檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器及其應用的製作方法

2023-04-23 21:45:46

專利名稱：檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種牛奶樣品中檢測結核桿菌的方法，具體涉及一種針對結核桿菌進 行快速、準確的納米結構的酶免疫傳感器電化學檢測的方法。
背景技術：
牛奶是人類主要蛋白質和其它營養素的重要來源，但是它們在生產、運輸和加工 過程中易受到病原菌的汙染，尤其是結核分枝桿菌。有研究發現分別從尼泊爾、西班牙和巴 西的市售牛奶、生牛奶、牛肺組織和某些起淋巴結組織中檢測出牛型結核分枝桿菌等多種 分枝桿菌。參見 Vijay 等，J Vet Med Sci. ,69,819(2007) ；Guti6rre 等，Vet Herit.，29， 41(2006) ；Clarice 等，Mem InstOswaldo Cruz, Rio de Janeiro.，98，319 Q003)。還有文 獻表明，一般的巴氏消毒和瞬間高溫消毒不能徹底殺滅結核分枝桿菌。參見Cvetnic Z等， Int JTuberc Lung Dis.，11，652 Q007)。人類食用這些被結核桿菌汙染的牛奶可導致肺外 結核，臨床上的大部分肺外結核患者是因為食用或飲用被結核桿菌汙染的牛奶或其它食物。近年來，由於耐藥菌株的出現，結核病患者的臨床治療效果下降。所以，針對這類疾病 的預防除了接種疫苗外，更重要的是切斷傳染源，減少病原菌的接觸機會，故必需加強結核 桿菌的檢測，特別是加強對牛奶這類易被結核桿菌汙染的食品的檢測。這對於食品安全具 有非常重要的衛生學意義。傳統檢測結核桿菌菌的方法是塗片鏡檢和細菌培養。塗片鏡檢簡單，但是檢出率 很低；另外，雖然結核桿菌培養是結核桿菌檢驗的標準方法，但是由於結核桿菌生長緩慢， 生長一代需要10-20小時，所以細菌培養檢測需要1-2個月，這種培養耗時、費力。隨著分 子生物學技術的發展，目前用於結核桿菌檢測的方法還有基因晶片技術、PCR技術等。雖然 這些方法提高了結核桿菌檢測的靈敏度和準確度，而且檢測時間縮短了，由原來的1-2個 月縮短到現在的數天或數小時。但是，這些方法需要一個純培養樣本，而且在測檢過程要使 用到難保存的Taq聚合酶或其它DNA聚合酶，並且技術難度大，操作者需要經過專門培訓， 大規模推廣很困難。因此，急需開發靈敏度和準確度高、操作簡單、能快速檢測結核桿菌的 新方法。納米結構的生物免疫傳感器是近年發展起來的一門前沿性、交叉性的新興技術。 傳感技術與特異性免疫反應結合起來在檢測蛋白質和核酸方面有著非常高的靈敏度。納米 材料的引入使得傳感技術的靈敏度進一步提高。生物傳感器將生物樣品固定在電極表面， 將生物的相互作用轉化為電信號達到檢測生物活動的目的。殼聚糖作為一種多聚體，有很 好的成膜特性，對水高通透性，無毒性和生物相容性，是很好的固定抗體、酶等蛋白在電極 表面的材料。納米金摻入到修飾電極表面的成膜材料中，不但有利於電子通過起到提高靈 敏度的作用，還有助於保持電極表面蛋白質的生物活性而延長電極的保存時間。

發明內容
本發明的任務是提供一種檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器，使其具有快速、簡單、準確檢測結核桿菌的特點，以克服現有結核桿菌檢測方法需時太長、準確型 低、操作步驟繁瑣的不足。實現本發明的技術方案是本發明提供的這種檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器，由玻碳電極、 位於該玻碳電極表面的鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金修飾膜和固定在該修飾 膜表面的結核桿菌單克隆鼠抗體構成。本發明提供的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器的製備方法，包括以 下步驟步驟一取玻碳電極(Φ = 3mm)用0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化鋁粉拋光成鏡面，超聲 波清洗3min後三蒸水衝洗，在piranha溶液(30% H2A H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然 後分別用三蒸水和乙醇超聲波清洗三次；步驟二 將經拋光清潔處理過的玻碳電極插入0. lmg/mL鹼性磷酸酶標記的羊抗 鼠抗體(羊抗鼠IgG-ALP)、0. 5%殼聚糖溶液和0. SnM納米金(粒徑15nm)混合溶液中，於 三電極系統下給予電壓恆壓+3. OV下電沉積修飾5分鐘，電極取出後分別用2mL的高純水 衝洗三次，即製得鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電極(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)；步驟三將步驟二製得的鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻 碳電極插入含有0. lmg/mL的結核桿菌單克隆鼠抗體磷酸緩衝溶液中，於4°C浸泡10小時， 取出後用2mLPH為7. 4濃度為0. OlM磷酸鹽緩衝液衝洗電極表面三次，即得到本發明提供 的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)， 4°C儲存備用。應用本發明提供的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器檢測牛奶中結 核桿菌的方法包括以下步驟步驟一按以下步驟(a)或(b)對待檢測牛奶樣本進行前處理(a)取IOml待檢測牛奶樣品1900g離心20min，棄上清液，加入PH為7. 4濃度為 0. OlM的PBS液5ml混勻，1900g離心IOmin,棄上清液，往沉澱物中加入0. 5mlPBS,混勻備； 或(b)對牛奶樣本進行增菌培養，具體步驟為10ml牛奶樣品1900g離心20min，棄 上清液，加入IOml Middledbrook7H9培養液，37°C，厭氧件條件下培養1_2天。然後1900g 離心20min,棄上清液，加入PH為7. 4濃度為0. OlM的PBS液5ml，混勻，1900g離心IOmin, 棄上清液，往沉澱物中加入0. 5mlPBS，混勻備用；步驟二 按權利要求2所述方法製備本發明提供的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米 金酶免疫傳感器；步驟三標準結核桿菌液的製備選用具有免疫原性減毒活牛分支桿菌製備而來 的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)經 Middledbrook7H9 培養液，37°C，厭氧條件 下培養，充分混勻以0.01M磷酸鹽緩衝液PBS(pH = 7.4)為稀釋液進行1 10的倍比稀釋， 再接種於羅氏斜面培養基，計算出菌落數，調整PBS對Middledbr00k7H9培養液中BCG菌稀 釋度，分別配製從IO2 IO7CfVmL之間不同濃度的結核桿菌BCG的PBS混懸液；步驟四測試本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)的初始電流值I。；步驟五將本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器(TB鼠抗 /羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)分別與前述步驟製備的不同濃度結核桿菌BCG的PBS懸浮液 和待測樣品的PBS懸浮液在37°C培育30分鐘；然後，測試孵育後的電極的電流值Ip ；步驟六用I0減去Ip獲得電流改變差值Δ I，以不同濃度結核桿菌BCG的PBS懸 浮液與本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器反應前和反應後引起 的電流值改變△ I繪製標準曲線，依標準曲線及待測樣品的PBS懸浮液△ I即得出待測樣 本中結核桿菌的濃度。以上步驟四所述的測試本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳 感器(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)的初始電流值Itj的具體方法是以本發明製備 的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極和 鉬絲為輔助電極構成的三電極系統，5mM α -萘磷酸的PH為8的Tris-HCl緩衝液為測試工 作液，用差分脈衝法掃描測定電流，掃描條件為起始電壓0V、終止電壓0. 6V、幅度0. 05V ；記 錄在+300mv左右產生的氧化峰，以此氧化峰的電流值為本發明製備的檢測結核桿菌的殼 聚糖-納米金酶免疫傳感器的初始電流值I—以上步驟五所述的測試孵育後的電極的電流值Ip的具體方法是將孵育後的電極 在與上述相同的測試工作液和測試條件下，差分脈衝伏安法掃描，記錄在+300mv左右產生 的氧化峰電流值IP。本發明用殼聚糖凝膠、納米金溶液和鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠混合溶液經電化學 沉積的方法修飾玻碳電極表面而形成納米結構的敏感膜，再利用抗原抗體特異性反應將結 核桿菌單克隆鼠抗體固定在鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電極 表面，製備成本發明用於檢測結核桿菌的酶免疫傳感器。通過差分脈衝伏安法測定修飾好 的電極TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC與不同濃度結核桿菌懸浮液孵育反應前和後， 電極插入含鹼性磷酸酶的底物萘磷酸的測試工作液中，電極表面納米敏感膜中的鹼性磷酸 酶即可催化底物α -萘磷酸，其產生的水解產物在差分脈衝伏安法掃描下氧化峰電流改變 量的大小與結核桿菌濃度相關，採用結核桿菌減毒株卡介苗(BCG)繪製標準曲線，從而可 實現對被測物樣品中結核桿菌的快速、準確檢測。整個檢測過程可在1小時之內完成。本發明製備的殼聚糖-納米金的酶免疫傳感器製備方法簡單，利用殼聚糖作為載 體承載酶標抗體來固定結核桿菌抗體保持了抗體的生物活性；結核桿菌單克隆抗體特異性 的識別結核桿菌保證了檢測的特異性；電極修飾過程中納米金的摻入增強了保持抗體活性 的持久性，並且在電化學方法的檢測中納米金有利於電子的傳導而獲得很高的靈敏度。該方法結合了免疫反應的高特異性、快速的特點和納米結構敏感膜對電信號放大 作用(即高敏感性)，簡化了檢測步驟、縮短了檢測時間、提高了方法的敏感度。與抗酸染色 法相比，本法結合了納米結構膜的高敏感性和結核桿菌抗體的高特異性，可以提高檢測方 法的敏感性以及減小假陽性現象；本法不需要對待測牛奶樣品進行特殊處理，極大的縮短 了檢測的時間，與聚合酶鏈反應(PCR)等方法相比，操作更簡單、步驟更少、耗時更省，檢測 快速、準確。


圖1為殼聚糖-納米金的酶免疫電極的修飾過程和對結核桿菌的識別的原理示意 圖。圖2為殼聚糖-納米金-酶免疫電極TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分別與 不同濃度的結核桿菌BCG 37°C培育30min後在含有5mM α -萘磷酸的為PH為8的Tris-HCl 緩衝液工作液中的差分脈衝伏安法圖0cfu/mL(曲線a)、103Cfu/mL(曲線b)、5X 103cfu/ mL(曲線 c)、104cfu/mL(曲線 d)、5X 104cfu/mL(曲線 d)、105cfu/mL(曲線 f)。嵌入圖為殼 聚糖-納米金-酶免疫電極對結核桿菌BCG不同濃度響應值的對數校正曲線。
具體實施例方式實施例1利用殼聚糖-納米金-酶免疫傳感器來快速、準確的檢測牛奶中結核桿菌1、牛奶樣本前處理研究本法對牛奶樣本勿需特殊處理，操作簡單，IOml牛奶樣品1，900g離心20min，棄上 清液，加入PH為7. 4濃度為0. OlM的PBS液5ml混勻，1，900g離心lOmin，棄上清液，往沉 澱物中加入0. 5mlPBS，混勻備用即可。如為提高檢出率，可對牛奶樣本進行增菌培養，具體步驟為10ml牛奶樣品 1，900g離心20min，棄上清液，加入IOml Middledbrook7H9培養液，37°C，厭氧件條件下培 養1-2天。然後，1，900g離心20min，棄上清液，加入PH為7. 4濃度為0. OlM的PBS液5ml， 混勻，1，900g離心lOmin，棄上清液，往沉澱物中加入0. 5mlPBS，混勻備用。2、殼聚糖-納米金的酶免疫電極的製備(1)玻碳電極的預處理玻碳電極(Φ = 3mm)在修飾前經O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧 化鋁粉拋光成鏡面，超聲波清洗3min後三蒸水衝洗，在piranha溶液(30% H2O2 H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然後分別用三蒸水和乙醇超聲波清洗三次。(2)製備鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電極(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)將處理好清潔的玻碳電極插入5mL含0. 2mg/mL羊抗鼠IgG-ALPjP 0.8nM納米金(粒徑15nm)的0. 5%殼聚糖溶液中。以該電極為工作電極、飽和甘汞電極為 參比電極和鉬絲電極為輔助電極構成的三電極系統下，利用電化學工作站的恆壓法給予電 壓+3. OV下電沉積修飾5分鐘，此步修飾好後的玻碳電極為羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC，取出 後用2ml高純水衝洗3次。(3)固定結核桿菌單克隆鼠抗體在鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜 修飾的電極上(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)將5uL濃度為0. lmg/mL的結核杆 菌單克隆鼠抗體溶液(用PH為7.4濃度為0. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋)滴加於電極羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC表面，置37°C溼盒lh，取出後用2mLPH為7. 4濃度為0. OlM磷酸鹽緩衝 液衝洗3次，以衝掉結合不穩定的抗體，4°C儲存備用。3、標準結核桿菌液的製備選用具有免疫原性減毒活牛分支桿菌製備而來的卡介苗 (BaciIlusCalmette-Guerin, BCG)經 Middledbrook7H9 培養液，37°C，厭氧條件下培養，充 分混勻以0. OlM磷酸鹽緩衝液PBS (pH = 7. 4)為稀釋液進行1 10的倍比稀釋，再接種於羅氏斜面培養基，計算出菌落數。調整PBS對Middledbr00k7H9培養液中BCG菌稀釋度，分 別配製從IO2 107Cfu/mL之間不同濃度的結核桿菌BCG的PBS混懸液。4、測試方法(1)測試殼聚糖-納米金的酶免疫電極(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)初 始電流值I。以TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極 和鉬絲為輔助電極構成的三電極系統，5mM α -萘磷酸的PH為8的Tris-HCl緩衝液為測試 工作液，用差分脈衝法掃描測定電流，掃描條件為起始電壓0V、終止電壓0. 6V、幅度0. 05V。 TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC上的鹼性磷酸酶(ALP)可以催化測試工作液中的α -萘 磷酸產生的水解產物在+300mv左右產生氧化峰，記錄下此氧化峰的電流為測定結核桿菌 前的初始電流值I—(2) TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC對結核桿菌的識別利用以結核桿菌細胞 壁抗原為免疫原的結核桿菌抗體對結核桿菌具有高特異性的識別能力這一特性，將TB鼠 抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分別與不同濃度結核桿菌BCG的PBS懸浮液和待測樣品的 PBS懸浮液在37°C培育30分鐘，孵育後的電極為TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC。(3)測試殼聚糖-納米金的酶免疫電極與結核桿菌孵育後TB/TB鼠抗/羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC的電流值Ip :TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC在上述測試工作液 和測試條件下，差分脈衝伏安法掃描測得Ip值。由於結核桿菌即與結核桿菌抗體結合，使 得電極表面膜的厚度增加，阻礙電子通過達到電極表面，電極納米結構膜中的鹼性磷酸酶 催化底物α -萘磷酸產生的水解產物在+300mv左右產生氧化峰電流減小。(4)計算殼聚糖-納米金的酶免疫電極與結核桿菌反應前和後電流值的改變，並 繪製標準曲線獲得待檢樣品結核桿菌濃度用Itj減去Ip獲得電流改變差值ΔΙ，ΔΙ改變 的大小與結核桿菌濃度相關，由此以不同濃度的結核桿菌BCG與TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/ Ch/Au/GC反應前和後引起的電流值改變△ I繪製標準曲線，從而可計算得出待測樣本中結 核桿菌的濃度。實施例2利用殼聚糖-納米金-酶免疫傳感器來快速、準確的檢測混合細菌體系(同時含 有大腸桿菌和結核桿菌)中的結核桿菌1、含混合細菌的牛奶樣本的製備取IOmL滅菌消毒處理過的牛奶樣品，1，900g離 心20min，棄上清液，然後加入含濃度為103Cfu/mL結核桿菌和107cfu/mL大腸桿菌PH為 7. 4濃度為0. OlM的PBS懸浮液5mL混勻，1，900g離心lOmin，棄上清液，往沉澱物中加入 0. 5mlPBS，混勻備用即可。2、殼聚糖-納米金的酶免疫電極的製備(1)玻碳電極的預處理玻碳電極(Φ = 3mm)在修飾前經O. 3 μ m、0. 05 μ m的氧 化鋁粉拋光成鏡面，超聲波清洗3min後三蒸水衝洗，在piranha溶液(30% H2O2 H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然後分別用三蒸水和乙醇超聲波清洗三次。(2)製備鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電極(羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC)將處理好清潔的玻碳電極插入5mL含0. 2mg/mL羊抗鼠IgG-ALPjP 0.8nM納米金(粒徑15nm)的0. 5%殼聚糖溶液中。以該電極為工作電極、飽和甘汞電極為 參比電極和鉬絲電極為輔助電極構成的三電極系統下，利用電化學工作站的恆壓法給予電壓+3. OV下電沉積修飾5分鐘，此步修飾好後的玻碳電極為羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC，取出 後用2ml高純水衝洗3次。(3)固定結核桿菌單克隆鼠抗體在鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜 修飾的電極上(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)將5uL濃度為0. lmg/mL的結核杆 菌單克隆鼠抗體溶液(用PH為7. 4濃度為0. OlM磷酸鹽緩衝液稀釋)滴加於電極羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC表面，置37°C溼盒lh，取出後用2mLPH為7. 4濃度為0. OlM磷酸鹽緩衝 液衝洗3次，以衝掉結合不穩定的抗體，4°C儲存備用。3、標準結核桿菌液的製備選用具有免疫原性減毒活牛分支桿菌製備而來的卡介苗 (BaciIlusCalmette-Guerin, BCG)經 Middledbrook7H9 培養液，37°C，厭氧條件下培養，充 分混勻以0. OlM磷酸鹽緩衝液PBS (pH = 7. 4)為稀釋液進行1 10的倍比稀釋，再接種於 羅氏斜面培養基，計算出菌落數。調整PBS對Middledbr00k7H9培養液中BCG菌稀釋度，分 別配製從IO2 IO7CfVmL之間不同濃度的菌液。4、測試方法(1)測試殼聚糖-納米金的酶免疫電極(TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC)初 始電流值I。以TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC為工作電極、飽和甘汞電極為參比電極 和鉬絲為輔助電極構成的三電極系統，5mM α -萘磷酸的PH為8的Tris-HCl緩衝液為測試 工作液，用差分脈衝法掃描測定電流，掃描條件為起始電壓0V、終止電壓0. 6V、幅度0. 05V。 TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC上的鹼性磷酸酶(ALP)可以催化測試工作液中的α -萘 磷酸產生的水解產物在+300mv左右產生氧化峰，記錄下此氧化峰的電流為測定結核桿菌 前的初始電流值I—(2) TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC對結核桿菌的識別利用以結核桿菌細胞 壁抗原為免疫原的結核桿菌抗體對結核桿菌具有高特異性的識別能力這一特性，將TB鼠 抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC分別與不同濃度結核桿菌BCG的PBS懸浮液和待測樣品的 PBS懸浮液在37°C培育30分鐘，孵育後的電極為TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC。(3)測試殼聚糖-納米金的酶免疫電極與結核桿菌孵育後TB/TB鼠抗/羊抗鼠 IgG-ALP/Ch/Au/GC的電流值Ip :TB/TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/Ch/Au/GC在上述測試工作液 和測試條件下，差分脈衝伏安法掃描測得Ip值。由於結核桿菌即與結核桿菌抗體結合，使 得電極表面膜的厚度增加，阻礙電子通過達到電極表面，電極納米結構膜中的鹼性磷酸酶 催化底物α -萘磷酸產生的水解產物在+300mv左右產生氧化峰電流減小。(4)計算殼聚糖-納米金的酶免疫電極與結核桿菌反應前和後電流值的改變，並 繪製標準曲線獲得待檢樣品結核桿菌濃度用Itj減去Ip獲得電流改變差值ΔΙ，ΔΙ改變 的大小與結核桿菌濃度相關，由此以不同濃度的結核桿菌BCG與TB鼠抗/羊抗鼠IgG-ALP/ Ch/Au/GC反應前和後引起的電流值改變△ I繪製標準曲線，從而可計算得出待測樣本中結 核桿菌的濃度。結果表明在有大腸桿菌的幹擾下，仍然可以準確的檢出結核桿菌的濃度，說明此 方法對結核桿菌的識別是高特異的。
權利要求
1.一種檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器，其特徵在於，它由玻碳電極、位 於該玻碳電極表面的鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金修飾膜和固定在該修飾膜 表面的結核桿菌單克隆鼠抗體構成。
2.一種檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器的製備方法，包括以下步驟步驟一取玻碳電極(Φ = 3mm)用0. 3 μ m、0. 05 μ m的氧化鋁粉拋光成鏡面，超聲波清洗:3min後三蒸水衝洗，在piranha溶液(30% H2A H2SO4 = 3 7)中浸泡lOmin，然後分 別用三蒸水和乙醇超聲波清洗三次；步驟二 將經拋光清潔處理過的玻碳電極插入0. lmg/mL鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠抗 體(羊抗鼠IgG-ALP)、0. 5%殼聚糖溶液和0. 8nM納米金(粒徑15nm)混合溶液中，於三電 極系統下給予電壓恆壓+3. OV下電沉積修飾5分鐘，電極取出後分別用2mL的高純水衝洗 三次，即製得鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電極；步驟三將步驟二製得的鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電 極插入含有0. lmg/mL的結核桿菌單克隆鼠抗體磷酸緩衝溶液中，於4°C浸泡10小時，取出 後用2mLPH為7. 4濃度為0. OlM磷酸鹽緩衝液衝洗電極表面三次，即得到本發明提供的檢 測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器，4°C儲存備用。
3.—種檢測牛奶中結核桿菌的方法，包括以下步驟步驟一按以下步驟(a)或(b)對待檢測牛奶樣本進行前處理(a)取IOml待檢測牛奶樣品1900g離心20min,棄上清液，加入PH為7.4濃度為0. OlM 的PBS液5ml混勻，1900g離心lOmin，棄上清液，往沉澱物中加入0. 5mlPBS,混勻備；(b)對牛奶樣本進行增菌培養，具體步驟為10ml牛奶樣品1900g離心20min，棄上清 液，加入IOml Middledbrook7H9培養液，37°C，厭氧件條件下培養1_2天。然後1900g離心 20min，棄上清液，加入PH為7. 4濃度為0. OlM的PBS液5ml，混勻，1900g離心IOmin,棄上 清液，往沉澱物中加入0. 5mlPBS，混勻備用；步驟二 按權利要求2所述方法製備本發明提供的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶 免疫傳感器；步驟三標準結核桿菌液的製備選用具有免疫原性減毒活牛分支桿菌製備而來的卡 介苗，經Middledbr00k7H9培養液，37°C，厭氧條件下培養，充分混勻以0. OlM磷酸鹽緩衝液 PBS為稀釋液進行1 10的倍比稀釋，再接種於羅氏斜面培養基，計算出菌落數，調整PBS 對Middledbrook7H9培養液中BCG菌稀釋度，分別配製從IO2 107cfu/mL之間不同濃度的 結核桿菌BCG的PBS混懸液；步驟四測試本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器的初始電流 值I0;步驟五將本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器分別與前述步 驟製備的不同濃度結核桿菌BCG的PBS懸浮液和待測樣品的PBS懸浮液在37°C培育30分 鍾，然後，測試孵育後的電極的電流值Ip ；步驟六用Itj減去Ip獲得電流改變差值Δ I，以不同濃度結核桿菌BCG的PBS懸浮液 與本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器反應前和反應後引起的電 流值改變△ I繪製標準曲線，依標準曲線及待測樣品的PBS懸浮液△ I即得出待測樣本中 結核桿菌的濃度。
4.根據權利要求3所述的檢測牛奶中結核桿菌的方法，其特徵在於，步驟四所述的 測試本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器的初始電流值Itj的具 體方法是以本發明製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器為工作電極、飽 和甘汞電極為參比電極和鉬絲為輔助電極構成的三電極系統，5mMa-萘磷酸的PH為8的 Tris-HCl緩衝液為測試工作液，用差分脈衝法掃描測定電流，掃描條件為起始電壓0V、終 止電壓0. 6V、幅度0. 05V ；記錄在+300mv左右產生的氧化峰，以此氧化峰的電流值為本發明 製備的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器的初始電流值、。
5.根據權利要求3所述的檢測牛奶中結核桿菌的方法，其特徵在於，步驟五所述的測 試孵育後的電極的電流值IP的具體方法是將孵育後的電極在權利要求4所述的測試工作 液和測試條件下，差分脈衝伏安法掃描，記錄在+300mv左右產生的氧化峰電流值IP。
6.權利要求1所述的檢測結核桿菌的殼聚糖-納米金酶免疫傳感器用於檢測牛奶中的 結核桿菌。
全文摘要
本發明是一種基於殼聚糖和納米金的酶免疫傳感器，利用結核分支桿菌細胞壁的單克隆抗體能特異的結合結核桿菌，可用於快速檢測牛奶中結核桿菌。其特點是用殼聚糖凝膠、納米金溶液和鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠抗體混合溶液經電化學沉積法來修飾玻碳電極表面，再利用抗原抗體特異性反應將結核桿菌單克隆鼠抗體固定在鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠-殼聚糖-納米金膜修飾的玻碳電極表面，製備用於檢測結核桿菌的酶免疫傳感器。通過差分脈衝伏安法測定修飾好的電極與結核桿菌孵育反應前後引起的電信號改變進行定量分析。該傳感器製備方法簡單，具有靈敏度高、檢測時間短，操作簡單等優點，是一種可快速檢測結核桿菌的方法。
文檔編號G01N33/535GK102087283SQ20091027309
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月8日 優先權日2009年12月8日
發明者夏緯, 徐順清, 李媛媛, 許冰 申請人:華中科技大學