快速PCR擴增儀控溫方法與流程
2023-04-24 06:06:26 2
本發明涉及DNA擴增領域，尤其是一種快速PCR擴增儀控溫方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術，它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重複性好、易自動化等突出優點，其原理類似於DNA的體內複製，只是在PCR管中給DNA的體外合成提供一種合適條件。經過多年的發展，這一技術已經非常成熟，現在已經是分子生物學研究和臨床診斷領域中最重要和最常用的技術，PCR擴增儀的出現則使得該技術實現了自動化，並使得PCR技術的應用更加廣泛，例如在診斷遺傳性疾患、檢測臨床標本中病原體的核酸、對法醫標本作遺傳學鑑定，以及分析激活癌基因中的突變情況等方面獲得了廣泛的應用。與此同時，針對不同的應用領域，PCR擴增儀也發展為很多種類型，但PCR擴增儀還面臨著許多挑戰。
現有技術中的PCR擴增儀實現變溫是由半導體製冷片和導熱模塊完成的，通過在導熱模塊中的測溫探頭採集溫度後，通過PID控溫方式直接控溫，導熱模塊溫度達到目標溫度後，保持不變，而PCR管內溶液的升溫有滯後性，並且隨著PCR管內溶液的溫度接近目標溫度內外溫差越來趆小，升溫越來趆慢，每一次升溫或降溫都需要幾十秒，做30個PCR循環需要2.5小時左右，其最大升降溫速率為2-3度/秒，這種升降溫速率會導致完成PCR擴增所需的時間延長，PCR擴增效率低，且還可能使得實驗中雜帶增多，影響實驗結果的準確性；另一方面，在PCR管放入導熱模塊進行傳熱，PCR管無法做到管壁與導熱模塊緊密帖合，兩者之間會有間隙，而空氣的導熱係數很低，同樣的試驗條件，不同PCR管的結果會產生差異，影響實驗結果的準確性。
技術實現要素：
發明目的：針對上述現有技術存在的缺陷，本發明旨在提供一種快速PCR擴增儀控溫方法。
技術方案：一種快速PCR擴增儀控溫方法，包括如下步驟：放入PCR管(25)，設置PCR擴增儀的升降溫參數，升降溫參數包括目標溫度，對PCR管(25)進行升降溫；
升溫時：
(1.1)快速PCR擴增儀殼體(1)內部的風機組件出風，位於風機組件中風筒(6)進風位置的加熱機構啟動加熱，加熱機構加熱的空氣經風筒(6)吹送在殼體(1)內部流動並形成熱循環風場，PCR管(25)在熱循環風場中加熱升溫，當風場中的空氣溫度高於目標溫度，對風場中的空氣溫度進行PID恆溫控制；
(1.2)實時檢測PCR管(25)的溫度；
(1.3)當檢測到的PCR管(25)溫度處於目標溫度與誤差值之差的範圍內，對PCR管(25)進行PID恆溫控制；
降溫時：
(2.1)風機組件出風，並開啟進風門(33)和出風門(34)，殼體(1)外部的冷空氣由進風門(33)進入殼體(1)後被風機組件吹送，在殼體(1)內部流動，再由出風門(34)排出；
(2.2)實時檢測PCR管(25)的溫度；
(2.3)當檢測到的PCR管(25)溫度處於目標溫度與誤差值之和的範圍內，關閉進風門(33)和出風門(34)，對PCR管(25)進行PID恆溫控制。
所述步驟(1.1)中風場中的空氣溫度高於目標溫度5℃-20℃。
所述風場中的空氣溫度由風場中的空氣測溫探頭(35)測得。
所述步驟(1.2)和(2.2)中所述實時檢測PCR管(25)的溫度具體是通過實時檢測模擬樣本的溫度實現，模擬樣本模擬了在PCR管(25)中溶液的熱容，模擬樣本中的模擬探頭(36)實現溫度檢測。
所述放入PCR管(25)具體為將放入的PCR管(25)其軸線方向與殼體(1)的高度方向平行。
根據權利要求1所述的快速PCR擴增儀控溫方法，其特徵在於，所述PCR擴增的升降溫參數還包括恆溫時間。
步驟(1.3)中所述的誤差值為0.1℃—2℃。
步驟(2.2)中所述的誤差值為0.1℃—2℃。
所述風機組件出風的風速不小於3M/S。
當殼體(1)內部溫度達到溫度開關(30)的設定溫度時，溫度開關(30)斷開，切斷供電迴路；當殼體(1)內部溫度達到溫度開關(30)的設定溫度且溫度開關(30)仍不能切斷供電迴路繼續升溫時，溫度保險絲(31)熔斷，切斷供電主迴路。
有益效果：本發明提供的一種雙溫雙控的控溫方法，先以空氣溫度作為參考，升溫時將PCR擴增儀殼體內的空氣溫度控制在一個相對高的水平，降溫時將PCR擴增儀殼體內的空氣溫度控制在一個相對低的水平，目的是使得PCR管內溫度迅速達到設定值，升降溫時，通過PID控溫轉換溫度參考對象，以PCR管溫度作為參考，並對PCR管溫度進行恆溫控制。本發明的方法使得PCR擴增儀升降溫速率更快，有效縮短PCR擴增時間，PCR擴增效率高；能減小實驗中雜帶的出現機率，並且有助於提升實驗結果準確度、安全係數高。本發明的方法還利用在殼體內部形成從下-上-下的熱風循環風場，來進一步提高PCR管的升降溫速率；同時將PCR管的軸線方向與殼體的高度方向平行，使得PCR管的軸線方向與風場平行，相對於PCR管來說，風場變成了平行風場，與現有技術中PCR管的軸線與風場垂直的設計相比，有利於減小對PCR管的風阻，進一步提高了升降溫速率。
附圖說明
圖1是本發明中快速PCR擴增儀的結構示意圖；
圖2是圖1中A處的局部放大圖；
圖3是本發明中快速PCR擴增儀中風筒的安裝示意圖；
圖4是本發明中快速PCR擴增儀中開門組件的結構示意圖；
圖5是圖4的俯視圖；
圖6是本發明中快速PCR擴增儀中開門組件的立體圖；
圖7是本發明中快速PCR擴增儀中快速PCR擴增儀的結構示意圖；
圖8是本發明中快速PCR擴增儀中加熱結構的結構示意圖；
圖9是本發明原理示意圖；
圖10是本發明的實時溫控曲線圖。
具體實施方式
下面通過一個最佳實施例並結合附圖對本技術方案進行詳細說明。
圖1所示，本發明所述的一種快速PCR擴增儀控溫方法所採用的快速PCR擴增儀，如包括殼體1，且該殼體1包括首尾依次相連的第一側板2、第二側板3、第三側板4和第四側板5，而殼體1內部還設有風機組件；該風機組件包括風筒6和隔板7，其中，如圖3所示，風筒6的一端通過軸承8與第一側板2相連，且風筒6的另一端依次通過第三側板4和驅動機構安裝板9連接有第一驅動機構10，該驅動機構安裝板9的設置方便了第一驅動機構10與第三側板4和風筒6的安裝；該隔板7位於殼體1內部的中心位置，且該隔板7與第二側板3之間設有加熱機構11，而加熱機構11位於風筒6的進風位置。
上述第四側板5上設有開口及與該開口配合的開門組件。如圖4、圖5和圖6所示，該開門組件包括機構安裝板12，該機構安裝板12上設有第二驅動機構、垂直滑軌13和傳動機構，且該第二驅動機構包括電機16、同步帶17和同步輪18，而該傳動機構包括驅動杆19、橫向滑軌20和通過銷軸22設置在機構安裝板12上的擺杆21；其中，電機16通過同步輪18與同步帶17傳動相連，橫向滑軌20的一端通過設置在機構安裝板12上的滑塊23與同步帶17傳動相連，橫向滑軌20與設置在機構安裝板12上的滑塊23滑動配合，作直線運動，通過驅動杆19與同步帶17傳動相連，完成了驅動力的傳遞，該橫向滑軌20的一端與驅動杆19相連；擺杆21的一端與驅動杆19傳動相連，具體為：擺杆21上設有C型槽2(1.1)，且驅動杆19上的軸承與C型槽2(1.1)滑動配合，擺杆21的另一端與門擋板14的一端傳動連接，而門擋板14通過滑座1與垂直滑軌13滑動配合，該橫向滑軌20還與PCR管支架安裝板15相連。
上述門擋板14位於PCR管支架安裝板15外側，且該PCR管支架安裝板15上設有PCR管支架24，而該PCR管支架24上還安裝有PCR管25，且該PCR管25的軸線方向與殼體1的高度方向平行。
如圖1和圖2所示，上述第四側板5上設有PCR管蓋板26，該PCR管蓋板26位於上述PCR管25上方，且該PCR管蓋板26的底端設有至少一個鋸齒結構27，當安裝有PCR管25的PCR管支架24進入風場後，PCR管蓋板26正好壓住PCR管25的管蓋，這樣就可以避免受熱過程中PCR管蓋因為PCR管25內溫度升高氣體膨脹而被衝脫，保證了實驗操作過程中的安全可靠性；而在該PCR管蓋板26的底端設置至少一個鋸齒結構27，每個鋸齒結構27對應一個PCR管25，可以增大PCR管蓋板26對PCR管25管蓋的壓力，進一步保證實驗操作過程中的安全可靠性。上述機構安裝板12上還設有位置傳感器28，該位置傳感器28用於採集該開門組件的位置信息，並將該位置信息發送給處理器，以方便調整該開門組件的位置。另外，可採用電機作為第一驅動機構。
如圖7和圖8所示，加熱機構11包括通過支撐螺杆32設置在第二側板3上的至少一組電熱絲29，具體為兩組電熱絲29，且在相鄰兩組電熱絲29之間設有溫度開關30和溫度保險絲31；其中，該溫度開關30的常閉觸點串聯在供電的接觸器線圈迴路中，而該溫度保險絲31串聯在電熱絲29的供電主迴路中。
在本發明所採用的快速PCR擴增儀中風筒6的一端與第一側板相連，且風筒6的另一端通過第三側板4連接有第一驅動機構，與現有技術中將風筒6設置在殼體1外部的設計相比，增強了殼體1的密封效果，減小風筒6的熱容，有助於提高所述快速PCR擴增儀的升降溫速率，能縮短PCR擴增時間和提高PCR擴增效率，還能減小實驗中雜帶的出現機率，有助於提升實驗結果的準確度；加熱機構11設置在隔板7與第二側板3之間，且該加熱機構11位於風筒6的進風位置，當風筒6和加熱機構11工作時，風筒6產生的風能最大限度地將加熱機構11產生的熱量帶走，在很大程度上提高了熱交換的速率，進一步提高了所述快速PCR擴增儀的升降溫速率；另外，加熱機構11位於風筒6的進風位置的設計使得殼體1內部形成了從下-上-下的熱風循環，即在殼體1內部形成了下-上-下的風場；在第四側板5上設有開口及與該開口配合的開門組件，可以實現將安裝在PCR管支架24安裝板上的PCR管支架24自動伸出殼體1和退回殼體1內部的目的，不僅使得所述快速PCR擴增儀能夠實現自動開門、關門動作，而且還方便了PCR管25與PCR管支架24之間的安裝和拆卸，使用十分方便；加熱機構11包括至少一組電熱絲29，且在相鄰兩組電熱絲29之間設有溫度開關和溫度保險絲31；該溫度開關的常閉觸點串聯在供電的接觸器線圈迴路中，而溫度保險絲31串聯在電熱絲29的供電主迴路中；一旦所述快速PCR擴增儀的控制系統失控，達到溫度開關的設定溫度，溫度開關的常閉觸點就會斷開，使得供電的接觸器線圈斷電，切斷供電迴路，達到保護的目的；在更嚴重的情況下，如果該溫度開關的動作仍不能切斷電源，溫度升高到溫度保險絲31的設定溫度時，該溫度保險絲31就會熔斷，切斷電熱絲29的供電主迴路，確保所述快速PCR擴增儀的安全，安全係數高。
如圖9所示，本發明所述的一種快速PCR擴增儀控溫方法，包括如下步驟：
放入PCR管25，具體是將PCR管25放入殼體1內部的PCR管支架24上，使得PCR管25其軸線方向與殼體1的高度方向平行，即PCR管25的軸線方向與風場平行，相對於PCR管25來說，風場變成了平行風場，與現有技術中PCR管25的軸線與風場垂直的設計相比，有利於減小對PCR管25的風阻，進一步提高了升降溫速率，從而縮短了PCR擴增時間、提高了PCR擴增效率，還能進一步減小實驗中雜帶的出現機率，有助於提升實驗結構的準確度。
系統初始化，設置PCR擴增儀的參數，包括目標溫度、恆溫時間等升降溫參數。對PCR管25進行升降溫，升溫則按以下步驟進行：
(1.1)快速PCR擴增儀殼體1內部的風機組件出風，位於風機組件中風筒6進風位置的加熱機構11啟動加熱，加熱機構11加熱的空氣經風筒6吹送在殼體1內部流動並形成熱循環風場，PCR管25由熱循環風場中的空氣進行加熱升溫，當熱循環風場中的空氣測溫探頭(35)測得的空氣溫度高於目標溫度，本實施例中選取空氣溫度高於目標溫度5℃-20℃，對風場中的空氣溫度進行PID恆溫控制。空氣溫度與目標溫度差值過小起不到快速變溫的目的；而差值過大，會帶來超調大、PCR管變形等安全隱患，其既能達到快速變溫的效果且保障安全。空氣溫度由熱循環風場中的空氣測溫探頭35測得。「快速PCR擴增儀殼體1內部的風機組件出風，位於風機組件中風筒6進風位置的加熱機構11啟動加熱」對出風和加熱順序沒有限制，以上出風和加熱可同時進行，也可先後進行，其先後進行的順序也可對換。另外，為了降低殼體1的熱容對風場升降溫過程的影響，在殼體1內側風道部位塗有絕熱塗料。風機組件出風的風速不小於3M/S，本實施例中風速達到6-8M/S。
(1.2)實時檢測PCR管25的溫度，具體是通過實時檢測模擬樣本的溫度實現，模擬樣本模擬了在PCR管25中溶液的熱容，模擬樣本中的模擬探頭36實現溫度檢測，本實施例中的模擬樣本模擬了在PCR管25中20μL溶液的熱容，相當於在PCR管25中加入20μL被試樣品，這時模擬探頭36採集的溫度接近真實樣品內的溫度，若實際操作時模擬樣本中的溶液大於20μL，則設定的PCR管25恆溫時間需相應的延長；
(1.3)當檢測到的PCR管25溫度處於目標溫度與誤差值之差的範圍內，控制系統對PCR管25進行PID恆溫控制，誤差值在0.1℃—2℃範圍內，本實施例中誤差值為1℃，本發明中所述PID恆溫控制均為現有技術，具體是利用MCU通過溫度傳感器反饋回來的溫度與實際被控溫度之間的差值，計算並輸出相應PWM脈衝寬度調製波，並且不停地調整加熱佔空比，從而實現對系統的恆溫控制。
若需降溫則按以下步驟進行：
(2.1)風機組件出風，並開啟進風門33和出風門34，殼體1外部的冷氣由進風門33進入殼體1後被風機組件吹送，在殼體1內部流動，再由出風門34排出，如圖中所示，距離風筒6較近、在風場中處於下端位置的風門即進風門33，距離風筒6較遠、在風場中處於上端位置的風門即出風門34；
(2.2)實時檢測PCR管25的溫度，具體是通過實時檢測模擬樣本的溫度實現，模擬樣本模擬了在PCR管25中溶液的熱容，模擬樣本中的模擬探頭36實現溫度檢測；
(2.3)當檢測到的PCR管25溫度處於目標溫度與誤差值之和的範圍內，關閉進風門33和出風門34，誤差值在0.1℃—2℃範圍內，本實施例中誤差值為1℃。
系統工作的整個過程中，為了確保安全，當PCR擴增儀在控溫失控狀態下，腔內的溫度達到溫度開關(30)的設定溫度時，溫度開關(30)斷開，切斷供電迴路，達到保護的目的；在更嚴重的情況下，當腔內的溫度達到溫度開關(30)的設定溫度且溫度開關(30)仍不能切斷供電迴路繼續升溫時，溫度保險絲(31)熔斷，切斷供電主迴路，確保所述快速PCR擴增儀的安全。
如圖10所示，以具體實施例說明本發明實現的雙溫雙控的控溫方法。本實施例控制溶液的容量為20ul，實驗的環境溫度為25℃，圖中虛線表示空氣的實時溫度，實線表示模擬探頭測得的PCR管實時溫度。
本實施例設定的「高溫」和「低溫」目標溫度分別是92℃和55℃。實驗儀器要求控制空氣的最高溫度不能超過120℃，否則有損壞儀器的危險。其原理在於：首先將空氣溫度控制在高於目標溫度20℃附近，此時PID恆溫控制的對象是空氣溫度。當模擬探頭的溫度小於目標溫度1℃時，PID恆溫控制轉換對象為模擬探頭溫度，並將模擬探頭溫度控制在目標溫度附近。
首先PCR擴增儀加熱，風機組件出風，熱循環風場使得空氣升溫，PCR管25通過空氣加熱升溫，當風場中的空氣測溫探頭35測得的空氣溫度比「高溫」目標溫度92℃高20℃時，對風場中的空氣溫度進行PID恆溫控制，即控制空氣的溫度保持在112℃左右持續，當模擬PCR管的模擬樣本中的模擬探頭36檢測的溫度比「高溫」目標溫度92℃低1℃時，轉換PID恆溫控制對象為模擬探頭溫度，並將模擬探頭溫度控制在「高溫」目標溫度92℃左右持續，持續時間為設定的恆溫時間。進入下一個「低溫」目標溫度55℃降溫溫控過程，此過程需要將模擬探頭溫度從92℃降至55℃，這個控制過程是關閉加熱機構，風機組件出風，並開啟進風門(33)和出風門(34)，殼體1外部的冷空氣由進風門33進入殼體1後被風機組件吹送，在殼體(1)內部流動，再由出風門34排出，通過PCR擴增儀外部空氣降溫，當模擬探頭測得的溫度降至比「低溫」目標溫度55℃高1℃時，關閉進風門33和出風門34，PID恆溫控制模擬探頭溫度保持在55℃，之所以提前控制模擬探頭測的溫度是避免模擬探頭溫度曲線產生過衝；控制PCR模擬探頭溫度在55℃持續設定的恆溫時間後該過程結束。後續如果還需升溫或者降溫，按照前述的升降溫進行雙溫雙控。
以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出：對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。