與含活發酵劑的產品(酸乳)相關的質量標識，實際上將喪失與乳酸發酵劑消費相關的益處；和-感官影響顯著，通常是負面影響。因此需要有既包含活微生物例如酸乳又包含一種或多種感興趣的生物活性食品成分的食品，其中所述感興趣的生物活性食品成分受到保護而免於所述活微生物所導致的代謝，同時又能保持食品的感官質量。
發明內容通過本發明，申請人提供了一種滿足現存需求的解決方案。因此，本發明涉及包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣的生物活性食品成分的食品，其中所述活微生物和所述感興趣的生物活性食品成分以減少所述活微生物對所述感興趣生物活性食品成分的代謝的方式使用。因此，申請人已經表明，如果使用所述成分與所述微生物的組合條件合適，則一種或多種感興趣的生物活性食品成分能夠被有效地保護而免於被該活微生物代謝。此種合適的使用條件可涉及各種手段，包括a)使用能降低感興趣生物活性食品成分代謝的活微生物；和/或b)使用被有意用作活微生物"飼料"的誘斜食品成分；和/或c)對所述生物活性食品成分進行物理保護，特別是對所述生物活性食品成分進行包封。就此來說有必要指出的是，這些手段中的一種或多種甚至全部可以有益地組合於同一食品中。因此，本發明的一個目的是包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣生物活性食品成分的食品，其中所述感興趣的生物活性食品成分4皮以如下方式保護-物理方式，所述感興趣的生物活性食品成分優選被包封；和/或-通過包含於所述食品中的至少一種誘斜食品成分，由此來減少所述活微生物對所述感興趣生物活性食品成分的代謝。正如在前面一般性描述中簡單指出的，根據本發明，"代謝，，是指物質被一種或多種活微生物所轉化或降解，所述物質作為營養源被消耗，最終結果是所述物質從介質中或多或少地完全消失。根據本發明，當所述成分的代謝低於相同成分在未按照本發明內提供的至少一種手段進行保護時的代謝，則該成分的代il^皮"減少"。有利地，並且理想地，這種減少的代謝傾向於0，或甚至達到0，導致4艮少、幾乎沒有、或甚至沒有所述成分的代謝。才艮據本發明的一個具體實施方案，在其製備3周後，所述食品中感興趣生物活性食品成分的殘留量，大約是其製備後即刻存在於食品中的感興趣生物活性食品成分含量的50-100%。優選所述殘留量為大約80-100%。根據本發明，"所述食品中感興趣的生物活性食品成分的殘留量"是指當將所述食品在適當貯存條件(例如，新鮮產品在約4到IO'C)下放置3周後，與感興趣的生物活性食品成分的起始百分含量(即產品生產後即刻存在於其中的百分含量)相比較，在所述食品中存在的感興趣生物活性食品成分的百分含量。優選地，根據本發明的食品包含至少一種誘飾食品成分。根據本發明，"誘飾食品成分"是指能夠作為活微生物的營養源(尤其是氮源)的食品成分(優選肽或蛋白質，或其類似物或衍生物，或其組合)，並優先地意欲以這種方式淨史所述微生物代謝，使得代謝偏離希望保留的感興趣生物活性食品成分，當然這是作為優先。因此，誘辨成分代表了微生物的營養源，其被故意犧牲以儘可能地保護所述感興趣的生物活性食品成分。就這一點來講，誘飾食品成分充當了感興趣生物活性食品成分轉運的竟爭性抑制劑。應當注意，以非常有利的方式，食品中誘倂成分的存在使得有可能使用任何適當的活微生物生產所述產品，而無需考慮所述微生物代謝感興趣生物活性食品成分的能力。根據本發明的一個具體實施方案，所述食品包含佔最終產品總重量大約0.001%到2%重量的誘何食品成分。所述食品優選包含佔最終產品總重量大約0.001%到0.2%重量的誘辨食品成分。根據本發明的一個具體實施方案，所述食品中誘辨食品成分的代謝速率是，在其製備3周後，至少等於所述感興趣的生物活性食品成分的代謝速率。誘飾食品成分的這種代謝速率優選高於感興趣的生物活性食品成分的代謝速率。才艮據本發明的一個具體實施方案，所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘飾食品成分是選自-蛋白質，-肽，-其類似物或衍生物，及-其組合。所述感興趣的生物活性食品成分優選地選自aSl[91-100肽(參見歐洲專利EP0714910)、C6-asl[194-199肽(參見美國專利US6,514,941)、C7-p[177-183肽(參見美國專利US6,514,941)、C12-asl[23-34]肽(參見美國專利US6,514,941)、妙白磷酸肽(CPP)、a-酪啡肽、a-SI^白外啡肽U-caseinexorphin)、酪激肽、卩-酪啡肽、酪蛋白巨肽(CMP)，其也稱為糖巨肽(GMP)或酪蛋白糖巨肽(CGMP)、酪新素(casoxin)、casoplatellins、片段50-53,p國專L嗎叫卜樣狀，lactoferroxin,Val畫Pro畫Pro肽(參見歐洲專利EP0583074)、Lys國Val-Leu國Pro-Val-Pro-Gln肽(參見歐洲專利申請EP07376卯)、Tyr-Lys-Val-Pro-Gln-Leu肽(參見歐洲專利申請EP0737690)、Tyr-Pro肽(參見歐洲專利申請EP1302207和歐洲專利EP0821968)、Ile-Pro曙Pro肽(參見Nakamura""/.，1995，和日本專利jp6197786)、其片段、類似物和衍生物、包含其的蛋白質和/或肽、及其組合(綜述具體參見DanoneWorldNewsletterNo.17，1998年9月)。更為優選地，所述感興趣的生物活性食品成分選自aSl[91-100肽、其片段、類似物和衍生物、包含其的蛋白質和/或肽、及其組合。"類似物，，是指原始化合物的任意修飾形式，在本發明情況下是指蛋白質或肽，所述修飾形式可以是天然或合成的，其中在原始化合物的結構上添加或去除一個或多個原子，例如碳、氫或氧原子，或雜原子，例如氮、硫或卣素，以此來獲得新的分子化合物。根據本發明，"衍生物"是與參考化合物(蛋白質或肽)類似或具有共同結構基序的任何化合物。另外本定義還包括單獨或與其它化合物一起通過一個或多個化學反應、作為前體或中間產物來合成參考化合物的化合物，以及通過一個或多個化學反應、由所述參考化合物單獨或與其它化合物一M應而形成的化合物。因此，上述"衍生物"定:JC^蓋的化合物包括蛋白質和/或肽的水解物，尤其是胰蛋白酶水解物、水解物組分以及水解物和/或水解物組分的混合物。並且，上面提及的術語"類似物"和"肽或蛋白質衍生物"覆蓋，例如，糖基化或磷酸化的肽或蛋白質或添加化學基團的肽或蛋白質。在本發明的另一個實施方案中，所述感興趣的生物活性食品成分和/或i秀辨食品成分可以^l糖或脂肪酸。有利地，所述誘何食品成分為所述活微生物的氮營養源。優選所述誘仵食品成分選自-Alatal821(包含乳清蛋白水解物，固體，Fonterra(Europe)GmbH:80avenuedelaGrandeArm6e，75017巴黎，法國)；-Vitalarmor950(ArmorProteins,法國)；-其片段、類似物或衍生物；-包含其的蛋白質和/或肽；及_其組合。根據本發明的一個具體實施方案，所述活微生物具有完好或減少的代謝所述感興趣生物活性食品成分的能力。根據本發明，"代謝能力減少"是指在發酵期間感興趣生物活性食品成分的代謝量(因此從培養基中消失)少於或等於該成分初始量(發酵前)的40%。這在數學上可由下式表示Qr，6Qo(1)其中Qr-生物活性食品成分的殘留量(發酵後存在於介質中)，Q0=生物活性食品成分的初始量。可通過高效液相色鐠法(HPLC)串聯質鐠檢測器(MS/MS)的方法測定生物活性食品成分的殘留量。在下面的實施例中提供了實驗方法的一個實例。對於用作活微生物，優選細菌，更優選活乳酸菌。更具體地，活細菌選自-鏈球菌屬(5Vr印toc歐msspp.)，優選嗜熱鏈球菌(5^印toco-乳軒菌屬(￡flcto6a"7/Mssp/;.);-乳球菌屬(Z^"ococcmss早)；和一歡歧桿菌屬(jffiydo6flctef7'w附sp/.)。優選地，活細菌選自-嗜熱鏈球菌，於2002年1月24日在CNCM(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes(PasteurInstitute,巴黎，法國))保藏，編號為1-2774;-嗜熱鏈球菌，於1995年10月24日在CNCM保藏，編號為1-1630;-嗜熱鏈球菌，於2004年5月10日在CNCM保藏，編號為1-3211;-嗜熱鏈球菌，於2004年9月16日在CNCM保藏，編號為1-3301;和-嗜熱鏈球菌，於2004年9月16日在CNCM保藏，編號為K3302。更優選地，所述活細菌是2004年5月10日以編號1-3211在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌。優選地，所述食品至少包含活細菌嗜熱鏈球菌和乳桿菌屬。優選地，所述活嗜熱鏈球菌選自於2002年1月24日以編號1-2774在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌；於1995年10月24日以編號1-1630在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌；於2004年5月10日以編號1-3211在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌；於2004年9月16日以編號1-3301在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌；和於2004年9月16日以編號1-3302在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌。本發明食品中活微生物的含量可以變化，並且將由本領域普通技術人員根據他們對本領域的一般理解來選擇。在實踐中，追求的標準總體含量優選例如是大約107到109個細菌/克食品。優選地，本發明的食品為發酵產品。更優選地，所逸&酵產品為乳製品或植物產品。才艮據本發明，除了乳外，"乳製品"還指來源於乳的產品，例如乳酪、冰淇淋、黃油、乾酪和酸乳；二級產品，例如乳清和酪蛋白；以及包含乳或乳成分作為主要成分的任何製成食品(preparedfood)。除了別的以外，"植物產品，，還指從植物基源所獲得的產品，例如果汁和蔬菜汁，包括豆奶、燕麥汁和大米汁。此外，上述"乳製品，，和"植物產品"的每個定義均覆蓋包含乳製品和植物產品混合物的任何產品，例如乳和果汁的混合物。本發明的另一個目的是一種製備上述所定義食品的方法，其中向構成所述產品的混合物中添加一種或多種誘飾食品成分，優選在其發酵後添加o根據一個實施方案，將一種或多種活微生物和一種或多種感興趣的生物活性食品成分和/或一種或多種誘斜食品成分依次添加到構成所述食品的混合物中。或者，將所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述活微生物和/或所述誘辨食品成分同時添加到所述混合物中。微生物的培養條件取決於所述微生物，並為本領域普通技術人員所是，嗜熱鏈球菌的最佳生長溫度範圍通常在大致36。C到42'C之間；保加利亞乳桿菌(丄.^/^m^^/"/jp.5m&"Wcms)(通常在酸乳中發現)的所述溫度範圍在大致42t:到46。C之間。作為一皿則，當達到期望pH值時，通過快速冷卻來降低微生物的代謝活性而終止發酵。根據本發明的一個具體實施方案，所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述諸斜食品成分直接在構成所述食品的混合物中製備。這被稱為所述生物活性食品成分和/或誘斜成分的"原位合成"。在原位合成的情形下，可平等地預期在所述感興趣生物活性食品成分和/或所述誘飾食品成分的原位合成之前、期間或之後，將所述活微生物添加到構成所述食品的混合物中。本發明的又一個目的是上述此類食品作為功能食品的用途。"功能食品"是指不依賴於其營養作用而有利地影響機體的一或多種目標功能的食品。因此，如果消費者攝入正常量的所述產品，所述功能食品能夠導致改善健康和/或福利(well-being)和/或減少消費者發生疾病的風險。作為功能食品活性的實例，尤其可提到抗癌活性、免疫刺激活性、促進骨癒合活性、減輕壓力活性、阿片樣活性、抗高血壓活性、提高釣生物利用度的活性和抗微生物活性(FunctionalFoodScienceinEurope,1998)。此類功能食品可用於人和/或動物。本發明的再一個目的是，在包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣生物活性食品成分的食品中，使用至少一種誘辨食品成分來保護所迷感興趣的生物活性食品成分免於被所述活微生物代謝的用途。以下列附圖對本發明進行舉例說明，但並不局限於此。圖1:示例在發酵期間Lactium⑧中包含的生物活性aSl91-100肽消失的LC/MS色謙圖。調節MS/MS檢測器使其僅檢測m/z-634.5Da的離子信號(雙電荷aSl[91-100]肽的質量)，其在片段化之後顯示m/z=991.5Da、771.5Da和658.3Da的子離子(aSl[91-100肽的特徵片段)。圖2:在通過由1-2783(在2002年1月24日保藏於CNCM)、1-2774(在2002年1月24日保藏於CNCM)、1-2835(在2002年4月4日保藏於CNCM)和1-1968(在1998年1月14日保藏於CNCM)菌抹混合物組成的發酵劑發酵的乳品"混合物，，發酵前和發酵後，用LC-MS/MS法鑑定和定量Lactium⑧中的主要肽。發酵後，僅發現微量的所述肽，幾乎可與基線混淆。問號(？)是指不能鑑定序列或不確定；然後僅報告肽的質量。圖3:在由HansenYC-380乳酸發酵劑發酵至pH為4.7之前(1)和之後(2),包含1.5g/1DMVC12⑧水解物的乳"混合物"的對比肽圖(LC-MS/MS色諳圖)。幾乎所有的7jc解物肽，包括生物活性C12肽(aSl[23-24j片段)均在由發酵劑菌林代謝後消失。圖4:10。C貯存期間在最終產品中生物活性aSl91-100肽殘留量變化的示意圖，其中最終產品由95%的包含菌林1-2783、1-2774、1-2835和1-1968的發酵劑發酵的物質和5。/。的包含aSl[91-1001肽的調味糖漿組成。試驗由4個獨立測試E1、E2、E3和E4《且成。圖5:發酵產品中發酵後添加的生物活性aSl91-100]肽的殘留量變化示意圖，其中發酵後再將發酵產品在75""C熱處理1分鐘，然後貯存在10。C直至使用期限(UBD)。圖6:10。C貯存直至UBD期間，最終產品中生物活性aSl[91-100肽殘留量變化的示意圖，其中最終產品由95%的包含菌株1-2774和曱酸鹽的發酵劑發酵的物質和5%的包含aSl91-100肽(以Lactium⑧形式提供，在最終產品中含量1.5g/kg)的調味糖漿組成。圖7:在濃度增加(0.5、1.0和1.5g/1)的"誘何，，水解物(Vitalarmor950,ArmorProteins;MPH955,Fonterra)存在時，與未經發酵的對照相比(包含菌林1-2783、1-2774、1-2835和1-1968的發酵劑)，發酵後aSl[91-100肽殘留百分量的示意圖。圖8:作為感興趣成分(Lactium,IX=1.5g/1)和i秀闢成分(Vitalamor950水解物，IX=1.5g/1)的初始量的函數，由包含菌林1-2783、1-2774、1-2835和1-1968的發酵劑發酵之後在乳培養基中aSl[91-100肽殘留量的定量。在閱讀下列僅為示例說明而給出的實施例後，本發明的其它特點和優勢將是顯而易見的。實施例實施例1:不應用本發明，使用感興趣的生物活性食品成分1.1)在Lactium⑧水解物中包含的生物活性ciS1[91-100]肽的實施例在熱處理消毒(即95匸，8分鐘)之前和因此在發酵之前，當製備乳品"混合物"(使乳粉末化)時添加所述活性成分時，使用經常以粉末形式提供的肽或蛋白質成分是更簡單的。在此情況下，活性肽代謝的風險是很高的。例如在使用諸如包含生物活性肽(例如aSl-酪蛋白的91-100片段)的Lactium(Ingredia，法國)功能產品時就是這種情況。實驗方案如下製備培養基將脫脂乳粉水化至120g/1的濃度，補加1.5g/1的Lactium(相當於約30mg/1的生物活性aSl[91-100肽)，然後在95€巴氏消毒8分鐘。按照0.02%的比例添加乳晚發酵劑，然後在選定發酵劑的最優溫度(37-42X:)下進行發酵直至達到pH為4.70。如下使用高效液相色譜(HPLC)串^tt譜檢測器(MS/MS)進行殘留肽尤其是生物活性aSl[91-100肽的分析-將發酵後培養基在水、甲醇和三氟乙酸(50/50/0.1%)的混合物中以大約1:6的比率進行稀釋來製備樣品。離心後，上清液即構成發酵後培養基中肽含量的代表性樣品。一將所述樣品注入Agilent1100HPLC系統(AgilentTechnologies法國，lrueGalvani,91745MassyCedex,法國)，該系統配備適於色i普,，2.1x150mm,WAT056975,WatersFrance,5,rueJacquesMonod,78280Guyancourt)。按照常規方式，採用在溶劑A(水和0.106%曱酸)中增加溶劑B(乙腈和0.100%甲酸)梯度的方法洗脫肽，作為期望解析度的函數，分析時間在40分鐘到2小時。-採用專門的MS/MS檢測器進行檢測，例如用離子阱裝置如Esquire3000+(BrukerDaltonique，ruedel，Industrire，67166WissembourgCedex),可設置為總肽含量分析(MS-MS模式)或由其特徵片段精確和特異性地定量肽。例如依據其質量(質量為634.5Da的雙電荷離子)分離aSl[91-100I肽，並根據片段化後其特徵性子離子(m/z=991.5Da、771.5Da和658.3Da的離子)的強度進行定量。在更為精確的方式中，由相同的雙氘化合成肽(特徵性片段993.5Da)組成的內標使得可以考慮並排除基質中的潛在幹擾物。結果見圖1所示。在其使用的這一階段(由菌林1-2783(在2002年1月24日保藏於CNCM)、1-2774(在2002年1月24日保藏於CNCM)、1-2835(在2002年4月4日保藏於CNCM)和1-1968(在1998年1月14日保藏於CNCM)混合物組成的發酵劑、或諸如YC-380(Chr.HansenSA，LeMoulind，Aulnay,BP64，91292ARPAJONCedex法國)的發酵劑發酵之前)，證明超過95%的生物活性aSl[91-100]肽在發酵後被消耗掉。這些結果表明根據上述實施例摻入生物活性肽並不適於獲得補充肽和/或生物活性蛋白質的食品尤其是乳製品，其中這些肽或蛋白質的補充量在觀察消費者期望的作用期間足夠穩定。1.2)其它感興趣生物活性肽的實施例結果見圖2和3所示。Lactium⑧含有很多其它肽，其中一些表現出潛在生物活性(例如asrJ^"白片段23-24,也由DMVInternational作為C12⑧銷售)。引起關注的是事實上，幾乎所有通過添加Lactium⑧而提供的肽在發酵期間被消耗掉。不管它們的來源(來源於不同的aSl-、aS2-、k-和(3-@§^白)和大小(從2到3個殘基直至12個殘基和更多)，在發酵期間消耗掉了所有的肽。1.3)聯合使用其它發酵劑以及生物活性ds，[91-100]肽(Lactium⑧)為了驗證這種現象並非特異性地針對上述1.1)段中所用的兩種發酵劑，採用相同的檢驗方法檢驗了主要工業發酵劑以及在所述發酵劑組合物中使用的各種純菌林添加1.5g/l量的Lactium至從乳粉復溶的乳，在標準條件(發酵劑的最優溫度在37。C到42'C之間，在pH為4.7時終止發酵，2個重複樣本)下進行發酵。然後對發酵前和發酵後的樣品中生物活性aSl[91-100肽的含量進行分析。在純菌林中獲得的結果提供於下表3中表3tableseeoriginaldocumentpage25上表3反映了在包含1.5g/lLactium⑧的乳混合物發酵期間各種發酵劑和工業菌株對生物活性aSl[91-100肽的消耗，通過它們的CNCM(PasteurInstitute,巴黎，法國)編號和保藏日期識別純菌林。表3表明在標準乳混合物發酵期間所有的酶和受試菌林代謝從94%到100。/。的生物活性(xSl[91-100肽。因此，在常規條件下不可能使用這種產品來生產包含這些肽或生物活性蛋白質的食品尤其是乳製品，其中所述肽或蛋白質的量在消費者中產生作用的時間中足夠穩定。此外，為了！Ht這種現象並非特異性地針對Lactium⑧，對幾種發酵劑和含生物活性肽的其它成分的幾種組合進行相同試驗(復溶的乳和1.5g/l量的受試成分在標準條件下發酵，在pH為4.7時停止發酵，兩個重複樣本)。各種檢驗組合提供於下表4中。表4tableseeoriginaldocumentpage26由DMVInternational生產的C12⑧和CPP⑧成分均為乳蛋白質水解物，它們分別包含耙向控制高血壓和礦物質吸收的生物活性肽。通過所有的試驗，很明顯所有受試發酵劑均具有顯著的代謝肽的能力，而與其性質和大小無關。1.4)發酵後加入另外一種上述研究方法的合理替代是在發酵後引入功能性成分("延遲區分"法)，例如與用於發酵物調味的糖漿一起。根據這一研究方案4吏用相同量的Lactium⑧所導致的結果提供於圖4中。如圖4所示，即使在發酵後低溫冷卻(4匸)加入，但在貯存期間活性肽(以相當於1.5gLactium⑧/kg最終產品來提供)被快速降解，到使用期限(UBD)僅剩餘初始含量的30-40%。因此，在最終產品中的活乳酸菌群在最終產品^存期間繼續代謝生物活性肽，使得在僅僅10天後(新鮮產品的UBD為28天)35-50%的aSl91-100肽消失，這一事實對於在消費者中獲得期望作用是不可接受的。1.5)包含感興趣生物活性食品成分的發酵乳製品的熱處理在此情況下，有可能確保aSl[91-100I肽的穩定性(圖5)，但對最終產品的整體質量不利。事實上這種方案有很多缺點-發酵乳製品的熱處理涉及在熱處理前使用添加穩定劑(果膠、澱粉、角叉膠等)，因而使工藝更複雜，並顯著增加了配方成本；-工業生產線更為複雜，並要求更為顯著的專門投資；-產品不再受益於與含活發酵劑的產品(酸乳)相關的質量標識，實際上將喪失與乳酸發酵劑消費相關的益處；和-感官影響(通常是負面影響)顯著。實施例2:使用感興趣的生物活性食品成分同時應用本發明該策略由以下組成通it^TO!L量的一種或多種肽("誘何"肽)來飽和乳酸菌的蛋白質水解和肽轉移系統，與尋求保護的肽相比，所述一或多種肽更優先^t故壞。在發酵期間和最終產品貯存直至UBD期間均存在保護作用。圖6表示基於前述試驗模型的實例。如圖6所示，與對照相比，Vitalarmor950酪蛋白水解物(ArmorProteins,法國)的存在大大保護了發酵後以Lactium⑧形式供應的aSl191-100肽。用於獲得充分有效保護的誘伴肽的性質和含量的選擇是很重要的。因此，檢驗和評價了很多商品水解物(主要是牛乳蛋白質的酶水解物)，總結於下表5中。表5表示在各種商品水解物(相同濃度1.58/1)存在下，在由包含菌林1-2783、1-2774、1-2835和1-1968的發酵劑發酵期間，生物活性aSl91-100肽(以相當於1.5g/1的Lactium⑧提供)的消耗。表5tableseeoriginaldocumentpage28MPH955:酪蛋白水解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6-14,D-25462,Rellingen,德國Alaco70-14:乳清蛋白水解物，NZMPGmbH,Sie聰nsstrasse6-14,D-25462,Rellingen,德國WPH917:享L清蛋白7K解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6-14,D-25462,Rellingen,德國WPH955:乳清蛋白水解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6-14,D-25462,Rellingen,德國Aria20-21:乳清蛋白水解物，AriaFoodsAmbaIngredients,2rueVictorGriffuelhes,92772BoulogneCedex,法國WPH926:乳清蛋白水解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6-14,D-25462,Rellingen,德國DSE6441:乳清蛋白7JC解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6-14,D-25462,Rellingen,德國WPH948:乳清蛋白水解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6—14,D—25462,Rellingen,德國Biozate1*.乳清蛋白水解物，DaviscoFoodsInternational,11000West78thStreet,Suite210,EdenPrairie,MinnesotaUSA55344MPH910:酪蛋白水解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6—14,D-25462,Rellingen,德國DSE6060:乳清蛋白水解物，NZMPGmbH,Siemensstrasse6-14,D—25462,Rellingen,德國Alatal821:乳清蛋白水解物，NZMPGmbH,Sieraensstrasse6—14,D—25462,Rellingen,德國Vitalarmor950:酪蛋白水解物，ArmorProteins-35460SaintBriceenCogles,法國DMVC12:乳蛋白水解物，DMVInternational,P.O.Box105,RedhillSurreyRHl3YH,英國根據表5，某些水解物僅有極少的作用或沒有作用(即使它們存在，發酵後也僅剩餘百分之幾的(xSl[91-100肽)。在另一方面，另一些則具有良好的保護作用，因為在發酵後可發現有超過50%的aSl[91-100肽存在。誘闢肽的濃度也是一個重要因素如圖7所示，所述濃度越高，對肽的保護作用越強。總之，如圖8所示，感興趣肽和誘辨肽的比率控制對感興趣肽的保護作用是強還是弱。因此所獲得的保護作用並非特異性地針對aSl[91-100肽，而涉及大多數的感興趣肽水解物。因此，可通過謹慎選擇足量供應的誘飾成分來保護具有4艮寬大小範圍的任何類型的肽。參考文獻—Kaysereta工，,(1996)FEBSLetters383,18_20—HataY.et仏,(1996)Am.J，Clin.Nutr.64,767-71—NakamuraY.et(1995)J,DairySci.78,1253—7_Migliore-SamourD.e亡sl.,(1988)Experimentia44,188—93一DefilippiC.etaJ.,(1995〉Nutr.11,751—4一Tom6D.et(1987)Am.J.Physiol.253,G737—44—TomeD.eta_Z.,(1988)Reprod.Nutri.Develop.28,909-18一BenMansourA,etaL,(1988).Pediatr,Res.24,751—5一Mah6S.etsJ.,(1989)Reprod.Nutri.Develop.29,725-32一SchusdziarraV.etaJ.,(1983)Diabetologia24,113-6—YvonM.et(1994)Reprod-Nutri.Develop.34,527—37一ZuchtH.D.et(1995)FEBSLetters372,185-8一TomitaM.et(1994)ActaPaed.Jap.36,585-91_LahovE.et(1996)FoodChem*Toxic.34,131—145一Migliore-SamourD.etal.,(1989)Int.DairyRes.56,357—62一JollesE5.e仁aJ.,(1986)Europ.J.Biochera.158,379—82一RahaS.et{1988>Blood772,172-8一ChabanceB.etaJ,,(1995)Brit.J.Nut.73,582—90一KohmuraM.etaJ,,(1989)Agric.Biol.Chem.53,2107-14—Masuda0.et,,(1996)J.Nutr,126,3063-8一YamamotoN.eta_Z.,(1994)'Biosci.Biotech.Biochem.58,776-8-ErmischA.etaJ.,(1983)J.Neurochem,41,1229—UmbachM.et(1985)Regul.Pept.12,223-30—SinghM.etal.,(1989)Pediatr.Res.26,34-8一SvedbergJ.et<a_Z.,(1985)Peptides6,825—30一TeschemacherH.et(1986)J.DairyRes.53,135—8一YoshikawaM.et(1986)Agric.Biol.Chem，50,2419-21一ChibaH.et(1989)J.DairySci.72,363-BeucherS.et(1994)J-Nutr，Biochem.5,578-84-ParkerF,et(1984)Eur-J.Biochem,45,677-82一OtaniH.et(1992)Milchwiss.47,512-5—OtaniH.et(1995)J.DairyRes.62,339—48-Droueteta_Z.,{1990》Nouv.R'ev.Fr.Hermatol.32,59-62—MullalyM.eta丄.,(1997}工nt,DairyJ.7,299—303一MeiselH.et(1986)FEBSLetters196,223-7一Garaultet(2002)J-Bio'l.Chem.277:32-39一DanoneWorldNewsletterNo.17(September1998)一FunctionalFoodScienceinEurope(1998)BritishJournalofNutrition80(1):SI-S193.權利要求1.一種食品，其包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣的生物活性食品成分，其中所述感興趣的生物活性食品成分通過至少一種包含於所述食品中的誘餌食品成分，以降低所述活微生物對所述感興趣生物活性食品成分的代謝的方式而受到保護。2.根據權利要求l的食品，其中在所述食品中感興趣生物活性食品成分的殘留量，在其製備3周後，是其製備後即刻存在於食品中的感興趣生物活性食品成分的量的約50—100%。3.根據權利要求2的食品，其中所述殘留量是其製備後即刻存在於食品中的感興趣生物活性食品成分的所述量的約80-100%。4.根據權利要求1至3任一項的食品，其中所述食品包含佔最終產品總重量約0.001%至2%重量的誘倂食品成分。5.根據權利要求4的食品，其中所述食品包含佔最終產品總重量約0.001%至0.2%重量的誘何食品成分。6.根據權利要求1至5任一項的食品，其中在所述食品中誘斜食品成分的代謝速率，在其製備3周後至少等於所述感興趣生物活性食品成分的代謝速率。7.根據權利要求1至6任一項的食品，其中所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘斜食品成分選自-蛋白質，-肽，-其類似物或衍生物，及-它們的組合。8.根據權利要求7的食品，其中所述感興趣的生物活性食品成分選自aSl91-100肽、C6-o^194-199肽、C7-卩177-183肽、C12-o^23-34肽、酪蛋白磷酸肽、a-酪啡肽、a-酪蛋白外啡肽、酪激肽、p-酪啡肽、酪蛋白巨肽和糖巨肽、酪新素、casoplatellins、片段50_53、J5-乳嗎啡樣肽、laGtoferroxin、&Val-Pro-Pro、Lys—Val誦Leu國Pro-Va1—Pro誦Gln、Tyr-Lys-Val-Pro國Gln-Leu、Tyr國Pro、Ile畫Pro-Pro、其片段、類似物和衍生物、包含其的蛋白質和/或肽、以及它們的組合。9.根據權利要求8的食品，其中所述感興趣的生物活性食品成分選自aSl[91-1001肽、其片段、類似物和衍生物、包含其的蛋白質和/或肽、以及它們的組合。10.根據權利要求7的食品，其中所述誘何食品成分是所述活微生物的氮營養源。11.根據權利要求10的食品，其中所述誘辨食品成分選自一Alatal821;一Vitalarmor950;-其片段、類似物或衍生物；-包含其的蛋白質和/或肽；和-它們的組合。12.根據權利要求l至ll任一項的食品，其中所述活微生物具有完好或降低的代謝所述感興趣生物活性食品成分的能力。13.根據權利要求1至12任一項的食品，其中所述活微生物為活細菌、優選為活的乳酸細菌。14.根據權利要求13的食品，其中所述活細菌選自-鏈球菌屬(5^e/;toctfccws卿.),優選嗜熱鏈球菌(5^/^C0co/s幼ef歸/Mws);-乳軒菌屬(丄flcto6fl"7/"s);-乳球菌屬(Zflctococcwssp/;.);和-雙歧桿菌屬(說y^Zw"m.M附s/;/7.)。15.根據權利要求14的食品，其中所述食品至少包含活細菌嗜熱鏈球菌和乳桿菌屬。16.才艮據權利要求14或15的食品，其中所述活嗜熱鏈球菌選自-於2002年1月24日在CNCM以編號1-2774保藏的嗜熱鏈球菌；-於1995年10月24日在CNCM以編號1-1630保藏的嗜熱鏈球菌；-於2004年5月10日在CNCM以編號1-3211保藏的嗜熱鏈球菌；-於2004年9月16日在CNCM以編號1-3301保藏的嗜熱鏈球菌；和-於2004年9月16日在CNCM以編號1-3302保藏的嗜熱鏈球菌。17.根據權利要求16的食品，其中所述活細菌為於2004年5月10曰以編號1-3211在CNCM保藏的嗜熱鏈球菌。18.根據權利要求1至17任一項的食品，其中所述食品為發酵產口卩口o19.根據權利要求18的食品，其中所述食品為乳製品或植物產品。20.製備權利要求1至19任一項的食品的方法，其中在其發酵後將所述誘辨食品成分添加到構成所述食品的混合物中。21.製備權利要求1至19任一項的食品的方法，其中將所述活微生物和/或所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘仵食品成分依次添加到構成所述食品的混合物中。22.製備權利要求1至19任一項的食品的方法，其中將所述活微生物和/或所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘何食品成分同時添加到構成所述食品的混合物中。23.製備權利要求1至19任一項的食品的方法，其中在構成所述食品的混合物中直接製備所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘何食品成分。24.根據權利要求23的製備食品的方法，其中在原位合成所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘何食品成分之前，將所述活微生物添加到構成所述食品的混合物中。25.根據權利要求23的製備食品的方法，其中在原位合成所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘飾食品成分期間，將所述活微生物添加到構成所述食品的混合物中。26.根據權利要求23的製備食品的方法，其中在原位合成所述感興趣的生物活性食品成分和/或所述誘何食品成分之後，將所述活微生物添加到構成所述食品的混合物中。27.根據權利要求1至19任一項的食品作為功能食品的用途。28.至少一種誘何食品成分在包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣生物活性食品成分之食品中的用途，用於保護所述感興趣的生物活性食品成分免於被所述活微生物>^謝。全文摘要本發明涉及一種食品，其包含一種或多種活微生物和至少一種感興趣的生物活性食品成分，其中所述感興趣的生物活性食品成分通過下述方式受到保護物理方式，優選所述感興趣的生物活性食品成分被包封；和/或通過至少一種包含於所述食品中的誘餌食品成分，從而降低所述活微生物對它們的代謝。更具體而言，本發明涉及包含活微生物、感興趣的生物活性食品成分和誘餌成分的食品。文檔編號C12R1/46GK101102682SQ200580040616公開日2008年1月9日申請日期2005年10月17日優先權日2004年10月22日發明者克洛艾·貝亞爾,奧利維耶·庫爾松,安妮·皮爾遜,蒂埃裡·聖·丹尼斯申請人:達能日爾維公司