一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌的製作方法

2023-04-24 06:04:36

一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌。所述內生真菌為絲葚黴（Papulospora?sp.）AJ14，已於2014年5月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC?No.9187。通過應用該菌株的菌液，進行杉木苗木栽植前期蘸根和用於杉木林地澆根。本發明涉及的菌株通過接種後植株的磷脅迫試驗，得出菌株的苗高地徑、生物量以及葉綠素含量均較大程度高於對照，表明其對於緩解植株磷脅迫具有較大功用，從而進一步證實得到該株內生真菌能促進杉木在磷脅迫條件下的生長發育。
【專利說明】一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌。
【背景技術】
[0002]植物內生菌的研究始於19世紀末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始於上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。
[0003]前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界範圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[2]。目前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3_4]、具有抗病蟲害的生防菌[5_7]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。
[0004]謝卿媚和黃建河(1985) [8]對杉木內生菌根的形態特徵及菌根真菌的鑑定，主要以杉根皮層組織與內生菌根真菌的共生結構作解剖學分析及以溼篩一傾析法從根際土中獲得的菌絲與厚垣孢子進行觀察。結果表明，根據杉木內生菌根的解剖學分析與根際土壤中厚垣孢子的形態結構特徵，確定杉木內生菌根是屬於泡囊一叢枝型內生菌根(簡稱VA菌根)。進一步研究杉木內生菌根對杉木的生長發育及抗性方面的效應，充分合理的利用內生菌根製劑促進杉木生長的問題，具有重大的經濟價值。特別是在我國南方養分瘠薄的紅壤地區，研究內生菌根增強土 壤中磷素的吸收，是當前南方紅壤地區杉木速生豐產中亟待解決的重要問題。綜上可知，關於杉木的內生真菌方面的研究僅從根部位進行鑑定研究，而對杉木葉部位和莖部位均未涉及內生真菌的研究。此外，有關內生真菌對杉木自身生長的影響研究還存在空白。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在於提供一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌。
[0006]本發明提供的一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌，為絲葚黴iPapulospora sp.)AJ14，已於2014年5月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.9187。
[0007]該菌的分離、純化包括:
A、材料:將採集得到不同年份的杉木根、莖段、葉分成三個部分，用自來水清洗乾淨，分裝到自封袋內，於4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最後一次浸洗後的水盛於滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法[9_11]；
C、接種部位的選擇:葉尖部、葉中部和葉基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個部分；D、接種:將消毒後的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，於28°C恆溫培養箱內培養5— 7天後觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定後純化。
[0008]固體培養:使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白腖5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值
6.4±0.2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接後得到單一菌種的上述的杉木內生真菌；
其無性孢子缺乏，菌絲淡色，產生小的細胞緊結成類菌核結構的球狀，黑色；參照真菌鑑定手冊將其鑑定為絲葚黴屬iPapulospora sp.)。
[0009]上述的一種能緩解磷脅迫的的杉木內生真菌應用菌液的製備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48~72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白腖5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。
[0010]上述的一種能緩解磷脅迫的的杉木內生真菌的應用方法，是應用該菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用於杉木林地澆根。
[0011]上述的一種能緩解磷脅迫的的杉木內生真菌的應用方法，是用9.0X 105cfu/ml菌液，按每株100mL在林地澆 於每株杉木的根際。
[0012]上述的一種能緩解磷脅迫的的杉木內生真菌的應用方法，是應用該菌株的菌液
5.0X105cfu/ml在杉木水培苗栽植前將苗蘸根IOmin。
[0013]本發明涉及的菌株是從杉木植株中分離純化得到的，經接種於杉木組培苗，根據光合作用的各項指標綜合評判，進一步證實其對植株生長具有緩解磷脅迫的的作用，尋找到對促進植株生長的有益的功能內生真菌可應用於生產。通過接種後植株的磷脅迫試驗，得出菌株的苗高地徑、生物量以及葉綠素含量均較大程度高於對照，表明其對於緩解植株磷脅迫具有較大功用，從而進一步證實得到該株內生真菌能促進杉木在磷脅迫條件下的生長發育。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為不同磷脅迫下AJ14菌株對杉木幼苗苗高的影響。
[0015]圖2為不同磷脅迫下AJ14菌株對杉木幼苗地徑的影響。
[0016]圖3為不同磷脅迫下AJ14對杉木幼苗生物量的影響。
[0017]圖4為不同磷脅迫下AJ14對杉木幼苗葉綠素含量的影響。
【具體實施方式】
[0018]一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌，菌種命名為AJ14，分類命名:絲葚黴(.Papulospora sp.)，其保藏編號:CGMCC N0.9187，保藏日期:2014年5月20日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。[0019]I水培繁殖中的應用
取配製好的上述內生真菌的應用菌液，製成5.0X105cfu/ml菌液，在杉木水培苗栽植前蘸根lOmin。可提高植苗成活率10%以上。
[0020]2根際土壤澆施應用
本試驗採用土培盆栽試驗，試驗所用杉木幼苗為福建省林科院提供的杉木組培苗。選擇長勢一致的苗木於2013年5月定植於直徑15cm，高IOcm的塑料盆中。所用土壤是嚴格經過燻蒸消毒的黃心土。經過稱量，每盆放入等量的3kg 土壤。經過兩個月的恢復性生長，連續三天(7月5日、7月6日和7月7日)分別於杉木根際(R)和樹冠(G)施入相同濃度的IOOmL菌液。利用上述試驗獲得的共5個優勢菌種，每種菌液4個重複，用蒸餾水作為空白對照。接種60天後進行各項指標的測定。
[0021]菌液製備:將供試菌株接入50mL的液體培養基，在恆溫振蕩培養箱中經過72h的培養。用無菌生理鹽水按十倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計數板計算菌液濃度配製成5.5X106cfu/mL。
[0022]2.1苗高地徑測定
鋼尺測定苗高，數顯遊標卡尺測定地徑。
[0023]2.4生物量測定
將植株的不同部位分別標號放入已知重量(Wl)的鋁盒中，放入烘箱105°C烘乾半小時(鈍化酶)，在70°C下烘乾，經過IOh後，取出鋁盒放入乾燥箱中冷卻至室溫，稱重後再放入烘箱中，重複測定直至恆重為止。稱得鋁盒和樣品的總重量(W2)，則樣品乾重為W2-W1。
[0024]本試驗中根冠比指標採用植株乾物質的質量比。地面以下，主要是根系，為地下部分；地面以上，主要是莖和葉，為地上部分。
[0025]2.2葉綠素含量測定
葉綠素含量測定參考張憲政(1986) [12]的方法，採用丙酮乙醇提取法。取相近位置葉片，洗淨並吸乾水分後，準確稱取0.1g鮮葉放入小試管中，加混合液(丙酮:乙醇=l:l)10mL蓋塞。在室溫下暗處提取12h後去清液分別在663nm和645nm下測定光吸收值。
[0026]結果計算:
【權利要求】
1.一株能緩解磷脅迫的杉木內生真菌，其特徵在於:所述內生真菌為絲葚黴(Papulospora sp.)AJ14,已於2014年5月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCN0.9187。
2.一種如權利要求1所述的杉木內生真菌的應用菌液，其特徵在於:所述應用菌液的製備方法，是將所述的絲葚黴sp.) AJ14接入液體培養基,搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48~72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白腖5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。
3.—種如權利要求1所述的杉木內生真菌的用途，其 特徵在於:應用該菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用於杉木林地澆根。
【文檔編號】C12N1/14GK104004665SQ201410246079
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月5日 優先權日:2014年6月5日
【發明者】吳承禎, 謝安強, 徐彩瑤, 洪偉, 林勇明 申請人:福建農林大學